способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы

Формула изобретения

Способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, включающий иммуногистохимический анализ клеток удаленной опухоли, отличающийся тем, что определяют в поле зрения процент позитивных клеток, экспрессирующих рецептор Fit в ядре, по отношению к общему количеству опухолевых клеток и при его величине, равной или менее 33%, прогнозируют высокую вероятность метастазирования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования вероятности метастазирования увеальной меланомы с целью увеличения продолжительности жизни больных.

Увеальная меланома (УМ) является чрезвычайно злокачественной опухолью органа зрения, представляющая угрозу не только зрительным функциям, но и жизни пациента. Частота заболеваемости увеальной меланомой по данным различных авторов колеблется от 2,3 до 7 человек на 1 млн. населения.

Вопросы прогнозирования клинического течения УМ, в том числе и главным образом метастазирования, сводятся к выделению в группу риска развития метастазов тех пациентов, у которых имеется один или более прогностических неблагоприятных фактора - пожилой возраст пациента, проминенция опухоли более 7 мм, диаметр более 10 мм, эпителиоидный тип меланомы, преэкваториальная локализация опухоли; геморрагии на поверхности опухоли, грибовидная форма, прорыв мембраны Бруха, прорастание опухоли за пределы оболочек глаза с формированием эпибульбарных узлов. Каждому из этих факторов дается корреляционный коэффициент, который указывает с какой вероятностью можно прогнозировать развитие метастазов [Opthalmic Pathology and Intraocular Tumors.-1996-1997-p. 186-190. -American Academy of Ophthalmology. San-Francisco]. Совокупность этих показателей и дает общую картину. Чем их больше, тем хуже прогноз для пациента. Пациенты группы риска находятся под наблюдением и являются на контроль через укороченные интервалы (3 месяца).

Однако практика показывает, что такая система отбора группы риска далека от совершенства. Как правило, среди 100 человек, находящихся под наблюдением, со сходными факторами риска или их комбинациями, только 25 умирает от метастатической болезни, а среди пациентов, не имеющих неблагоприятные показатели и не относящихся к группе риска, напротив возникает смертность. Следовательно, существуют другие, более патогенетические значимые, не учитываемые нами закономерности развития метастатического процесса.

В поисках решения проблемы мы обратились к изучению роли ангиогенеза в метастазировании заболевания. По мнению многих авторов именно показатели ангиогенеза вносят существенный вклад в распространение опухолевых клеток из органа зрения по организму с оседанием в органах инвазии. Логическим объяснением коррелятивному феномену служит теория ангиогенеза Фолькмана, впервые высказанная им в 1974 году. Опухоль, считает ученый, без собственной сети может достичь высоты не более 2 мм, далее она должна построить собственную систему кровоснабжения (неоангиогенез), чтобы расти и достичь полной автономии (вершиной которой является генерализация неопластического процесса). Соответственно переход в это новое качественное состояние должен наступить при определенных количественных показателях состояния неоангиогенеза [Folkman J. 1996-J/ Natl. Cancer Inst.Vol.88-p.1091-1092].

За аналог нашего изобретения мы взяли морфогистологический способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы на основе оценки ангиогенеза с подсчетом количества сосудов и определения типа неоваскуляризации на срезе опухоли. A. Foss Reassessment of the PAS pattens in uveal melanoma. Br. J. Ophthalmology, 1997, v.81, pp. 240-246. Чем выше эти показатели, тем хуже их прогноз. Наличие 3-х гистологических типов УМ с различными прогнозами и частотой метастазирования при одинаковых сроках наблюдения и различной продолжительностью жизни существенно снижает достоверность и информативность этого способа. Так, например, веретеноклеточные и эпителиоидные (более агрессивные) опухоли могут иметь одинаковые показатели ангиогенеза (количество сосудов на 1 мм², при одинаковом типе сети и т.д.) но их прогнозы, как известно, существенно различаются. Приняв за догму эту теорию apriore и экстраполировав ее на УМ мы решили, что существующие оценки ангиогенеза конкретной опухоли и конкретного пациента являются более точными показателями, нежели клиническая стадия заболевания, тип клеточного строения и т. д. Вместе с тем, мы предположили, что существуют иные факторы оценки ангиогенеза, позволяющие реально определить готовность опухоли к метастазированию. Количественное их определение могло бы быть прогностически более достоверным и информативным, чем вышеописанный метод.

Основными участниками ангиогенеза, как известно, являются эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецепторы (FLT и FLK/KDR-1). Именно VEGF регулирует пролиферацию и выход эндотелиальных клеток сосудистой выстилки (первый цикл) с последующим формированием новообразованных сосудов и проницаемость последних для оторвавшихся от клеточного матрикса, готовых к метастазированию опухолевых клеток (второй цикл). Известно несколько механизмов индукции ангиогенеза через VEGF. Он стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, увеличивает их миграционную способность и частично активирует гены, участвующие в протеолизе. В большинстве тканей человека эти эффекты синергично усиливаются другими ангиогенными факторами, например основным фактором роста фибробластов (bFGF). Передача сигнала внутрь клетки осуществляется через рецепторы к VEGF на эндотелиальных клетках - Flt-1 и Flk-1/KDR-1. Flk-1/KDR-1 является наиболее значимым для реализации всего спектра биологических эффектов VEGF. Уровень его экспрессии значительно возрастает в пролиферирующих (активированных) эндотелиальных клетках и снижается или отсутствует при переходе в стадию покоя. Рецептор Flt-1 иммуногистохимически выявляют как в покоящихся, так и в активированных клетках эндотелия. Соответственно логично было предположить показатели ангиогенеза в качестве прогностических маркеров.

Материалом для иммуногистохимических исследований служил архивный материал МНИИ глазных болезней имени Гельмгольца и МОКБ в виде парафиновых блоков энуклеированных глаз (n=97) с УМ, принадлежавших пациентам-москвичам, сроки наблюдения за которыми составили от 1 года до 25 лет. Продолжительность их жизни, факт и причина смерти (от метастатического процесса) с указанием точной ее даты подтверждены запросами ЦАБ и результатами аутопсии. При указанных сроках наблюдения выбыло из-под контроля по причине смерти от метастатической болезни 48 пациентов. Остальные 49 человек оставались живы на момент проведения исследований. Контроль состояния оставшихся в живых пациентов с УМ проводили не позднее, чем за 2 месяца до настоящего исследования. Продолжительность жизни всех оставшихся в живых пациентов превышала 5 лет.

Под наблюдением находилось 97 пациентов (54 женщины, 43 мужчины; в возрасте от 22 до 72 лет), из них 19 - с начальной меланомой (T₁N₀M₀), 20 - со стадией T₂N₀M₀, 26 - T₃N₀M₀, 18 - T₄N₀M₀ и 14 человек с генерализованной формой УМ.

Анализ результатов настоящего исследования проводили в соответствии со стандартными алгоритмами вариационной статистики с помощью пакета программ SAS (Statistical Analysis System, version 6.09, USA). Для каждого показателя, измеряемого по количественной шкале, рассчитывали среднее групповое значение, среднее квадратическое отклонение и стандартную ошибку среднего. Связи между показателями оценивали по величине коэффициентов линейной корреляции. Статистическую достоверность различий между значениями количественных показателей в разных группах больных вычисляли с помощью модифицированного t-критерия Стьюдента для независимых выборок, а ранговых показателей - по 2-критерию Фишера.

Существенные колебания сроков наблюдения за больными (от 1 года до 25 лет) в различных анализируемых группах заставили нас прибегнуть к многомерному регрессионному анализу, в котором мы оценивали вероятность возникновения метастазов и смерти от метастатического процесса. С помощью многофакторного корреляционного анализа выявлены скрытые закономерности между показателями продукции пептидов и клиническими симптомами или исходами УМ. Сравнительный анализ графических кривых выживаемости по Каплан-Мейеру (учитывающий цензурированные наблюдения) позволил определить объективные тенденции выбывания по причине смерти от метастатического процесса. Таким образом, все данные были проанализированы тремя методами статистической обработки: многофакторным корреляционным анализом, методами многомерной пошаговой регрессии и регрессионного анализа Каплан-Мейера.

Ретроспективный анализ полученных данных о ядерной продукции рецептора Flt выявил глубокую связь его количественных показателей с продолжительностью жизни и частотой возникновения метастатического процесса у пациентов с УМ.

При УМ было зафиксировано 56% Flt-позитивных образцов с иммунофиксацией маркера в ядре (в том числе в 18,7% случаев максимальное число клеток в поле зрения достигло 100%). Продукция Flt в УМ носила цикличный характер: максимальный средний процент Flt-позитивных клеток (ядерной локализации) зарегистрирован на стадии T₂N₀M₀ - 75,714,1%; минимальные - на стадии T₄N₀M₀: 58,99,5%. По средним показателям (Мm) экспрессию Flt на стадиях T₁N₀M₀ и T₃N₀M₀ можно было признать промежуточным этапом. Интенсивность ядерной продукции Flt (Flt N) уменьшалась по мере прогрессирования заболевания: 37,5% начальных меланом - T_1-2N₀M₀ - экспрессировали Flt N интенсивно (градация III), при развитых - стадия T₃N₀M₀ - этот показатель уменьшился до 16,67%, а при выходе опухоли за пределы оболочек глаза - стадия T₄N₀M₀ - до 6,7%. Кинетика среднего показателя клеточной интенсивности (Мm) в виде постепенного снижения его с 1,50,7 - (T_1-2N₀M₀ ) до 0,90,3 (T₄N₀M₀) и далее до 0,70,2 (при генерализации) подтверждала вывод, сделанный по среднему проценту Flt N-позитивных клеток.

Анализ продукции Flt в опухолях различного клеточного строения показал, что в смешанно-клеточных УМ среднее количество Flt N-позитивных клеток составляет -27,96,4%; в веретеноклеточных -28,67,5%; в эпителиоидных УМ - 29,7% 12,4%. Обнаружено и статистически доказано, что в более агрессивных эпителиоидных клетках не только чаще, но и на более высоком уровне встречается избирательная рецепция Flt N (в 40% образцов).

Корреляционный анализ уровня рецепции Flt при УМ различных локализаций позволил установить, что при изолированных меланомах радужки, отличающихся медленных ростом и редким метастазированием, отсутствовала рецепция Flt в ядре, а в опухолях преэкваториальной зоны, отличающихся быстрым прогрессированием и частым метастазированием, зафиксированы максимальные показатели.

Обнаружена отрицательная связь между количественными показателями Flt-1 в ядре и сроками выживания больных с УМ: продолжительность их жизни обратно коррелирует с процентом Flt N-позитивных клеток (коэфф. корреляции: k= -0,33510, р=0,0027). Анализ кривых выживаемости по Каплан-Мейеру при различных показателях Flt N подтвердил данные многофакторного анализа о связи между вероятностью метастазирования и смертностью, с одной стороны, и показателями Flt N - с другой. Отрезной точкой для Flt N были 33%. Все пациенты с УМ были распределены на две группы - А и В. В группу А вошли 54 человека с Flt N33%, а в группу В - 37 пациентов с Flt N>33%. Из группы А, сроки наблюдения в которой в среднем составили 60,02,8 месяца, умерло 16 человек. Из группы В умерли от метастатического процесса 7 больных (при средней продолжительности наблюдения 152,8 20,4 месяца). Анализ показал, что процесс выбывания больных в группе В идет значительно медленнее, чем в А, где Flt N33% (граф. 1, р<0,05). Вывод полностью согласуется с результатами пошагового регрессионного моделирования, установившими обратную корреляционную связь между количеством Flt N-позитивных клеток и вероятностью метастазирования (р<0,05) (граф.1). То есть, чем больше количество Flt N-позитивных клеток, тем лучше прогноз.

Таким образом, принимая во внимание полученные данные, а также их высокую взаимосвязь с клиническим течением заболевания (переходом в стадию генерализации), считаем что этот маркер ангиогенеза можно использовать в качестве прогностического.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать клиническое течение увеальной меланомы, в частности вероятность развития метастазов у каждого конкретного больного. Техническим результатом является объективизация и повышение точности прогнозирования клинического течения увеальной меланомы и определение своевременного и адекватного лечения.

Технический результат достигается за счет иммуногистохимического выявления соотношения количества позитивных клеток, экспрессирующих рецептор Flt в ядре, и общего количества опухолевых клеток в поле зрения на срезе УМ.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим способом.

1. После энуклеации глаза с УМ готовят парафиновый блок по стандартной технологии.

2. Парафиновые срезы толщиной 3-5 микрон готовили также по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов.

3. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99^oС цитратном буфере [DAKO, Копенгаген, Дания] в течение 30 минут. Затем стекла охлаждают при комнатной температуре в течение 15-20 минут, и переносят в фосфатный буфер.

4. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубируют 20 минут в темноте с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывают 5 минут в фосфатном буфере.

5. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубируют 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубация с первичными антителами проводится при 4^oС в течение ночи. После первичных антител стекла промывают 2 раза по 5 минут в фосфатном буфере. Инкубацию со вторыми антителами, меченными биотитом [LSAB+kit, DAKO, Копенгаген, Дания], проводят при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промываются 2х5 минут. Инкубацию с антителами, меченными стрептавидином [LSAB+kit, DAKO, Копенгаген, Дания], проводят при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывают 3х5 минут.

6. Для визуализации иммуногистохимической реакции используется система [DAKO, Копенгаген, Дания]. Срезы докрашиваются гематоксилином и заключаются в бальзам.

В качестве первичных антител использовали: антитела к Flt-1 (козьи поликлональные антитела; разведение 1:100; Santa Cruz Biotech., США).

7. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение х10, х20, х40) по следующим критериям. Оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивалось в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовалось проведение иммуногистохимической реакции без добавления первичных антител. Результаты окрашивания оценивались также по интенсивности и количеству положительных клеток, а также зонам локализации свечения.

8. При обнаружении Flt-N-позитивных клеток < 33% в поле зрения считали прогноз для конкретного пациента с таким показателем в плане клинического течения увеальной меланомы неблагоприятным, с короткой продолжительностью жизни и высокой вероятностью метастазирования. Пациента выделяли в группу риска.

Пример 1. Больной М. 36 лет. Поступил с диагнозом увеальная меланома правого глаза в стадии T3N0M0. ОС - здоров. Проведено обследование у онколога с использованием УЗИ органов брюшной полости и рентгенография органов грудной полости. Признаков инвазии нет. В стационаре, учитывая невозможность проведения органосохранного лечения, ему предложена энуклеация. Операция была проведена по стандартной технологии с использованием криофиксации глазного яблока (для абластичности). Линия отсечения произведена в 15 мм от заднего полюса глаза. Гистологи чески верифицирована эпителиоидная меланома в стадии T3N0M0.

Были проведены иммуногистохимические исследования рецептора FLT с подсчетом позитивных клеток, экспрессирующих этот рецептор в ядре, определили его процент по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения. Он оказался равным 12%, то есть неблагоприятным в плане прогноза. Больной выделен в группу риска. Контрольные осмотры назначали через укороченные интервалы (3 месяца). На второй контрольной явке на сцинтиграфии выявлены вторичные изменения в печени метастатического характера. Взят на курс биотерапии с целью замедления прогрессирования метастатического процесса. Стабилизация была достигнута на 3-м курсе. Релаксация составила 19 месяцев. Затем процесс вновь прогрессировал.

Пример 2. Больная Б., 42 года. Меланома хориоидеи левого глаза в стадии T3N0M0. Значительные размеры опухоли (проминенция 10 мм и диаметр опухоли 19 мм) не позволяли провести органосохранное лечение, ей была произведена энуклеация больного глаза. В последующем блок ее опухоли был подвергнут иммуногистохимическому анализу с определением уровня Flt-1 в ядре. Было установлено, что 70% ядер опухолевых клеток содержат этот пептид. Исходя из наших данных мы прогнозировали благоприятный прогноз для этой больной. Сроки наблюдения - 4,5 года - свидетельствуют о его достоверности и точности.