способ получения средства для диагностики целиакии

Формула изобретения

Способ получения средства для диагностики целиакии, отличающийся тем, что получают глютен путем гидролиза белков пшеничной муки, которую соединяют с водой, отстаивают в течение 10 мин, надосадочную жидкость инактивируют при 53^oС до получения сухого порошка, который экстрагируют 70%-ным раствором этилового спирта, полученный раствор центрифугируют 10 мин при 1000 об. /мин, повторно инактивируют надосадочную жидкость при 53^oС до получения сухого порошка, содержащего глиадин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и касается способа получения средства, которое используется в нагрузочных иммунологических тестах для диагностики целиакии.

В доступной патентной и медицинской литературе не описан способ получения средства для диагностики целиакии.

Известен способ диагностики целиакии с помощью иммуноферментного анализа на основе Швейцарских тест-систем на выявление антител (в венозной крови) к глиадину (Ю. Г. Мухина, С.В. Бельмер, Т.В. Гасилина и др. Определение антиглиадиновых антител при целиакии у детей //Педиатрия. - 5. -1995. - С.9-12).

Недостатки: способ дорогостоящий, многоэтапный, требует специального оборудования (мультискан).

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение, удешевление диагностики целиакии путем создания средства для этой цели.

Указанная задача достигается путем экстрагирования глютена, полученного путем гидролиза белков клейковины пшеницы, 70%-ным раствором этилового спирта, центрифугирования полученного раствора в течение 10 мин при 1000 об. /мин, инактивации надосадочной жидкости при 53^oС до получения сухого кристаллического порошка, содержащего глиадин. Полученный глиадин используют в концентрации 0,5 мкг/мл в иммунологических нагрузочных тестах для диагностики целиакии и при угнетении Т-клеточного звена иммунитета и фагоцитарной функции лейкоцитов определяют данное заболевание.

Способ осуществляют следующим образом.

Рассчитанное количество пшеничной муки соединяют с дистиллированной водой, перемешивают и отстаивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем надосадочную жидкость, свободную от балластных веществ, разливают в чашки Петри и инактивируют при 53^oС до получения сухого вещества, которое содержит глютен, экстрагируют его 70%-ным раствором этилового спирта, полученный раствор центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин. Полученную надосадочную жидкость разливают в чашки Петри, инактивируют при 53^oС до получения сухого кристаллического бесцветного порошка, содержащего глиадин. Глиадин используют в концентрации 0,5 мкг/мл в иммунологических нагрузочных тестах: тотального Е-розеткообразования, в реакциях определения фагоцитарной функции лейкоцитов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. 90,0 г пшеничной муки высшего сорта помещают в емкость, заливают 500 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и отстаивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разливают в 5 чашек Петри, инактивируют при 53^oС до получения сухого вещества, содержащего плотен (белок клейковины пшеницы). Полученное вещество экстрагируют 96 мл 70%-ным этиловым спиртом, раствор центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об. /мин. Надосадочную жидкость разливают в 5 чашек Петри и инактивируют при 53^oС до получения 485 мг сухого бесцветного кристаллического порошка, содержащего глиадин. Глиадин в концентрации 0,5 мкг/мл используют в нагрузочных иммунологических тестах. Рабочую концентрацию глиадина 0,5 мкг/мл получают следующим образом. 3,0 мг сухого кристаллического глиадина разводят 3 мл буфера рН 7,2 до полного растворения. 0,5 мл полученного раствора разводят 4,5 мл буфера (рН 7,2). Готовую рабочую концентрацию глиадина 0,5 мкг/мл в объеме 0,05 мкл используют в иммунологических нагрузочных тестах: тотального Е-розеткообразования и реакциях фагоцитоза с гепаринизированной венозной кровью больных целиакией.

Клинические примеры использования полученного средства глиадина в иммунологических нагрузочных тестах.

Пример 1. Больная Б., 4 года.

Жалобы на отсутствие прибавок в массе тела в течение 2 лет, разжиженный стул со зловонным запахом до 4 раз в сутки, плохо смывающийся с горшка, вздутие живота, пониженный аппетит.

Объективно: бледность кожных покровов, хейлит, рахитические изменения грудной клетки, гипотония мышц брюшного пресса, истончение подкожно-жирового слоя, дефицит массы тела 15%, вздутие живота.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:

относительное количество Т-лимфоцитов -44 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -2018 клеток (2,010³ мкл);

процент фагоцитоза -71%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:

относительное количество Т-лимфоцитов -30 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов 1376 клеток (1,3710³ мкл);

процент фагоцитоза -53%.

При проведении нагрузочных иммунологических тестов с глиадином выявлено достоверно значимое угнетение со стороны Т-лимфоцитов и процента фагоцитоза. Учитывая полученные данные, больной выставлен диагноз: Целиакия, типичная форма, средней степени тяжести.

Пример 2. Больная Б., 8 лет.

Жалобы на отсутствие прибавок в массе, росте, сниженный аппетит, периодически неустойчивый стул.

Объективно: задержка физического развития с дефицитом массы II степени. Признаки полигипоавитаминоза (хейлит, глоссит, расслоение ногтей), множественный кариес зубов.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:

относительное количество Т-лимфоцитов -59 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -2303 клеток (2,310³ мкл);

процент фагоцитоза -50%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:

относительное количество Т-лимфоцитов -48 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -1874 клеток (1,8710³ мкл);

процент фагоцитоза -32%.

При использовании иммунологических нагрузочных тестов с глиадином выявлено угнетение со стороны Т-клеточного звена иммунитета и снижение процента фагоцитоза. На основании полученных данных больной был выставлен диагноз: Целиакия, атипичная форма.

Таким образом, проведение нагрузочных тестов с глиадином в реакциях тотального Е-розеткообразования, фагоцитарных реакциях показало, что у больных целиакией происходит достоверное угнетение со стороны Т-лимфоцитов и фагоцитоза, что не отмечается у здоровых детей.

Пример 3. Здоровый ребенок К., 4 года.

Жалоб нет.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:

относительное количество Т-лимфоцитов -38 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -1356 клеток (1,3510³ мкл);

процент фагоцитоза -82%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:

относительное количество Т-лимфоцитов -39 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -1392 клеток (1,3910³ мкл);

процент фагоцитоза -84%.

Диагноз: Целиакия не обнаружена.

Угнетения со стороны Т-лимфоцитов и снижение процента фагоцитоза не обнаружено.

Пример 4. Здоровый ребенок Г., 9 лет.

Жалоб не предъявляет.

В реакциях тотального Е-розеткообразования, реакциях фагоцитоза без применения нагрузки глиадином составило:

относительное количество Т-лимфоцитов -56 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -2311 клеток (2,310³ мкл);

процент фагоцитоза -75%.

После применения нагрузки глиадином с целью диагностики:

относительное количество Т-лимфоцитов -54 (на 100 клеток);

абсолютное количество Т-лимфоцитов -2229 клеток (2,210³ мкл);

процент фагоцитоза -81%.

Диагноз: Целиакии не обнаружено.

Угнетения со стороны Т-лимфоцитов и снижение процента фагоцитоза не выявлено.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа состоит в удешевлении и упрощении способа диагностики целиакии при высокой достоверности. Впервые создано доступное средство для диагностики заболевания.