культура нервных стволовых клеток, биотрансплантат для аллопересадки и способ его приготовления

Формула изобретения

1. Культура генетически немодифицированных стволовых нервных клеток, полученная из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации.

2. Биотрансплантат для аллопересадки, характеризующийся тем, что он включает нервные стволовые клетки, полученные из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации, выделенные и селективно размноженные до количества 10⁷-10⁹ плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.

3. Способ приготовления биотрансплантата для аллопересадки, характеризующийся тем, что ткань переднего мозга эмбрионов человека 1-го триместра беременности или перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации, с исходной жизнеспособностью клеток не менее 60% и содержанием клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин не менее 15-20%, суспендируют, далее клетки культивируют в бессывороточной среде с добавлением ростовых факторов, неоднократно заменяя среду, образующиеся клеточные агрегаты диссоциируют и нейросферы отделяют.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что клетки культурируют в течение 12-16 дней на чашках Петри при 37^oС в атмосфере 5% СО₂.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что культивирование проводят на среде DMEM/F 12(1:1)+N2 (Gibco BRL, USA) в присутствии ростовых факторов bFGF и/или EDF и включает 4 пассажа.

6. Способ по любому из пп.3-5, отличающийся тем, что клетки выращивают при плотности 2 млн в мл.

7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что замену среды осуществляют каждые 4 дня.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается приготовления культуры генетически немодифицированных нервных стволовых клеток человека для использования в качестве биотрансплантата в реконструктивной нейрохирургии.

Лечение заболеваний и травм центральной нервной системы до настоящего времени является одной из сложнейших задач, стоящих перед медициной. Это обусловлено не только их частотой, но и тяжелыми последствиями: психоневрологическими расстройствами, большим процентом инвалидизации, смертностью. Несмотря на расширение арсенала диагностических возможностей, позволивших углубить представление об этиологии и патогенезе патологических процессов, традиционные методы лечения не всегда позволяют достичь желаемого результата.

Поскольку в основе психических и неврологических нарушений при органическом поражении головного мозга лежит поражение морфологических структур последнего, перспективным представляется использование для лечения этой категории больных оперативного вмешательства с пересадкой стволовых нервных клеток, способных мигрировать в очаг поражения и направленно дифференцироваться в нейроны, астро- и олигодендроглию. Основой для проведения таких операций является иммунологическая привилегированность головного мозга, благодаря которой пересаженный эмбриональный аллотрансплантат не отторгается.

Наибольшее распространение в настоящее время получили пересадки кусочков эмбрионального мозга или суспензии диссоциированной мозговой ткани абортного плода. Однако эти методы имеют следующий ряд недостатков.

Эмбриональный мозг, кроме стволовых клеток, способных при аллопересадке направленно дифференцироваться во все типы нервных клеток, содержит уже дифференцированные клетки, которые являются узко специализированными и не обладают миграционными способностями. Дифференциация клеток фетального мозга начинается на ранних этапах и продолжается в течение всего периода внутриутробного развития. У плодов 17-21 недель гестации, которые использует для получения клеточного трансплантата Г.Т. Сухих (Патент RU 2160112) доля клеток зрелого нейронального фенотипа составляет более 80%. Трансплантат, в основном состоящий из зрелых клеток, оказывает выраженное трофическое действие, активируя оставшиеся неповрежденными отделы мозга, однако в организме реципиента не развивается и в результате погибает. Кроме того, первичная суспензия фетального мозга всегда включает примесь клеток, экспрессирующих антигены гистосовместимости II класса (микроглия, фрагменты кровеносных сосудов, кровяные форменные элементы). Присутствие данного клеточного балласта в трансплантате вызывает нежелательные побочные эффекты (головные боли, фебрилитет, менингеальные симптомы), которые в значительной мере осложняют течение послеоперационного периода.

Применение в качестве трансплантата культуры стволовых клеток позволяет повысить эффективность лечения и избежать нежелательных эффектов.

Линии гомогенных плюрипотентных стволовых клеток человека, полученные в результате клонирования трансформированных клеток эмбрионального мозга (Snyder E. et al., United States Patent 5958767) при нейротрансплантации с высокой эффективностью мигрируют, встраиваются в очаг поражения и развиваются в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Однако иммортализованные клеточные линии, являясь идеальным инструментом для научных экспериментов на лабораторных животных, едва ли смогут найти применение в медицине.

Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности лечения органических поражений и травм центральной нервной системы, устранение побочных эффектов при пересадке клеточных биотрансплантатов.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Предложена культура генетически немодифицированных нервных стволовых клеток, полученная из ткани переднего мозга эмбрионов человека 1-ого триместра беременности, или перивентрикулярной области головного мозга плодов 15-20 недель гестации.

Кроме того, предложен биотрансплантат, включающий указанную культуру стволовых клеток, селективно размноженных в условиях культивирования до количества 10⁷-10⁹ плюрипотентных недифференцированных клеток в составе нейросфер.

Кроме того, предложен способ приготовления биотрансплантата для аллопересадки, характеризующийся тем, что ткань переднего мозга эмбрионов человека 1-ого триместра беременности или из перивентрикулярной области головного мозга плодов человека 15-20 недель гестации с исходной жизнеспособностью клеток не менее 60% и содержанием клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин не менее 15-20%, суспендируют, далее клетки культивируют в бессывороточной среде с добавлением ростовых факторов, неоднократно заменяя среду, образующиеся клеточные агрегаты диссоциируют и нейросферы отделяют. При этом клетки культивируют в течение 12-16 дней на чашках Петри при 37^oС в атмосфере 5% СО₂. Культивирование проводят на среде DMEM/F12 (1: 1)+N2 (Gibco BRL, USA) в присутствии ростовых факторов bFGF и/или EGF и включает 4 пассажа. Клетки выращивают при плотности 2 млн в мл. Замену среды осуществляют каждые 4 дня.

Для приготовления биотрансплантата используют фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и трансфузионных инфекций женщин. В целях сохранения целостности эмбриона аборт производят вакуумэкстракцией (на сроках до 12 недель) и методом трансабдоминального амниоцентеза в случаях позднего прерывания (15-20 недель). Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа проводится в стерильных условиях ламинарного бокса. Мозговую ткань измельчают многократным пипетированием до получения одноклеточной суспензии.

Биоматериал для культивирования отбирают с жизнеспособностью клеток не менее 60% в стандартном тесте с трипановым синим. В реальной практике получить препараты абортного мозга с исходной очень высокой жизнеспособностью (более 90%), необходимой для успешного культивирования, удается крайне редко.

Метод отделения живых клеток 3-4-кратным низкоскоростным центрифугированием позволяет увеличить долю живых клеток и довести жизнеспособность материала для культивирования до 90-95%. В образцах суспензий, соответствующих требованиям по жизнеспособности, определяют долю клеток, экспрессирующих маркер стволовых клеток нестин. Кондиционными считаются культуры, в которых нестинположительных клеток не менее 15-20%.

Культивирование НСК производится в течение 12-16 дней и включает проведение 4-х пассажей. Подобранные нами экспериментально условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим (длительность) культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

- Концентрация нестин-экспрессирующих клеток возрастает в 3-5 раз, что в конечной культуре составляет в среднем более 80%. Таким образом, культура НСК после четырехкратного пассирования представляет собой суспензию клонов НСК (нейросфер) с незначительной примесью одиночных клеток, легко удаляемых после кратковременного центрифугирования

- Выбранная нами продолжительность культивирования в условиях бессывороточной среды достаточна для практически полной гибели балластных клеточных элементов: дифференцированных нервных клеток, а также примесных иммунокомпетентных клеток (микроглия, кровяные элементы), которые всегда присутствуют в первичной суспензии диссоциированной мозговой ткани.

- Проведение четырехкратного пассирования культур нервных эмбриональных клеток в селективной среде позволяет получить "урожай" нейросфер НСК, которые, с одной стороны, обладают признаками стволовых клеток (мультипотентность, клональный рост, способность к пролиферации in vitro) и, с другой стороны, представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, что увеличивает терапевтические возможности при трансплантации.

Культивирование НСК проводят по следующей методике.

Суспензию первичных диссоциированных нейральных клеток, полученных из эмбрионального мозга, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в бессывороточной среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12 (1: 1, Gibco BRL) + N2 (Gibco BRL) с добавлением ростовых факторов bFGF (10-20 мкг/мл, Sigma) и /или EGF (10-20 мкг/мл, Sigma). Замену среды производят через каждые 4 дня. Образующиеся клеточные агрегаты ежедневно диссоциируют пипетированием. Нейросферы, состоящие из стволовых клеток, отделяют кратковременным центрифугированием.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после криоконсервации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид (DMSO).

Патентуемая технология может использоваться для лечения наследственных заболевания ЦНС у детей, травм головного и спинного мозга, демиелинизирующих заболеваний, травм и нейродегенеративных заболеваний сетчатки глаза, возрастных нейродегенеративных и нейромышечных заболеваний.

Конкретный пример использования биотрансплантата.

Больной А., 8 лет. В результате автотравмы произошел вдавленный перелом левой теменной кости; ушиб-сдавление головного мозга; субдуральная гидрома справа (60 мл); субдуральная гематома слева (30 мл). В 20 ГБ проведена экстренная операция: слева резекционная трепанация черепа, удаление гематомы; справа фрезотомия, удаление гидромы.

4 дня после травмы - кома I степени, ИВЛ, тонические судороги, расходящееся косоглазие, фиксация взора вправо, анизокория d>s, левосторонний гемипарез, трофические нарушения (пролежни), зондовое кормление. Глазное дно - нечеткие границы ДЗМ - справа.

11 дней после травмы - кома I степени, ИВЛ, неврологический статус с небольшой положительной динамикой, регресс судорог, расходящееся косоглазие, отризм, анизокория. НСГ - сохранение отека головного мозга.

15 дней после травмы - тонические судороги, кома I степени.

18 дней после травмы - компьютерная томография: симметричная гидроцефалия, эпидуральная гематома теменной области слева.

20 дней после травмы - сопор, кратковременная фиксация взора, желудочный зонд удален; самостоятельно глотает; гемипарез левосторонний с контрактурой в локтевом суставе, тугоподвижность в голеностопных s>d; гиперхинизм; трофические нарушения.

В течение 1 месяца очень медленная динамика в установлении сознания, выраженные пирамидные и экстрапирамидные нарушения, к концу 2 месяца после травмы появилось понимание обращенной речи, выполнение отдельных инструкций без активной речевой продукции, негативное отношение к осмотру, двигательная активность в пределах кровати - не садится, не встает, опоры нет. На ЭЭГ - грубые общемозговые нарушения в виде дизритмии среднего вольтажа, отсутствие основного ритма, преобладание медленной активности 5-6 Гц амплитудой 50-100 мкВ, более четко при спектральном анализе. Периодически генерализованные разряды 4-5 Гц 200 мкВ с глубинных структур s>d.

Проведена вентрикулярная пункция с введением биотрансплантата нервных стволовых клеток (100 млн клеток в объеме 4 мл).

К концу недели после пересадки клеток значительная динамика в восстановлении психической активности, речевой продукции: стал говорить предложениями с живой эмоциональной окраской; стал читать, осмысленно улыбается, считает с переходом через 10. Передвигается при поддержке.

На ЭЭГ - отчетливая положительная динамика: основной ритм 8-9 Гц 50-100 мкВ в теменно-затылочных отведениях с адекватной реакцией на афферентные раздражители. Пароксизмальная активность глубинного генеза.

Таким образом, в течение 2 недель после подсадки наблюдали положительную динамику в восстановлении интеллектуальной, речевой, двигательной активности. Восстановление биоэлектрической активности мозга по ЭЭГ, близкой к возрастной норме.