способы ускоренной диагностики гепатита с, основанные на обнаружении гемагглютининов вируса гепатита с и антител к ним в рга и ртга в крови людей

Формула изобретения

1. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что обнаружение (выявление) антигенов вируса гепатита С (ВГС) основано на способности антигенов ВГС агглютинировать эритроциты гусей или голубей в реакции гемагглютинации (РГА), при этом результаты считаются положительными, если титры антигенов ВГС в РГА превышают 1: 20-1: 40.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию гемагглютинации ставят при рН 6,1-6,5.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве буферной смеси в РГА используют боратный буфер рН 9,0, содержащий 0,4% бычьего альбумина и смесь фосфатных буферов рН 6 и рН 7.

4. Способ ускоренной диагностики гепатита С, предусматривающий использование (исследование) крови людей, зараженных или подозрительных на заражение вирусом гепатита С, отличающийся тем, что выявляют индуцируемые гемагглютининами ВГС антитела в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве гемагглютининов для РТГА используют антигены цитопатогенных вариантов ВГС, выделенных из инфицированных культур клеток и/или из органов зараженных ВГС животных.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к методу диагностики гепатита С, основанному на прямом выявлении вирусспецифических антигенов и антител к природным белкам ВГС и приспособленным для массовых ускоренных анализов проб крови больных гепатитом С с возможной автоматизацией процесса.

Существующий в настоящее время метод специфической диагностики гепатита С основан на двух тестах: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления последовательностей РНК-генома ВГС в сыворотке крови ВГС- инфицированных больных и иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к рекомбинантным структурным и неструктурным белкам ВГС. В редких случаях для диагностики гепатита С используют биопсию печени.

В то же время известно, что оба этих метода имеют существенные недостатки: 1) метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты в первые 6 месяцев после инфекции ВГС. Кроме того, ПЦР - дорогостоящий метод, требующий высокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, и поэтому имеет существенные ограничения в использовании его для массового скрининга образцов крови; 2) ИФА позволяет определять специфические антитела к ВГС в крови инфицированных больных. В качестве антигенов в этой реакция используют рекомбинантный нуклеокапсидный белок ВГС и один или несколько рекомбинантных неструктурных белков ВГС. Отсутствие полного набора ВГС-специфических природных белков в этой реакции, в частности поверхностных белков вирионов ВГС - Е2 и Е1, в значительной степени снижает ее чувствительность и часто приводит к отрицательным результатам при исследовании сывороток крови от ВГС-инфицированных больных.

Кроме того, до настоящего времени не разработаны способы прямого определения антигенов, агглютинирующих эритроциты и антигемагглютининов к ВГС в сыворотках крови инфицированных людей, что является необходимым для оценки динамики развития и тяжести инфекции ВГС у инфицированных людей, для оценки специфической и неспецифической противовирусной активности лечебно-профилактических препаратов

До сих пор нет коммерческих тест-систем для обнаружения ВГС-специфических антигенов в сыворотках крови людей и антител к природным, в том числе поверхностным белкам ВГС.

Из литературных данных известны попытки определить ВГС-специфические антигены в крови больных. Антигены ВГС в этих случаях определяют после концентрации больших объемов сыворотки крови с помощью моноклональных антител к рекомбинантному нуклеокапсиду ВГС (Кущ А.А. и др. 1997). Ясно, что этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение. Известны также данные определения антигенов ВГС методом иммунофлюоресценции и ИФА при биопсии печени больных гепатитом С. Однако и этот метод имеет серьезные ограничения использования его для массового скрининга сывороток крови людей.

Ограниченность существующих методов диагностики гепатита С, прежде всего, связана с отсутствием до настоящего времени экспериментальных моделей in vitro и in vivo, которые позволили бы выделять высокопродуктивные антигенно-активные штаммы вируса гепатита С, пригодные для конструирования экономически выгодных диагностических систем.

Возможность создания экспериментальных моделей инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток различного происхождения и в организме инфицированных животных, реализованная нами ранее, позволила выделить из сыворотки крови людей, инфицированных вирусом гепатита С, высокопродуктивные антигенно-активные варианты вируса гепатита С, изучить их основные свойства и разработать до сих пор неизвестные для ВГС методы диагностики вызываемой им инфекции (П. Г. Дерябин и др., 1997, 1998). Штамм вируса гепатита С (Д-1), выделенный нами из культур клеток, пригодный для приготовления диагностических и профилактических препаратов (патент РФ на изобретение 2130967, приоритет от 07. 10.97 г.).

Предложенный способ определения антигенов ВГС основан на способности выявления в крови людей, инфицированных ВГС, антигенов ВГС, обладающих гемагглютинирующей способностью. Гемагглютинины ВГС были обнаружены нами при культивировании ВГС-содержащего материала в культурах клеток различного происхождения, а также в органах и тканях ВГС-инфицированных животных. Как известно, для других представителей семейства Flaviviridae гемагглютинирующая (ГА) активность флавивирусов связана с эпитопами на поверхности белка Е. Результаты исследований показали, что ВГС и все известные генотипы этого вируса, культивируемые в культурах клеток или на уровне организма, как и другие представители семейства Flaviviridae, способны агглютинировать эритроциты при различных значений рН фосфатного буфера. При этом ГА-активность ВГС специфически тормозится в присутствии антител (антигемагглютининов) к ВГС. Это свойство, характерное для многих представителей вирусов семейства Flaviviridae, на протяжении многих лет используется для диагностики флавивирусных инфекций в реакциях РГА и в РТГА, предложенными Clarke и Casals в 1958 г. В отношении вируса гепатита С эти методы определения антигенов и их специфической активности до сих пор не применялись.

В табл.1 представлены данные, демонстрирующие ГА- активность высокопродуктивных вариантов ВГС, выделенных из сыворотки крови больных гепатитом С методом заражения культур клеток различного происхождения.

Как видно из данных табл.1, ГА-активность изолированных вариантов ВГС проявляется при культивировании в культурах клеток различного происхождения. Данные показывают, что репликация ВГС в культурах клеток на всем протяжении сопровождается продукцией антигенов-гемагглютининов ВГС, которые регистрируются до появления цитодеструктивных свойств ВГС. Причем титры гемагглютининов ВГС для культур клеток варьируют и достигают максимальных значений к 72-96 ч после инфекции (1:64 - 1:128). А при коцентрации вируссодержащей культуральной жидкости, собранной из инфицированных культур клеток через 72 или 96 ч после инфекции, после центрифугирования ее при 30000 об/мин в течение 1 ч титры ГА-активность ВГС достигают 1:1024 - 1:2048. Показано, что ГА-активностью обладают все известные генотипы (субтипы) ВГС. Получены данные о ГА-активности антигенов, содержащихся в сыворотках крови, а также в различных органах и тканях мышей, кроликов, инфицированных цитопатогенными вариантами ВГС.

Полученные данные позволили предположить наличие антигенной активности ВГС в сыворотках крови инфицированных ВГС людей, обнаруживаемой по способности ВГС к гемагглютинации в классической реакции гемагглютинации (РГА).

Таким образом, в способе обнаружения антигенов ВГС была применена РГА, ранее известная для определения антигенов классических представителей альфа- и флавивирусов (вирусов восточного и венесуэльского энцефаломиелита лошадей, японского и клещевого энцефалитов, лихорадки Западного Нила, денге и др.) и до сих пор не использующаяся для обнаружения антигенов ВГС. Адаптация РГА для определения антигенов ВГС в сыворотках крови людей позволила обнаруживать ВГС-специфический антиген на всем протяжении инфекции, вызванной ВГС, в том числе и в случаях, когда данные высокочувствительного метода ПЦР были отрицательными, включая ранние сроки после инфекции. Определение антигенов ВГС в сыворотках крови людей оказалось наиболее чувствительным методом диагностики гепатита С у людей, использование которого позволяет в короткие сроки устанавливать диагноз инфекции. Простота постановки реакции позволяет использование ее для массового скриннинга проб крови людей на наличие инфекции, вызванной ВГС, для оценки эффективности лечения или профилактики гепатита С различными препаратами, для определения инфекции ВГС при отрицательных данных ПЦР. Показана возможность определения антигенов ВГС как в цельной крови, так и в сыворотках крови, во фракциях эритроцитов и лейкоцитов крови человека.

Сущность изобретения: основана на выявлени гемагглютинирующей способности антигенов вируса гепатита С. Пробы крови людей, подозрительных на инфекцию вирусом гепатита С, используют в качестве исследуемого антигенсодержащего материала в классической реакции гемагглютинации (РГА) в оптимальной зоне рН фосфатного буфера. Метод определения антигенов ВГС в крови людей позволяет количественно оценивать концентрацию (титры) антигенов (гемагглютининов) ВГС.

Специфичность гемагглютинирующей активности (ГА-активности) ВГС подтверждают в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в классической постановке (Clarke и Casals, 1958 г.). Способ обнаружения антител к вирусу гепатита С основан на возможности использования в РТГА в качестве специфических антигенов природных структурных белков вирионов вируса гепатита С, выделенного из культур клеток или органов животных, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС. Использование антигенно-активных природных белков и вирионов ВГС позволяет идентифицировать гемагглютинины в крови ВГС-инфицированных людей как антигены ВГС.

В реакции используют кровь или эритроцитарную или лейкоцитарную фракции крови, или сыворотку из крови человека, взятую в количестве до 100 - 200 мкл (0,1-0,2 мл). Затем сыворотку разводят до 1:10 боратным буферным раствором, содержащим 0,4% бычьего альбумина (рН 9,0). Используя тот же состав боратно-буферного раствора, делают 2-кратные разведения сыворотки, начиная с 1:10, 1: 20, 1:40 и т.д., в 96-луночных панелях с u-образным дном. Эритроциты гуся получают из подкрыльцовой вены гусей-самцов или голубей, используя антикоагулирующий раствор Альзовера. В реакции используют 0,4% взвесь эритроцитов на фосфатном буферном растворе (зона рН 6-7), который готовят перед опытом, смешивая фосфатно-буферные растворы рН 6 и 7.

По 20 мкл взвеси эритроцитов гуся вносят в каждую из лунок с разведениями сыворотки крови человека. В качестве контролей в РГА служат: а) 0,4% взвесь эритроцитов, внесенная в лунки с боратным буферным раствором без крови ВГС-инфицированных людей или с кровью заведомо здоровых доноров. Через 1 ч учитывают результаты. Образование плотного осадка эритроцитов на дне лунки свидетельствует об отрицательных результатах. Формирование "зонда" из агглютинированных эритроцитов на всей поверхности эритроцитов свидетельствует о положительной реакции. В контрольных опытах наблюдают формирование плотного осадка эритроцитов.

Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигенов ВГС в РГА превышает 1:20 - 1: 40.

Данный способ определения антигенов ВГС позволяет использовать минимальные объемы сыворотки крови ВГС инфицированных людей, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также высокой квалификации персонала.

Сущность предложенного способа определения антигемагглютининов заключается в получении культуральных, в том числе концентрированных и очищенных антигенов ВГС или антигенно-активного вируса, антигенов ВГС, полученных методом щелочной или сахарозоацетоновой экстракции - классические способы получения антигенов для большинства вирусных инфекций, описанные в литературе. Антигены ВГС, полученные таким образом, должны обладать высокой гемагглютинирующей активностью, что дает возможность их использования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для определения антигемагглютининов в сыворотках крови ВГС инфицированных людей. РТГА используется в классической постановке, описанной Clarke и Casals (1958 г.).

В табл.2 представлены данные, полученные в РТГА, о циркуляции в сыворотке крови ВГС инфицированных людей антигемагглютининов ВГС. В частности, показано, что антитела, тормозящие гемагглютинацию ВГС, циркулируют у людей в разные сроки после инфекции ВГС. В то же время антигемагглютинины в более высоких титрах обнаруживают в начале инфекции, когда данные ПЦР не позволяют обнаруживать РНК ВГС.

Полученные данные позволяют проследить динамику инфекционного процесса, а наличие антигемагглютининов в сыворотке крови людей позволяет обнаруживать инфекцию ВГС в ранние сроки или оценить действие лечебных препаратов на течение инфекции.

Пример 1. Способ определения антигенов - гемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Табл.3, в РГА, поставленной микрометодом с использованием эритроцитов гуся в фосфатном буферном растворе были обследованы 145 образцов сыворотки крови людей, инфицированных ВГС, 182 образца сывороток от людей, не содержащих РНК ВГС и антител к ВГС. Из данных табл.3 видно, что все сыворотки от инфицированных ВГС содержали антигены ВГС, причем максимальные значения титров ГА активности наблюдаются у больных, сыворотки которых содержали как антитела, так и РНК ВГС. Значительно более низкие титры гемагглютининов (1:128 - средние данные) обнаруживали у людей, в сыворотке крови которых не выявлена РНК ВГС. Однако обнаруженная концентрация антигенов ВГС у таких больных (а это больные в ранние сроки после инфекции) дает возможность устанавливать диагноз инфекции в случаях, когда данные ПЦР являются отрицательными. Определение ГА-активности в образцах сывороток крови контрольных групп людей (182 образца) показало, что в среднем эти данные не превышают титров 1:18, что, как известно, скорее всего связано с неспецифическим проявлением ГА-активности у людей: доноров, больных гриппом, гепатитом В, пневмонией и краснухой.

Таким образом, РГА дает возможность быстрого выявления антигенов ВГС, агглютинирующих эритроциты гуся в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей, положительных и отрицательных на РНК ВГС по данным ПЦР.

Пример 2. Способ определения антигемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Возможность определения антител, тормозящих ГА-активность ВГС, появилась благодаря выделению из ВГС-инфицированных культур клеток антигенно-неактивных вариантов ВГС, которые и были успешно использованы в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В табл.4 представлены данные, демонстрирующие возможность РТГА для определения антител к ВГС в сыворотках крови инфицированных гепатитом С. Показано, что:

- Антигемагглютинины ВГС циркулируют в сыворотках крови людей на разных стадиях инфекции ВГС.

- Максимальных значений антигемагглютинины достигают в сыворотках крови людей, содержащих антитела к ВГС (по данным ИФА), но отрицательных в ПЦР реакции (РНК ВГС отрицательные сыворотки). Вероятно, этим и объясняется низкий титр гемагглютининов ВГС, выявляемый в этих же сыворотках: ГА -активность в этом случае в значительной степени подавлена антителами к ВГС.

- Использование в РТГА в качестве антигенов ВГС сывороток крови ВГС-инфицированных людей, ВГС- инфицированных кроликов, а также культуральных антигенов ВГС позволяет выявлять антигемагглютинины во всех случаях, однако максимальные титры антител обнаруживаются при использовании культуральных антигенов (культуральная жидкость, собранная из инфицированных ВГС культур клеток, выращиваемых роллерным способом).

- Атигемагглютинины ВГС не были выявлены в образцах сывороток контрольных групп людей: доноров, больных гепатитом В, краснухой, гриппом, пневмонией, что ярко демонстрирует специфичность как антигемагглютининов ВГС, так и ГА-активности ВГС в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей.

- ВГС-специфические рекомбинантные белки (нуклеокапсидный и неструктурные белки), входящие в состав коммерческих тест-систем, производимых фирмой "Органон" (США), не способны выявлять в РТГА антитела в сыворотках крови ВГС- инфицированных, что свидетельствуют о том, что ГА-активность ВГС связана с белками оболочки вириона, скорее всего с белком Е2, не входящим в состав данной тест-системы.

Источники информации

1. Clarke D.H. and Casals J. Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with arthropod borne viruses. Am. J.Trop. Med. Hyg. 7:562(1958).

2. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И., Вязов С.О. Штамм, virus hepatitis С, Д-1, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент на изобретение 2130967, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 1999 г., Москва. Приоритет по заявке 97116620 от 07.10.1997 г.

3. П. Г. Дерябин, С.О. Вязов, Е.И. Исаева и др. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга мышей-сосунков. Вопр. вирусол., 1997, Т.6., стр.254-258.

4. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов С.О. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусол.,1997, т.6., стр.259-263.

5. П.Г. Дерябин, Е.И. Исаева, С.О. Вязов, Д.К. Львов. Летальная инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусолог., 1997, т.6., стр.251-253.

6. П.Г. Дерябин, Д.К. Львов. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация. Доклады Академии наук РФ, 1998, т.358, N5, стр.688-691.

7. А. А. Кущ, О. В. Масалова, С.Н. Атанадзе. и др. Материалы 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты B, C, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики, Москва 14-16 октября 1997 г.