способ негативного контрастирования липосом для электронно- микроскопического исследования

Формула изобретения

Способ негативного контрастирования липосом для электронно-микроскопического исследования, включающий приготовление липосом, смешивание с раствором контрастирующего вещества, нанесение на сеточку с подложкой и высушивание образца, отличающийся тем, что перед нанесением на сеточку с подложкой к смеси контрастированных липосом добавляют раствор поливинилпирролидона до конечной концентрации 0,01-0,06%, а в качестве контрастирующего вещества используют раствор уранилацетата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, клеточной биологии, биотехнологии, электронной микроскопии, а именно к способам контрастирования липосом для их исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии.

В настоящее время липосомы исследуются как самостоятельный объект в коллоидной химии, как средство для направленного транспорта веществ в клетки, ткани и органы, как модель при изучении биологических мембран, широко используются в косметологии. Однако их структура и свойства еще недостаточно изучены.

Одним из способов изучения липосом является трансмиссионная электронная микроскопия с негативным контрастированием объекта. В качестве контрастирующих веществ при исследовании биологических объектов используется целый ряд соединений, содержащих рассеивающие электроны ядра. К ним относятся растворимые соединения свинца, урана, осмия, молибдена, вольфрама [Бирюзова В. И., Боровягин В.П., Гилев В.П., Киселев Н.А., Тихоненко А.С., Ченцов Ю.С. Электронно-микроскопические методы исследования биологических объектов. М.: Издательство Академии Наук СССР, 1963, 204 с.].

Известен способ негативного контрастирования липосом, в котором дисперсию липосом наносят на сетку с подложкой, после подсушивания наносят раствор контрастирующего вещества, снова подсушивают, после чего образец подвергают электронно-микроскопическому исследованию [Kodama M., Miyata Т., Takaichi Y. Calorimetric investigation of phase transitions of sonicated vesicles of dimyristoylphosphatidylcholine // Biochimica et Biophysica Acta. - 1993. - Vol. 1169, N1. - p. 90-97].

Недостатками метода являются слипание липосом в процессе высушивания и последующее контрастирование уже слипшихся липосом.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ негативного контрастирования липосом, в котором дисперсию липосом смешивают с раствором молибдата аммония, дисперсию контрастированных липосом наносят на сетку с подложкой, а после подсушивания просматривают на электронном микроскопе [Lichtenberg D., Freire E., Schmidt C.F., Barenholz Y. , Felgner P.L., Thompson Т.Е. Effect of surface curvature on stability, thermodinamic behavior, and osmotic activity of dipalmitoylphosphatidylcholine single lamellar vesicles // Biochemistry. - 1981. - Vol. 20, N12. - p. 3462-3467].

Недостатками прототипа является то, что в процессе подсушивания происходит агрегация липосом, что приводит к ухудшению качества электронно-микроскопической картины вследствие деформации липосом.

Целью изобретения является повышение качества электронно-микроскопической картины при исследовании липосом за счет предотвращения их агрегации и равномерного распределения липосом по подложке.

Указанная цель достигается тем, что после смешивания водной дисперсии липосом с водным раствором уранилацетата проводится добавление к смеси водного раствора поливинилпирролидона, который, за счет адсорбции на липосомах [Ю.Э. Кирш. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды. - М., Наука. -1998. - 252 с.], препятствует агрегации липосом и делает их распределение по подложке равномерным. Авторами установлено, что уранилацетат обладает наилучшей контрастирующей способностью, вследствие того что ион уранила наиболее прочно фиксируется на поверхности липосом, а ядро урана обладает наибольшей рассеивающей способностью [Брусков В.И. Некоторые вопросы негативного контрастирования при электронной микроскопии биологических объектов // Молекулярная биология. - 1968.- Т. 2, N 5. - с. 681-687]. Концентрация поливинилпирролидона в смеси, наносимой на подложку, подбирается экспериментально, зависит от размеров исследуемых липосом и находится в диапазоне от 0,01 до 0,06%.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ негативного контрастирования липосом значительно повышает качество электронно-микроскопической картины. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Анализ известных способов в исследуемой области позволяет сделать вывод об отсутствии в них признаков, сходных с существенными отличительными признаками в заявляемом способе негативного контрастирования липосом.

Пример. 0,04 мл 0,5% дисперсии лецитиновых липосом смешивали с 0,1 мл 0,5% уранилацетата. После перемешивания добавляли 0,05 мл 0,2% раствора поливинилпирролидона (М= 126002700). После нанесения липосом на сеточки с подложкой и подсушивания просматривали образец в трансмиссионном электронном микроскопе.