способ прогнозирования развития аллергопатологии на доклиническом этапе

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития аллергопатологии на доклиническом этапе, включающий иммуноферментный анализ, отличающийся тем, что дополнительно стимулируют кровь и проводят инкубацию в течение 6 ч стимулированной и нестимулированной крови, центрифугируют и иммуноферментным анализом отдельно определяют выработку цитокинов в стимулированной и нестимулированной крови с последующим расчетом индекса активности цитокиновой регуляции, определяемым как отношение количества цитокинов в стимулированной крови к количеству цитокинов в нестимулированной крови, и при индексе активности цитокиновой регуляции больше 3,5 состояние организма оценивается как нормальное, а при индексе меньше или равно 3,5 прогнозируют развитие аллергопатологии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии, аллергологии, и может быть использовано для прогноза развития аллергии, выявления функциональных нарушений в иммунной системе при аллергических реакциях.

В последние десятилетия аллергия стала одной из актуальных медико-социальных проблем в связи с глобальной распространенностью и интенсивным ростом аллергической заболеваемости. В настоящее время аллергические болезни уверенно занимают ведущее место среди других форм патологий по различным критериям (распространенность, тяжесть течения, сложность диагностики и терапии, реабилитация, затраты на лечение и др.) [2]. Аллергический процесс, перешедший в клиническую форму практически не поддается лечению, поэтому для своевременной коррекции дефектов функционирования иммунокомпетентных клеток, приводящих к формированию и развитию аллергического процесса и перехода его в клиническую форму, необходимо выявление нарушений на ранней доклинической стадии. Это позволит более эффективно проводить профилактические и лечебные мероприятия.

Работы последних десяти лет свидетельствуют о том, что в формировании и развитии аллергии принимают участие многочисленные цитокины, способствующие возникновению воспалительной реакции [1, 3, 4, 5, 6, 7].

Цитокины являются биологически активными молекулами, влияющими на процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и функциональную активность иммунокомпетентных клеток, осуществляя эндогенную иммунорегуляцию. Один из основных провоспалительных цитокинов - туморнекротизирующий фактор (TNF-), ответственный за индукцию клеточного иммунитета, гиперпродукция которого ведет к увеличению синтеза ряда других цитокинов и факторов, участвующих в клеточной активации, к сдвигу в балансе соотношения Т-хелперов 2 типа к Т-хелперам 1 типа (Тх1/Тх2), в сторону Тх1-ответа. В формировании аллергии принимает участие и интерлейкин 8 (ИЛ-8), который способен усиливать хемотаксис нейтрофилов и участвовать в освобождении гистамина из базофилов, вырабатывающегося клетками под влиянием антигена [3].

Для оценки регуляции аллергических реакций человека представляют особую ценность методы экспрессного определения способности клеток продуцировать цитокины.

Известен способ прогнозирования развития аллергического заболевания реагинового типа путем определения иммуноферментным анализом количества общего иммуноглобулина Б в периферической крови. [Патент РФ 2108749 С1, от 20.04.1998 по кл А 61 В 10/00, G 01 N 33/543]. Однако на выработку уровня общего иммуноглобулина Е может влиять не только наличие аллергического процесса, но и другие факторы, в том числе и наличие паразитов (гельминтоз). Кроме того, в данной методике определяется не специфический, а общий иммуноглобулин Е. Учитывая вышесказанное, точность данного способа для прогноза недостаточно высока, определение общего иммуноглобулина Е может быть использовано только в качестве дополнительного критерия комплексной оценки.

Задача - разработать достоверный способ выявления аллергопатологии на доклиническом этапе для проведения своевременной адекватной коррекции нарушений цитокиновой регуляции. Поставленная задача достигается путем определения выработки цитокинов в стимулированной и нестимулированной крови с последующим расчетом индекса активности цитокиновой регуляции, рассчитываемым как отношение количества цитокинов в стимулированной крови к количеству цитокинов в нестимулированной крови и при индексе активности цитокиновой регуляции больше 3,5 состояние организма оценивается как нормальное, а при индексе меньше или равно 3,5 прогнозируют развитие аллергопатологии.

Способ осуществляется следующим образом.

Первый этап - кровь отбирают из локтевой вены в стерильную силиконированную пробирку, содержащую 15 IU гепарина на один мл крови. Кровь разбавляют в 5 раз стерильной средой RPMI 1640.

Второй этап - инкубация нестимулированной и стимулированной крови для выработки иммунокомпетентными клетками цитокинов - туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8. Для определения выработки цитокинов в нестимулированной крови из пробирки с разбавленной кровью (1:5) отбирают в первую пробирку 1,35 мл цельной крови и добавляют 0,15 мл среды RPMI 1640. Для определения стимулированной выработки цитокинов из пробирки с разбавленной кровью (1:5) отбирают 1,35 мл цельной крови во вторую пробирку и добавляют 0,15 мл рабочего раствора липополисахарида (ЛПС) Е. coli (штамм В55:05) в среде RPMI 1640 (концентрация рабочего раствора 0,1 мг/мл, конечная концентрация ЛПС в пробирке 0,01 мг/мл). В термостате с установленным в нем шейкером (для легкого покачивания пробирок) инкубируют пробирки с кровью в течение 6 часов при температуре 37^o С. Центрифугируют пробирки с кровью (800 g) в течение 5 минут, супернатант отбирают и хранят при -20^oС.

Третий этап - определение цитокинов - туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8 в супернатанте стимулированной и нестимулированной крови иммуноферментным методом с помощью набора Duoset (Genzyme diagnostics, Cambridge, MA, USA). В данной методике могут быть использованы наборы для иммуноферментного анализа любой фирмы, это не влияет на конечный результат количественного определения цитокинов.

Четвертый этап - определение индекса активности цитокиновой регуляции как отношения выработки цитокинов в стимулированной крови к выработке цитокинов в нестимулированной крови.Показатель индекса активности цитокиновой регуляции учитывает изменение реактивности иммунокомпетентных клеток под действием, стимулятора, что позволяет характеризовать их резервную способность вырабатывать цитокины. При индексе активности цитокиновой регуляции больше 3,5 диагностируют нормальное состояние организма без признаков аллергии, при индексе активности цитокиновой регуляции меньше либо равно 3,5 диагностируют аллергический процесс.

Экспериментальным путем по данным анамнеза, результатам клинико-лабораторных исследований, скарификационных кожных проб с бактериальными, грибковыми, пищевыми, эпидермальными, бытовыми аллергенами все обследуемые (111 человек) были разделены на три группы. Контрольную группу составили 25 практически здоровых людей, средний возраст 36,03,8 года, кожные скарификационные пробы были отрицательными, уровень цитокинов находился в диапазоне нормальных значений, индекс активности цитокиновой регуляции значительно больше 3,5 (табл. 1). Вторая группа сформирована из 56 человек в возрасте от 21 до 45 лет (средний возраст 36,02,0 года) без клинических проявлений аллергии, кожные скарификационные пробы были отрицательными, уровень цитокинов значительно повышен, индекс активности цитокиновой регуляции менее 3,5 (табл. 1). Полученные пониженные значения индекса активности цитокиновой регуляции у обследуемых без клинических проявлений, с отрицательными скарификационными кожными пробами позволяют выявить в этой группе возможность развития аллергопатологии на доклиническом этапе. Третья группа состояла из 30 обследуемых в возрасте от 29 до 45 лет (средний возраст 39,03,1 года) с диагнозом: атопическая бронхиальная астма, положительными кожными скарификационными пробами. Длительность заболевания составляла 1,91,0 года. Все больные на момент обследования находились в стадии ремиссии в течение 1-2 месяцев. Индекс активности цитокиновой регуляции резко снижен по сравнению с контрольной группой (3,0), что позволяет считать его критерием развития аллергического процесса (табл. 1).

Дальнейшие наблюдения за группой без клинических проявлений аллергии, с повышенным уровнем цитокинов, индекс активности цитокиновой регуляции менее 3,5 подтвердили наши выводы. В результате дальнейшего обследования через 2 - 2,5 года у 41 человека (73 %) были выявлены клинические проявления аллергопатологии: у 40% наблюдался конъюнктивит, у 21% - слезотечение, у 6% - кожные высыпания в виде крапивницы, у 15% - слизистые выделения из носа. Кожные скарификационные пробы во всех случаях были положительными, уровень цитокинов увеличился, показатель индекса активности цитокиновой регуляции менее 3,0. Таким образом, применение предлагаемого нами критерия - индекса активности цитокиновой регуляции - позволило у 73% обследуемых второй группы прогнозировать развитие аллергопатологии на доклиническом этапе развития.

Пример 1. Обследуемый Ч., 24 года, проходил обследование в клинико-диагностической лаборатории с диагнозом: практически здоров. Кожные скарификационные пробы были отрицательными, лабораторные, клинические и клинико-биохимические показатели находились в пределах нормы. Уровни цитокинов (туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8) значительно повышены, индекс активности цитокиновой регуляции составил 2,9, что свидетельствует о наличии аллергического процесса на доклиническом этапе. Повторное обследование было проведено через 2 года 3 месяца, наблюдались следующие клинические проявления аллергии: конъюнктивит, незначительные слизистые выделения из носа, кожные скарификационные пробы на домашнюю и книжную пыль (++), перо подушки (+++) были положительными, уровень иммуноглобулина Е повышен (460 ME). Уровни цитокинов (туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8) увеличились, индекс активности цитокиновой регуляции составил 2,4, что свидетельствует о развитии аллергического процесса.

Пример 2. Обследуемый Р., 32 года, проходил обследование в клинико-диагностической лаборатории с диагнозом: практически здоров. Кожные скарификационные пробы были отрицательными, лабораторные, клинические и клинико-биохимические показатели находились в пределах нормы. Уровни цитокинов (туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8) значительно повышены, индекс активности цитокиновой регуляции составил 2,8, что свидетельствует о наличии аллергического процесса на доклиническом этапе. Обследуемому были рекомендованы элиминационные мероприятия в быту и мембраностабилизирующие препараты тонического действия по интермиттирующей схеме. Повторное обследование было проведено через 2 года 10 месяцев. Клинические проявления аллергопатологии у данного больного не выявлены, уровни цитокинов (туморнекротизирующего фактора и интерлейкина-8) незначительно повышены, индекс активности цитокиновой регуляции составил 3,4, что свидетельствует о тенденции к нормализации цитокиновой регуляции иммунокомпетентных клеток.

Таким образом, показатель индекса активности цитокиновой регуляции позволяет в ранние сроки и достоверно выявить аллергопатологию на доклиническом этапе, что дает возможность использовать его в клинической практике для выделения групп риска с целью проведения адекватной коррекции нарушений цитокиновой регуляции. Данный способ пригоден для диагностики в медицинских и научных учреждениях.

Список литературы

1. Кетлинский С. А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета // Иммунология. - 1995. - 3. - С. 30-43.

2. Лобкова Ю. С., Калинина Н. М., Лобкова О. С. и др. Цитокиновый профиль при оценке СИТ атопических аллергических заболеваний // Иммунология. - 1998. - 6. - С. 57.

3. Медуницын Н.В. Цитокины и аллергия // Иммунология. - 1999. - 5. - С. 5-9.

4. Намазова Л. С. , Ревякина В. А., Балаболкин И. И. Роль цитокинов в формировании алллергических реакций у детей // Педиатрия. - 2000. - 1. - С. 56-67.

5. Якобишвили М. А., Киселев С. В., Ханферян Р. А. и др. Опосредованная цитокинами регуляция синтеза Ig E Т-лимфоцитами больных атопическими заболеваниями // Иммунология. - 1994. - 4. - С. 49-51.

6. Sanchez-Guerrero I. , Vegara R.P., Herrero N. et al. Cytokine serum profiles in allergic and non-allergic asthma. Increased production ofIL-10 by non-allergic asthmatic patients // Allergol. Immunopathol. (Madr). - 1997. - Vol. 25. - P. 98-103.

7. Shute J.K., Vrugt В., Lindley I.J. et al. Free and Complexed Interleukin-8 in Blood and Bronchial-Mucosa in Asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -1997. - Vol. 155. - P.1877-1883.