способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии
Классы МПК: | G01N33/50 химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) |
Автор(ы): | Зайцева Н.В., Уланова Т.С., Карнажицкая Т.Д., Сыпачева А.М. |
Патентообладатель(и): | Пермский научно-исследовательский клинический институт детской экопатологии |
Приоритеты: |
подача заявки:
2001-05-24 публикация патента:
20.09.2002 |
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям. Способ обеспечивает расширение спектра определяемых компонентов из одной пробы мочи, повышение чувствительности и точности определения. Обрабатывают анализируемую пробу солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и гексаном, гексановый экстракт высушивают, высушенный остаток растворяют в потоке элюента, состоящего из смеси ацетонитрила и воды при их объемном соотношении 60 : 40, и определяют содержание альдегида по калибровочному графику, при этом перед введением гексана в пробу последнюю подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН=1-2, а растворение высушенного остатка производят в элюенте, дополнительно содержащем по объему 2,0-2,5% ледяной уксусной кислоты и 1,0-1,5% диэтиламина. 2 з.п.ф-лы, 3 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3
Формула изобретения
1. Способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, включающий последовательную обработку анализируемой пробы солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и гексаном, выделение гексанового экстракта, его высушивание, растворение высушенного остатка в потоке элюента, состоящего из смеси ацетонитрила и воды при их объемном соотношении 60 : 40, и определение содержания альдегида по калибровочному графику, отличающийся тем, что перед введением гексана в пробу, последнюю подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН= 1-2, а растворение высушенного остатка производят в элюенте, дополнительно содержащем по объему 2,0-2,5% ледяной уксусной кислоты и 1,0-1,5% диэтиламина. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что скорость потока элюента составляет 100 мкл/мин. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высушивание гексанового экстракта производят ИК-лампой.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике экологически обусловленной патологии, вызванной альдегидами, в лабораториях биохимии, специализированных учреждениях и клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений. Большая часть современных методов определения альдегидов представлена колориметрическими методами определения формальдегида и ацетальдегида в различных субстратах, например, при взаимодействии с хромотроповой или фуксинсернистой кислотой. При наличии формальдегида или ацетальдегида в пробе появляется характерное окрашивание, по интенсивности которого определяют содержание альдегида в пробе. Чувствительность указанных известных методов составляет 0,03 мкг в пробе (см., например, В.Ф.Крамаренко "Токсикологическая химия", Киев, Изд-во "Выща школа", 1989 г., с. 127; И.Д.Гадаскина и др. "Превращение и определение промышленных органических ядов в организме"., Л., Изд-во "Медицина", 971 г., с. 153). Недостатком указанных известных способов является неспецифичность определения альдегидов, т. к. реакция взаимодействия с вышеуказанными кислотами, положенная в основу известных способов, характерна и для других альдегидов и кетонов и позволяет определять лишь их сумму. Известен также способ определения ацетальдегида в биосредах (крови и моче) методом газохроматографического анализа равновесной паровой фазы. Согласно этому способу биологическую жидкость нагревают до образования равновесной паровой фазы и анализируют газовую фазу на газовом хроматографе. Например, описан метод раздельного количественного определения этанола и этаналя в одной пробе биологического материала газохроматографическим методом в паровой фазе в интервале 0,01-5,0 мкг/мл. Чувствительность метода составляет 0,01 мкг/мл, погрешность -![способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, патент № 2189596](/images/patents/281/2189020/177.gif)
![способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, патент № 2189596](/images/patents/281/2189020/177.gif)
![способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, патент № 2189596](/images/patents/281/2189039/8805.gif)
добавлении в элюирующую жидкость модификаторов в количестве 2,0-2,5 об.% уксусной кислоты и 1,0-1,5 об. % диэтиламина обеспечивается эффективное разделение 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и увеличение чувствительности определения альдегидов из одной пробы. При осуществлении предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- берут пробу мочи, содержащую формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегид;
- добавляют солянокислый раствор 2,4-динитрофенилгидразина;
- вводят концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1-2;
- затем в пробу мочи добавляют гексан и смесь встряхивают в течение 10 минут для проведения экстракции образующихся 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов;
- после расслоения жидкостей отбирают верхний (гексановый) слой и центрифугируют;
- отбирают аликвотную часть экстракта и высушивают под ИК-лампой;
- высушенный остаток растворяют в элюенте, содержащем ацетонитрил и воду в объемном соотношении 60:40, а также добавленных к этому количеству 2,0-2,5 об. % ледяной уксусной и 1.0-1,5 об.% диэтиламина, и подвергают хроматографическому анализу;
- количество альдегидов определяют с использованием калибровочного графика, который строят методом абсолютной калибровки. Пример 1. Брали 50 см3 мочи, содержащей формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегид. В эту пробу добавляли 2,5 мл 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте и 0,2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Затем добавляли гексан в количестве 5 мл. Полученную смесь встряхивали в течение 10 минут для лучшего осуществления экстракции гексаном образующихся 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов. Полученный экстракт центрифугировали для лучшего разделения фаз в течение 20 мин со скроростью 1500 об/мин. Отбирали 2,0 мл гексанового экстракта, высушивали его под ИК-лампой досуха, остаток растворяли в элюенте и анализировали на жидкостном хроматографе "Милихром-4" в ультрафиолетовом свете при длине волны 360 нм на колонке 8 см х 3 мм, заполненной Диасорб C16. При этом элюент, содержащий растворители: ацетонитрил: вода=60:40 (по объему)+2,5 об. % ледяной уксусной кислоты +1,0 об.% диэтиламина, прогоняли через колонку со скоростью 100 мкл/мин. Затем, используя ранее построенные калибровочные графики, проводили количественное определение формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче. Для построения калибровочных графиков использовали пробы мочи, отобранные у контрольной группы детей, проживающих в экологически благополучной местности, и содержащие заданные концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов. Определение проводили аналогично примеру 1 за исключением того, что при построении калибровочных графиков полученный остаток, растворенный в элюенте, - стандартный раствор каждой пробы, анализировали на хроматографе не менее 5 раз. В результате проведенных лабораторных исследований было установлено, что чувствительность определения формальдегида, ацетальдегида и пропионового альдегида в моче предлагаемым способом составляет 0,001 мкг/см3, масляного альдегида - 0,0009 мкг/см3. Также в ходе лабораторных испытаний устанавливали точность (относительную погрешность) определения предлагаемым способом концентраций формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче при их совместном присутствии. Полученные данные приведены в таблице 3. Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что погрешность определения формальдегида предлагаемым способом составляет 7,24%, ацетальдегида - 9,67%, пропионового альдегида - 7,91%, масляного альдегида - 9,81%. Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегиды в моче при их совместном присутствии в пробе. Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения по формальдегиду в 89 раз по сравнению с прототипом.
Класс G01N33/50 химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)