применение снижающих активность эффекторов дипептидил пептидазы (dp iv) и соответственно энзима dp iv с аналогичной активностью для снижения уровня сахара в крови

Формула изобретения

1. Применение снижающих активность эффекторов дипептидил пептидазы (DP IV) и соответственно энзима DР IV с аналогичной активностью для снижения уровня сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма млекопитающего.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что назначение эффекторов DP IV и соответственно DP IV с аналогичной энзиматической активностью млекопитающему предотвращает или смягчает патологические аномалии обмена веществ организмов млекопитающих, такие, как глюкозурия, гиперлипидемия, метаболические ацидозы и сахарный диабет.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что в качестве эффекторов дипептидил пептидазы (DP IV) и соответственно DP IV с аналогичной энзиматической активностью используют ингибиторы, субстраты, псевдосубстраты, ингибиторы DP IV-экспрессии, связывающие протеины или антитела этих энзимпротеинов или комбинации названных эффекторов.

4. Применение снижающих активность эффекторов дипептидил пептидазы (DP IV) и соответственно энзима DP IV с аналогичной активностью в способе снижения уровня сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке организма млекопитающего.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к простому способу для снижения концентрации сахара в крови с помощью эффекторов со сниженной активностью (субстратов псевдосубстратов, ингибиторов, протеинов связи антител и др.) для энзимов со сравнимой или идентичной активностью по отношению к энзиматичной активности энзима дипептидил пептидазы IV.

Наряду с протеазами, которые включены в неспецифический протеолиз, что в конечном счете вызывает расщепление протеинов до аминокислот, известны регуляторные протеазы, которые участвуют в функционировании (активирование, деактивирование, модулирование) эндогенных пептидных активных веществ [KIRSCHKE, H. , LANGNER, J. , RIEMANN, S., WIEDERANDERS, В, ANSORGE, S. и BOHLEY, R. , Lysosomal cysteine proteases. Excerpta Medica (Ciba Foundation Symposium 75), 15 (1980); KRAUSSLICH, H.-G. и WIMMER, E., Вирусная протеиназа. Ann. Rev. Biochem. 57, 701 (1987)]. В частности, в связи с иммунным исследованием и нейропептидным исследованием был открыт ряд таких так называемых конвертаз сигналпептидаз или энкефалиназ [COMEZ, S.GLUS CHANKOF, P., LEPAGE, A., MARRAKCHI, N., и COHEN, Р., Proc. Natl. Acad. Sci. США 85, 5468 (1988); ANSORGE, S., и SCHN, E., Histochem. 82, 41 (1987)].

На основании многочисленных случаев аминокислоты пролина в большом количестве пептидных гормонов и связанных с этим структурных свойств этих пептидов обсуждается для пролинспецифических пептидаз функция, аналогичная сигнальным пептидазам [YARON, А., Роль пролина в протеолитическом регулировании биологических активных пептидов. Биополимеры 26, 215 (1987); WALTER, R., SIMMONS, W. H. и YOSHIMOTO, Т., Специфические пролины эндо- и эксопептидаз. Mol. Cell, Biochem. 30, III (1980); VANHOOF, G., GOOSSENS, F., DE MEESTER, I. , HENDRIKS, D., и SCHAPPE, S., Структурные группы пролина и их биологическая обработка. FASEB Журнал 9, 736 (1995)]. При этом пролин в этих пептидах благодаря его особой структуре, такой как конформация и стабильность этих пептидов, определяют тем, что их перед расщеплением защищают неспецифическими протеазами [KESSLER, Н., Конформация и биологическое действие циклических пептидов. Angew. Chem. 94, 509 (1982). Энзимы, которые, напротив, высокоспецифично и структуроизменяюще влияют на содержание пролин последовательности (Н^IV-протеаза, циклофилин и др.), являются атрактивными целями актуального исследования активного вещества. В частности, для расщепляющих после пролина пептидаз пролил эндопептидазы (PEP) и дипептидил пептидазы IV (DP IV) можно бы установить связь между модуляцией биологической активности природных пептидных субстратов и их избирательным расщеплением вероятно путем этих энзимов. Так, предполагают, что PEP играет роль при изучении или в процессе памяти и DP IV используют в передаче сигнала во время иммуноответа [ISHIURA, S., TSUKAHARA, Т., TABIRA, Т., SHIMIZU, Т., ARAHATA К., и SUGITA, Н. , FEBS- Letters 260, 131 (1990); HEGEN, M., NIEDOBITEK, G., KLEIN, C.E., STEIN, Н. и FLEISCHER, В., Журнал иммунологии 144, 2908 (1990)].

Подобным образом как исключительную пролиновую специфичность этих энзимов обсуждают их высокую избирательность для аминокислоты аланина в пределах типичных областей диагностирования в субстратах этих энзимов, в связи с чем подобные конформации могут принимать аланинсодержащие пептиды, как аналогичные по структуре пролинсодержащие пептиды. Недавно были доказаны подобные свойства аланинсодержащих пептидных цепей путем пунктуальной мутации (обмен пролина на аланин) [DODGE, R.W. и SCHERAGA, Н.А., Folding and unfolding kinetics of the proline-to-alanine mutants of bovine pancreatic ribonuclease A. Biochemistry 35 (5) 1548-(1996)].

DP IV- или аналогичная DP IV-активность (напр. цитозолическая DP II имеет почти идентичную DP IV-специфичность субстрата) имеет место в кровообращении, где она отщепляет высокоспецифичные дипептиды от N-конца биологически активных пептидов, если пролин или аланин представляют собой соседние остатки N-концевых кислот в их последовательности. Поэтому исходят из того, что этот энзим принимает участие в регулировании полипептидов in vivo [VANHOOF, G. , GOOSS ENR, F., DE MEESTER, I., HENDPIKS, D. и SCHARRE, S., Структурные группы пролина и их биологический процессинг, FASEB Журнал 9, 736 (1995)].

Зависимые от глюкозы инсулинотропные полипептиды: желудочные ингибиторы полипептиды 1-42 (GIР_1-42) и глюкагон-лайк пептид амиды-I 7-36 (GLP-I_7-36), гормоны, которые стимулируют индуцируемое глюкозой выделение инсулина поджелудочной железы (также инкретина), представляют субстраты DP IV, так как он может отщеплять от N-терминальных последовательностей этих пептидов дипептид тирозинил-аланин соответственно гистидилаланин in vitro и in situ [MENTIEIN, R. , GALLWITZ, В., и SCHMIDT, W. E. Дипептидил пептидаза IV гидролизует желудочный ингибитор полипептида, глюкагон-лайк пептид-I (7-36)амид, упомянутый пептид гистидина и отвечает за их деградацию в сыворотке человека. Eur. J.Biochem.214.829 (1993)].

Снижение подобной DP IV- или аналогичной DP IV-активности энзима для расщепления таких субстратов in vivo может служить при этом для того, чтобы эффективно подавлять нежелательную активность энзима как в лабораторных условиях, так и в патологических состояниях организмов млекопитающих [DE-MUTH, H. -U., Новые теории в необратимом торможении серина и цистеин-протеаз. J. Ensyme Inhibition 3,249-278 (1990); DEMUTH, H.-U. и HEINS, J., О каталитическом механизме дипептидил пептидазы IV в дипептидил пептидазе IV (CD26) в метаболизме и иммуноответ (B. Fleischer, Ед) R.G. Landes, Biomedical Publishers, Georgetown, 1-35 (1995). Например, сахарный диабет типа II (также старческий диабет) основывается на уменьшенной секреции инсулина соответственно на нарушениях функции рецепторов, которые обоснованы среди прочего на протолитически обусловленных аномалиях концентрации инкретина [BROWN, J. C. , DAHL, М., KWAW K,S., MCINTOSH, C.H.S., ОТТЕ, S.C. и PEDERSON, R.A. Пептиды 2,241 (1981); SCHMIDT, W.E., SIEGEL E.G., GALLWITZ, B. KUMMEL, H., EBERT, R. и CPEUTZFELDT, W., Характеристика инсулинотропной активности фрагментов, образованных желудочными ингибиторами полипептида. Диабетология 29, 521А (1986); ADELHORST, К., HEDEGAAPD, В.В., KNUDSEN, L.B. и KIRK, О., Исследования структурной активности глюкагон-ляйк-пептида. J. Biol.Chem. 296, 6275 (1994)].

Гипергликемию и связанные с этим причины соответственно следствия (также сахарный диабет) согласно современному уровню техники лечат применением инсулина (например, выделенного из поджелудочной железы крупного рогатого скота или также полученного методом генной инженерии материала для заболевших организмов в различных формах введения). Все известные до сих пор, также и современные способы отличаются высокими затратами материала, высокими расходами и часто значительными ухудшениями жизненного уровня пациентов. Классический метод (ежедневная внутривенная инъекция инсулина, обычный метод с тридцатых годов) лечит острые симптомы заболевания, но после длительного применения приводит к тяжелым изменениям кровеносных сосудов (артериосклероз) и к нарушениям нервной системы [LACY, Р., Состояние трансплантации клетки. Диабет под наблюдением врача 16 (3) 76 (1993)].

За последнее время предлагали оборудование подкожных депо-имплантатов (отдачу инсулина производят дозировочно, и ежедневные инъекции отпадают), а также имплантацию (трансплантацию) интактных клеток Лангерханшера в поджелудочную железу с нарушенной функцией или в другие органы и в ткань. Подобные трансплантации связаны с технологическими затратами. Кроме того, они представляют собой угрозу, связанную с риском хирургического вмешательства в организм реципиента и требуют также при пересадке клеток методов для подавления соответственно обхода иммунной системы [LACY, P., Лечение диабета с трансплантированными клетками. Sci.Americ. 273 (I) 40-46 (1995)].

Возможно оральное применение низкомолекулярных, с высокой степенью сродства ингибиторов энзимов, напротив, является требующей меньших затрат альтернативой, например, для инвазивных хирургических методов при лечении патологических симптомов. Подобные ингибиторы энзимов находят теперь применение в терапии как иммуносупрессоры, антитромбические средства и как средства против вируса AIDS-(синдрома приобретенного иммунодефицита). Благодаря химическому плану свойств стабильности, транспортировки и очистки можно изменять их принцип действия и согласовывать с индивидуальными свойствами [SANDLER, М. и SMITH, H.J., Hrsg., Design of Enzyme Inhibitors as Drugs., типография Оксфордского Университета, Оксфорд (1989): MUNROE, J.E., SHEPHERD, Т. A. , JUNGHEIM, L.N., HORNBACK, W.J., HATCH, S.D., MUESING, M.A., WISKERCHEN, M.A., SU, K.S., CAMPANALE, K.M., BAXTER, A.J., и COLACINO, J.M., Potent, orally bioavailable HIV-I protease inhibitors containing noncoded D-amino acids. Bioorg. Medicinal Chem.Letters 5 (23) 2897 (1995)].

Целью изобретения является простой и новый способ для снижения уровня глюкозы в крови, который согласно изобретению можно достигать тем, что с помощью назначения эффекторов млекопитающему, в причинной последовательности, эндогенные (или назначенные дополнительно экзогенные) инсулинтропные пептиды GIP_1-42 и GLP-I_7-36 (вышеприведенные GLP-I_7-36 или их аналоги) расщепляются с помощью DP IV- или DP IV-подобных энзимов в меньшей степени и тем самым сокращается или замедляется спад концентрации этих пептидов или их аналогов.

В основе изобретения лежит неожиданное заключение, что снижение действующей в кровообращении DP IV- или DP IV-подобной энзиматической активности по этой причине ведет к влиянию на уровень сахара в крови. Было найдено, что

1. Уменьшение DP IV- или DP IV-подобной активности влечет за собой относительное повышение стабильности стимулированной глюкозы или поступившего извне инкретина (или его аналога); т.е. применением эффекторов DP IV- или DP IV-аналогичных протеинов можно контролировать расщепление инкретина в крови.

2. Повышенная биологическая стабильность к распаду инкретинов (или их аналогов) влечет за собой изменение действия эндогенного инсулина.

3. Достигнутое снижение DP IV- соответственно DP IV-аналогичной энзиматичной активности в крови дает повышение стабильности инкретинов в последующем изменении вызванного глюкозой действия инсулина, и это приводит к контролируемому с помощью DP IV-эффекторов модулированию уровня глюкозы в крови.

Изобретение относится, следовательно, к применению эффекторов дипептидил пептидазы IV (DP IV- и соответственно DP IV-аналогичной энзиматической активности) для снижения уровня сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке млекопитающего. В частности, изобретение относится к применению эффекторов DP IV- и соответственно DP IV-аналогичной энзиматической активности у млекопитающих для предотвращения или смягчения патологических аномалий обмена веществ у млекопитающих; эти аномалии включают глюкозурию, гиперлипидемию, метаболические ацидозы и сахарный диабет. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу снижения уровня сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке млекопитающего, который отличается тем, что млекопитающему назначают терапевтически эффективное количество эффектора DP IV- и соответственно DP IV-аналогичной энзиматической активности.

Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к эффекторам DP IV- и соответственно DP IV-аналогичной энзиматической активности для применения в способе для снижения уровня сахара в крови при характерной для гипергликемии концентрации глюкозы в сыворотке млекопитающего.

Используемые по изобретению эффекторы DP IV- и соответственно DP IV-аналогичных энзимов можно использовать в употребляемых в фармацевтике комплексах препаратов как ингибиторы, субстраты, псевдосубстраты, ингибиторы Dp IV-экспрессии, связывающие протеины или антитела этих ферментных протеинов или комбинаций из этих различных веществ, которые снижают DP IV- или DP IV-аналогичную протеиновую концентрацию в организме млекопитающего. Согласно изобретению эффекторы представляют собой, например, DP IV-ингибиторы, такие как производные дипептида или миметического дипептида аланил-пиролидила, изолейцил-тиазолидида и псевдосубстрат N-валил-пролила, O-бензоил гидроксиламин. Подобные соединения известны из литературы [DEMUTH, H.-U., Новые теории в необратимом торможении серина и цистеин-протеаз. Журнал. Торможение ферментов 3, 249 (1990)] или их можно получать по аналогии с описанными в литературе методами.

Способ согласно изобретению представляет собой новый подход для снижения повышенной концентрации глюкозы в крови в сыворотке млекопитающих. Он простой, коммерциально приемлем и пригоден при применения в терапии, особенно при лечении заболеваний, которые основываются на величинах глюкозы в крови выше средних, в медицине человека.

Эффекторы назначают в форме фармацевтических препаратов, содержащих действующее начало в комбинации с обычными известными из уровня техники веществами-носителями. Например, их применяют парентерально (например, i.v., в физиологическом растворе хлористого натрия) или энтерально (например, орально, в комбинации с обычными веществами-носителями, как например глюкоза).

В зависимости от их эндогенной стабильности и их биоготовности следует назначать однократные или также многократные дозы эффекторов, чтобы достигнуть желательной нормализации величин глюкозы в крови, например в случае аминоацил-тиазолидидов такая область дозировки может составлять между 1,0 мг и 10,0 мг эффектора на 1 кг веса пациента.

Примеры осуществления изобретения.

ПРИМЕР 1: Ингибирование катализированного DP IV гидролиза инкретина GIP_1-42 и GLP-I_7-36 in situ.

Как in vitro (в пробирке) с очищенным энзимом, так и в in situ (в организме), например в собранной сыворотке человека, можно обнаруживать или подавлять с помощью ингибиторов (фиг.1) гидролиз инкретина, вызванный DP IV- или DP IV-аналогичной активностью.

Согласно изобретению (см. фиг.1) достигают in situ при инкубировании 30 мкмоль GIP_1-42 или 30 мкмоль GLP-I_7-36 и 20 мкмоль изолейцилтиазолидида (1a), обратного DP IV-ингибитора в 20%-ной сыворотке, при рН 7,6 и при 30^oС, полного подавления катализированного энзимом гидролиза обоих пептидных гормонов в течение 24 часов (1b и 1c, соответственно верхние спектры). Синтетический GIF_1-42 (5 мкмоль) и синтетический GLP_7-36 (15 мкмоль) инкубировали с сывороткой человека (20%) в 0,1 ммоль буферном растворе ТРИЦИНА при рН 7,6 и при 30^oС 24 часа. Пробы инкубационных исходных смесей (для GIP_1-42 2,5 пмоль и в случае GLP-I_7-36 7,5 пмоль) вынимали после различных периодов времени. Пробы совместно кристаллизовали с 2",6"-дигидроксиацетофеноном как матрицей и анализировали с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Спектры (фиг. 1) представляют собой аккумуляции 250 отдельных лазерных попаданий на одну пробу.

(1b). Сигналы в области m/z 4980.15.3 соответствуют GIР_1-42 (М 4975.6) и m/z 4745.25,5 Р IV продукту гидролиза GIP_3-42 (М 4740.4).

(1c). Сигналы в области m/z 3325.01,2 соответствуют GLP-I_7-36(M 3297.7) и m/z 3116.71.3 соответствуют продукту DP IV-гидролиза GLP-I_9-36 (M 3089.6).

В опытных исходных смесях без ингибитора инкретины за это время почти полностью расщеплялись (фиг.1b и 1c, соответственно нижние спектры).

ПРИМЕР 2: Ингибирование расщепления GLP-I_7-36DP IV-ингибитором изолейцил-тиазолидида in vivo (в живом организме).

Если наблюдают метаболизм нативных инкретинов (здесь GLP-I_7-36) в сыворотке крысы в присутствии DP IV-ингибитора изолейцил-тиазолидида (внутривенная инъекция 1,5 мкмоль раствора ингибитора в 0,9%-ном растворе хлористого натрия) в противоположность контрольному опыту, то при концентрации ингибитора изолейцил-тиазолидида около 0,1 мг/кг лабораторной крысы у обработанных ингибитором подопытных животных (n=5) в ходе опыта нельзя было наблюдать никакого расщепления инсулинотропного пептидного гормона GLP-I_7-36 (фиг.2).

Для обнаружения метаболитов в присутствии или в отсутствие DP IV-ингибитора (через 20 минут после предыдущей внутривенной дозы ингибитора или раствора хлористого натрия) подопытные и контрольные животные получали внутривенно 50-100 пмоль ¹²⁵I-GLP-I_7-36 (специфическая активность около 1 мкМ Ci/рМ). Анализы крови отбирали через 2-5 минут и плазму экстрагировали с помощью 20% ацетонитрила. Затем пептидный экстракт разделяли с помощью RP-HPLC-хроматографии и анализировали радиоактивность фракций на -счетчике. Найденная активность указана в cpm (счет импульсов в минуту по отношению к максимуму).

ПРИМЕР 3: Модуляция действия инсулина и снижения уровня глюкозы в крови после внутривенного применения DP IV-ингибитора изолейцил-тиазолидида in vivo (в живом организме).

На стимулированной путем интрадуоденальной инъекции (i. d.) глюкозы крысе можно наблюдать при внутривенном назначении различных DP IV-эффекторов, например 0,1 мг изолейцил-тиазолидида на кг крысы, уменьшающее действие ингибитора, начинающееся по времени с задержкой снижение уровня глюкозы. Этот эффект является зависимым от дозы и после прерывания инфузии 0,05 мг/мин DP IV-ингибитора изолейцил-тиазолидида на кг крысы является обратным. Внутривенное применение одинакового количества глюкозы обработанных ингибитором и контрольных животных не показывает, в противоположность стимулированным интрадуоденальной инъекцией подопытных животных, никакого сравнимого действия.

Фиг. 3 наглядно поясняет эти связи с зависимыми от ингибиторов изменениями параметров плазмы: А - DP IV-активность, В - плазма - уровень инсулина, С - уровень глюкозы к крови. Подопытные животные (n=5, крысы мужского пола Wistar, 200-225 г) получали в качестве начальной дозы 1,5 мкМ изолейцилтиазолидида в 0,9%-ном растворе хлористого натрия или одинаковые объемы 0,9%-ного раствора хлористого натрия без ингибитора () (контрольная группа n= 5). Затем подопытная группа получала инфузию ингибитора 0,75 мкМ/мин в течение 30 минут опыта (*). Контрольной группе за такое же время вливали не содержащий ингибитора 0,9%-ный раствор хлористого натрия. К моменту t=0 животные получали интрадуоденальной инъекцией дозу глюкозы 1 г/кг 40%-ного раствора декстрана (вес/объем).

У всех подопытных животных брали анализы крови с интервалами 10 минут. Измерения глюкозы проводили на цельной крови (Lifes-can One Touch II-анализатор), в то время как DР IV-активность и концентрации инсулина определяли в плазме.

Используемый здесь инсулин-тест чувствителен между 10 и 160 мu/мл [PEDERSON, R.A., BUCHAN, A.M.J., ZAHEDI-ASH.S., CHEN, С. D.L.BROWN, J.C.Reg. Пептиды. 3,53-63 (1982)]. DP IV-активность определяли методом спектральной фотометрии [DEMUTH, H.-U. и HEINS, J., On the catalytic Mechanism of Dipeptidyl Peptidase IV, in Dipeptidyl Peptidase IV (CD 26) in Metabolism and the Immune Response (B. Fleischer, Ed.) R.G. Landes, Biomedical Publishers Georgetown, 1-35 (1995)]. Все измерительные величины указаны как средние величины со стандартным отклонением.