способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животного

Формула изобретения

Способ определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека или животного, включающий сорбцию исследуемого материала фиксированной на носителе иммунной сывороткой и учет результатов реакции по образованию иммунного комплекса антиген - антитело, отличающийся тем, что в качестве носителя используют магноиммуносорбенты, сорбцию осуществляют перемешиванием магноиммуносорбентов с исследуемым материалом в течение 1-2 ч при 18-24^oС и ведут учет количественных результатов реакции в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками, одномоментно определяют общие антигены к нескольким видам бактерий без предварительного концентрирования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в анализе и при производстве антигенных препаратов из органов человека или животного, а также при разработке тест-систем для диагностики особо опасных инфекций (ООИ).

Известен способ определения гетерогенных антигенов бактерий, сходных с группой АВО человека, заключающийся в выращивании бактерий, добавлении в их взвесь 1,5-2,0 гемагглютинирующей дозы соответствующей антиэритроцитарной сыворотки, инкубации смеси 15-20 мин при комнатной температуре, добавлении соответствующей группы эритроцитов человека и определении количества гетерогенных антигенов по отсутствию агглютинации [А. с. СССР N 1337102, А 61 К 39/02, on. 15.09.87, Бюл. N 34 ]. Способ недостаточно специфичен и чувствителен при низком содержании гетерогенных антигенов в крови человека.

Известен способ одновременного определения 2-х антигенов или антител в одном опыте иммуноферментного анализа [А.с. СССР N 1291155, А 61 К 39/00, G 01 N 33/535, oп. 23.02.87, Бюл. 7].

Согласно этому способу на полистироловую твердую фазу адсорбируют антиген (АГ) или антитело (AT), инкубируют с исследуемой пробой, содержащей АГ или AT, вносят смесь специфических конъюгатов соответственно АГ или AT со щелочной фосфатазой или пероксидазой, затем вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы или пероксидазы, колориметрически определяют концентрацию одного АГ или AT, затем твердую фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго АГ или AT.

Способ испытан при определении антигенной специфичности иммунного ответа in vitro супернатантов 5-дневных культур клеток селезенки мышей по линии СВА.

Недостатком способа является то, что при использовании в качестве твердой фазы полистирола для иммобилизации на нем АГ или AT возникают сложности в процессе иммуносорбции (длительность процесса, недостаточная адсорбционная емкость). Недостаточная концентрация АГ или AT ограничивает чувствительность ИФА. Повышение концентрации АГ или AT на твердой фазе приводит к адсорбции свободносвязанных клеток, которые элюируют на последующих этапах инкубирования и отмывки и тем самым снижают чувствительность и специфичность метода. Качество адсорбции зависит от температуры, рН, ионной силы, времени инкубации [Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития. Обзорная информация. Серия. Медицинская генетика и иммунология. В.И.Покровский и др., вып.3, М., 1986, с.4-5, 39].

Известен способ определения чувствительности антигенного препарата для определения антикардиальных антител (АКА) [Пат. РФ N 20568862, А 61 К 39/385, oп. 27.03.96. Бюл. 9].

Антигенный препарат получали иммобилизацией концентрированного антигена из ткани сердца белой крысы путем полимеризации с акриламидом, метиленбисакриламидом и магнитным материалом. Препарат представляет 10% взвесь сферических гранул с размерами 10-100 мкм.

Чувствительность препарата определяли постановкой реакции иммунофлюоресценции с 40 сыворотками больных ревматизмом, АКА выявлены в 100% случаев, при этом титр АКА составлял в 95% случаев 1:40 - 1:320, а в 5% - 1:640. Такая высокая чувствительность обусловлена повышенной концентрацией антигена в иммобилизованном препарате.

Наиболее близким к заявленному является способ определения гетерогенных антигенов, сходных для возбудителей ООИ и тканей человека и животного [ Бочко Т. М., Некляев В.Н., Ефременко В.И. К методике получения фракции Y.pestis, содержащей гетерогенные антигены. //Лабораторное дело, 9, 1979, с. 554-555].

Целесообразность исследования таких антигенов обоснована тем, что экспериментально установлены общие антигенные детерминанты тканей человека и животного со многими микроорганизмами, в том числе возбудителями ООИ, например чумы и холеры.

Из препарата, полученного из эритроцитов человека, выделяли гетерогенную антигенную фракцию путем сорбции антигена из клеток человека фиксированными антителами против Y. pestis на основе полиакриламидного геля с последующим элюированием фракции и ее концентрированием. Определение гетерогенных антигенов осуществляли в реакции преципитации по Оухтерлоне. Путем последовательного внесения в гель иммунной сыворотки против Y.pestis и исследуемой фракции гетерогенных антигенов с последующим инкубированием при 37^oС в течение 24-48 часов. Учет результатов реакции проводили по наличию или отсутствию полос преципитации.

С иммунологической точки зрения способ определения антигенов представляет сорбцию исследуемого материала фиксированной в геле противомикробной сывороткой с последующим учетом результата реакции по образованию иммунного комплекса АГ-АТ - полосы преципитации.

Способ недостаточно чувствителен при низкой концентрации антигенов в исследуемом материале, длителен, не предусматривает количественного определения антигенов, сложен при необходимости одновременного определения общих антигенных детерминант к нескольким микроорганизмам.

Технической задачей изобретения является повышение чувствительности и специфичности, ускорение способа и обеспечение возможности одновременного количественного определения общих антигенных детерминант к нескольким микроорганизмам.

Решение технической задачи достигается тем, что в способе определения гетерогенных антигенов, сходных для микроорганизмов и органов человека и животных, основанном на сорбции исследуемого материала фиксированной на носителе иммунной сывороткой и учете результатов реакции по образованию иммунного комплекса антиген-антитело, в качестве носителя используют магноиммуносорбенты, при этом сорбцию осуществляют перемешиванием магноиммуносорбентов с исследуемым материалом в течение 1-2 часов при 18-24^oС и ведут количественный учет результатов реакции в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками, одномоментно определяют общие антигены к нескольким видам бактерий без предварительного концентрирования.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование магноиммуносорбентов в качестве носителя в процессе иммунной сорбции антигенов обеспечивает высокую сорбционную емкость и селективное концентрирование на них антигенов даже при их низкой концентрации, сокращение времени иммуносорбции и образование иммунного комплекса АГ-АТ с 20 до 2 часов.

Наличие в настоящее время высокоспецифичных магноиммуносорбентов и приспособлений для манипуляций с ними значительно упрощает процедуру одномоментного дифференциального, качественно-количественного определения антигенных детерминант в присутствии специфических иммуноглобулинов, меченных соответствующими метками для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов.

Совокупность селективного концентрирования антигенов высокоспецифическими магноиммуносорбентами и возможность использования современных методов анализа обеспечивают высокую чувствительность и специфичность заявляемого способа и технический результат изобретения.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примером его конкретного выполнения.

Пример. При проведении иммунофлюоресцентного анализа с магноиммуносорбентными диагностикумами применяется метод количественной иммунофлюоресценции (КИФА). Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служит люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяют источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76. Рабочее напряжение составляет 800-900В, увеличение объектива и окуляра 10. Применяются возбуждающие светофильтры БС-8-2, С3С-7-2, ФС-1-6, диаметр зонда фотометрической насадки 0,5 мм.

К 50 мкл 10% взвеси магноиммуносорбента добавляют 250 мкл полученных антигенных детерминант из органов человека и морской свинки (печень, легкое, селезенка), инкубируют в течение 20-30 мин в термостате при (241)^oС.

Затем гранулы отмывают 5-6 раз физиологическим раствором и 1 раз дистиллированной водой, фиксируя постоянным магнитом, вносят 250 мкл диагностических люминесцирующих иммуноглобулинов в рабочем разведении. Выдерживают при температуре (241)^oС 20-30 мин и отмывают вышеуказанным способом. Одновременно проводят контроль: гранулы магноиммуносорбента, не контактировавшие с антигенными детерминантами, контактировавшие с нормальной кроличьей сывороткой (НКС) и бычьим сывороточным альбумином (БСА), окрашивают диагностическими люминесцирующими иммуноглобулинами и отмывают аналогично опыту. Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносят на предметное стекло и помещают на столик микроскопа. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывают полевую диафрагму и снимают цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяют среднеарифметические значения величины флюоресценции опытных и контрольных гранул и пространства между ними - фона. Интенсивность люминесценции магноиммуносорбента (М) представляет собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)=Мгранул - Мфона. Положительными считали результаты, при которых уровень флюоресценции опытных гранул в 1,5 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных гранул.