способ определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и их компонентов

Формула изобретения

Способ определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и их компонентов, отличающийся тем, что определение токсичности и реактогенности проводят на культуре первичнотрипсинизированных или перевиваемых линий клеток.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве адьювантов, вакцин, диагностикумов и других биологических препаратов.

Известны способы определения токсичности и реактогенности масляных адьювантов и их компонентов на лабораторных и сельскохозяйственных животных (Мамков Н. С. Масляные адьюванты для противоящурных вакцин. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук, Владимир, 1999, стр. 72-77 - прототип). Однако указанные способы являются дорогостоящими, длительными и не позволяют получить количественную оценку токсичности и реактогенности масляных адьювантов и других биологических препаратов и их составляющих.

Известно, что лабораторные животные обладают недостаточно высокой чувствительностью к маслам, поэтому разрешающая способность способа оценки низкая. Так для получения результата определения токсичности масляных адьювантов и их компонентов на белых мышах им необходимо вводить исследуемого материала в 2,5-3,0 тысячи раз больше чем, например, крупному рогатому скоту (из расчета на единицу массы тела).

Целью заявляемого изобретения является получение и обеспечение количественных показателей определения токсичности и реактогенности масляных адьювантов и их компонентов и других биопрепаратов, снижение стоимости за счет исключения дорогостоящих лабораторных и сельскохозяйственных животных, а также сокращение сроков исследования.

Указанная цель достигается тем, что определение токсичности и реактогенности масляных адьювантов и их компонентов проводят на культуре первичнотрипсинизированных или перевиваемых линий клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Компоненты адьювантов подвергаются стерилизации по методу организации-изготовителя. Готовят культуру первичнотрипсинизированных или перевиваемых линий клеток общепринятым методом. Далее испытуемые образцы масел, эмульгаторов и других компонентов или готовых масляных адьювантов смешивают в соотношении 1:10 с поддерживающей питательной средой таким образом, чтобы получить тонкую эмульсию или раствор, из которых готовят серийные разведения до 10^-6. Каждое из шести разведении вносят по 1 мл в каждую из четырех пробирок (флаконов), из которых предварительно удаляют ростовую питательную среду.

В качестве контроля используют не менее четырех пробирок (флаконов) с этой же культурой клеток, в которые не вносят исследуемый компонент, но проводят смену ростовой культуральной питательной среды на поддерживающую культуральную питательную среду. Испытуемые и контрольные культуры клеток инкубируют в стационарных или вращающихся условиях в течение 12-24 ч. В эти сроки проводят микроскопирование культур клеток и оценку их состояния (наличие цитотоксического действия - (ЦПД). Результаты микроскопии культур клеток обрабатывают статистически по методу Кербера в модификации Ашмарина (1962) и выражают в lg ТЦД 50/мл.

Пример 1. Стерильные испытуемые масла для масляных адьювантов смешивают 1:10 с поддерживающей питательной средой (Игла, 199 и др. без сыворотки крупного рогатого скота) и готовят тонкую эмульсию с использованием специальных аппаратов или вручную. Из полученной тонкой эмульсии масла готовят разведения 10^-2-10^-6 в такой же поддерживающей питательной среде с использованием этих же аппаратов. По 1,0 мл каждого из шести разведении от 10^-1 до 10^-6 вносят не менее чем в четыре пробирки (флакона) с одной из взятых культуральных тест-систем со сформировавшимся слоем клеток. Культуральные тест-системы помещают в термостат при 37,5(0,1)^oС и инкубируют в стационарных или роллерных условиях в течение 12-24 ч. В этот период через каждые 6 ч проводят микроскопию культуральных тест-систем и регистрируют проявление цитотоксического действия (ЦПД) испытуемого масла.

Результаты реактогенности и токсичности испытуемых масел на мышах и цитопатического действия их на культуральных тест-системах представлены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что токсичность и реактогенность компонентов (масел) масляных адьювантов, определенных на мышах в пределах понятий (характеристик) "выраженная реактогенность", а так же понятий "нетоксичные", соответствует проявлению цитопатического эффекта на разных культурах клеток в пределах 1,7-1,9 lg ТЦД_50/мл; в пределах понятий "слабореактогенные" и "нетоксичные" - в пределах 1,0 - 1,1 lg ТЦД_50/мл; а в пределах "сильнореактогенные" и "токсичные" - в пределах 3,3-3,5 lg ТЦД_50/мл.

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, только для масляных адьювантов вместо масел берут эмульгаторы. Результаты реактогенности и токсичности испытуемых эмульгаторов на мышах и цитопатического действия их на культуральных тест-системах представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что токсичность и реактогенность компонентов (эмульгаторов) масляных адьювантов, определенных на мышах в пределах понятий (характеристик) "выраженная реактогенность", а также понятий "нетоксичные", соответствует проявлению цитопатического эффекта на разных культурах клеток в пределах 1,4-2,2 lg ТЦД_50/мл, а в пределах понятия "сильная реактогенность" и "токсичные" - в пределах 3,0-3,6 lg ТЦД_50/мл.

Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1 только вместо компонентов берут готовые масляные адьюванты. Результаты реатогенности и токсичности испытуемых масляных адьювантов на мышах и цитопатического действия их на культуральных тест-системах представлены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что токсичность и реактогенность масляных адьювантов, определенных на мышах в пределах понятий (характеристик) "сильная реактогенность" и "токсичные" соответствует проявлению цитопатического эффекта на разных культурах клеток в пределах 3,0-3,7 lg ТЦД_50/мл; "выраженная реактогенность" и "нетоксичные" - 1,7-2,1 lg ТЦД_50/мл; а "слабореактогенные" и "нетоксичные" - 1,4-1,5 lg ТЦД_50/мл.

Таким образом, в культуральных тест-системах во всех случаях определена закономерность проявления цитопатического действия испытуемых компонентов и готовых масляных адъювантов в соответствии с их токсичностью и реактогенностью, а также определена возможность количественного выражения токсичности и реактогенности испытуемых материалов.