способ получения антигенного препарата haemophilus influenzae типа b (hib)

Формула изобретения

Способ получения антигенного препарата Haemophilus influenzae типа В (Hib) путем выращивания бактерий на жидких питательных средах с последующим выделением антигенов, отличающийся тем, что из биомассы бактерий Hib ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах извлекают экзогенный полисахарид, а концентрат клеток обрабатывают 2,5%-ным раствором натрия хлорида с натриевой солью ЭДТА и из полученного экстракта ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах выделяют капсульный полисахарид Hib в комплексе с белком, который соединяют с экзогенным полисахаридом Hib в соотношении 1: 1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способу получения антигенов Haemophilus influenzae типа В (Hib) и может быть использовано для изготовления вакцинирующих препаратов.

Известен способ получения антигенов Hib, применяемых для изготовления вакцин против Hib-инфекции (R.Schneerson, О.Barrens, А.Sutton et al. Preparation, characterisation and immunogenecity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. The goumal of experimental medicine, 1980, V.152, Р.361-374).

Этот способ включает культивирование микроорганизмов, их концентрирование центрифугированием, экстракцию капсульного полисахарида солевым раствором с катион-активным детергентом - цитавлоном, с последующей ферментативной обработкой нуклеазами, спиртовым фракционированием и полученный капсульный полисахарид конъюгируют с помощью сложных химических реакций с белком, в качестве которого используют столбнячный или дифтерийный анатоксины.

Однако этот способ является сложным в выполнении, многоэтапным, требует применения сложных химических методов конъюгации с использованием токсичных реагентов, что делает способ небезопасным, и, кроме того, требующим специфических сложных методов контроля остаточных количеств на применяемые реактивы и реагенты.

Целью предлагаемого способа является упрощение получения антигенного препарата Hib, при сохранении уровня высокой антигенной активности, а также обеспечение безопасных условий его получения.

Настоящая цель достигается тем, что из клеток микроорганизмов Hib, получаемых при культивировании на жидких синтетических средах, извлекают специфический экскретируемый клетками Hib экзогенный полисахарид ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах фирмы НПО "Химволокно".

Концентрат клеток обрабатывают 2,5%-ным раствором натрия хлорида с ЭДТА и полученный экстракт подвергают ультрафильтрации на молекулярных волоконных фильтрах фирмы НПО "Химволокно", а полученный капсульный полисахарид в комплексе с белком Hib смешивают с экзогенным полисахаридом в соотношении 1:1.

Пример 1. Получение натигенного препарата.

Штамм Haemophilus influenzae тип В 423 выращивают в течение 10 ч на твердой питательной среде (шоколадный питательный агар). Культуру смывают физиологическим раствором и инокулят засевают на жидкую питательную среду следующего состава: бульон казаминовых кислот - 10 г/д, глюкоза - 5 г/л, диализат дрожжевого экстракта - 2 г/л, гемин - 0,0010 г/л, НАД (никотинамиддинуклеотид) - 0,008 г/л, витамин В12-0,0005 г/л, рН 7,2-7,4. Инкубацию посевов ведут в атмосфере, насыщенной СО₂, в течение 8-10 ч. Выращенную биомассу обрабатывают 0,1%-ным водным раствором формалина, выдерживая в течение 1-2 ч, а клетки отделяют ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах фирмы МПО "Химволокно", г.Москва. Экзогенный полисахарид Hib, находящийся в ультрафильтрате (без клеток) и концентрируют на этих молекулярных волоконных фильтрах и лиофилизируют. Концентрат клеток, полученный после ультрафильтрации на молекулярных волоконных фильтрах, экстрагируют раствором, содержащим 2,5% натрия хлорида, с натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (рН 7,2). Экстракт, содержащий капсульный полисахарид в комплексе с белком Hib, отделяют от клеток центрифугированием при 6000 об/мин 40 мин на холоду, очищают и концентрируют путем ультрафильтрации на молекулярных волоконных фильтрах и лиофилизируют. Полученный концентрат, содержащий капсульный полисахарид в комплексе с белком Hib (см. фиг. 1, 2), диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют.

Для получения препарат для иммунизации объединяют в соотношении 1:1 (в/в) низкомолекулярную фракцию, содержащую экскреторный полисахарид и высокомолекулярную фракцию, содержащую в основном капсульный полисахарид в комплексе с белком Hib.

Таким образом, в реакции латекс-агглютинации подтверждается специфичность препарата, а в реакции диск - электрофореза подтверждается, что предлагаемый способ извлекает полисахарид Hib в комплексе с белком.

Пример 2. Проверка антигенности препарата.

Антигенность препарата проверяют на белых мышах, которых иммунизируют 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом в 20 дней препаратом, полученным по предлагаемому способу по весу, так, чтобы доза на одну мышь составила 50 мкг (человек-доза).

Для сравнения иммунизируют контрольную группу животных коммерческой конъюгированной вакциной в дозе 0,5 мл (человеко-доза) внутрибрюшинно, двухкратно с интервалом в 20 дней.

Через 20 дней после 2-й инъекции проверяют наличие антител в прямом иммуноферментном методе, сенсибилизируя планшеты капсульным полисахаридом Hib. В качестве конъюгата используют белок А стафилококка, меченный пероксидазой хрена.

Результаты представлены в табл.1.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить антигенный препарат, который обладает высокой антигенной активностью и может быть использован для иммунизации и создания иммунобиологического препарата.

Пример 3. Проверка протеактивной активности при местном назальном применении.

Препарат антигенов Hib, полученный по предлагаемому способу, вводят в носоглотку белым крысам 1 раз в три дня в течение 21 дня - всего 6 раз. Контрольной группе животных назальную вакцинацию не производят.

После введения вакцинирующего препарата крыс содержат на липидной диете в течение 20 дней. По окончании липидной диеты в обе половинки носа и носоглотку вводят культуру Haemophilus influenzae тип В в объеме 0,4 мл, содержащей 400 млн. микробных тел.

После 5, 7, 14 суток после заражения под эфирным наркозом проводят декапитацию животных и делают бактериологические посевы из слизистых носоглотки, пазух, крови, мозга. Одновременно изучают морфологические изменения в тканях экспериментальных животных.

Результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, на данной экспериментальной модели показано, что назальная вакцинация экспериментальных животных полученным по предлагаемому способу антигенным препаратом блокировала распространение вирулентной культуры Hib и защищала животных от инфекции, в том числе от генерализации процесса.

Пример 4. Проверка протективных свойств при парентеральной иммунизации экспериментальных животных.

Антигенным препаратом Hib, полученным по предлагаемому способу, в дозе 50 мкг в объеме 0,5 мл иммунизируют белых мышей внутрибрюшинно трехкратно с интервалом в 20 дней.

Аналогично вакцинируют белых мышей конъюгированной вакциной против Hib инфекции по прототипу. Через 20 дней после вакцинации животных заражают внутрибрюшинно муцинизированной культурой Hib (10 ДЛМ).

Результаты представлены в таблице 3.

Таким образом, препарат, полученный по предлагаемому способу, обладает выраженной протективной активностью, не уступающей конъюгированным препаратам.