питательная среда для культивирования культуры гриба penicillium canescens-продуцента эндо-(1-4)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования культуры гриба Penicillium canescens-продуцента эндо-(1-4)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы, содержащая источник углерода, источник азота, минеральную соль и воду, отличающаяся тем, что в качестве источника углерода содержит грубо размолотый овес, в качестве источника азота - соевую муку, а в качестве минеральной соли - калий фосфорнокислый однозамещенный, при следующем соотношении компонентов, г/л:

Грубо размолотый овес - 30-50

Соевая мука - 25-40

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 15-25

Вода - Остальное до 1 лв

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для использования в технологических процессах получения ферментных препаратов эндо-(1-4)-бета-ксиланазы и бета-галактозидазы при культивировании штаммов гриба Penicillium canescens. Для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens - продуцентов бета-галактозидазы известна питательная среда (авторское свидетельство СССР 1120700), содержащая в качестве источника углерода свекловичный жом, а в качестве источника азота белково-витаминный концентрат, следующего состава, г/л: свекловичный жом - 30, белково-витаминный концентрат - 50, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 15-25, остальное - вода до 1 л. При культивировании на этой среде штамма гриба Penicillium canescens F-178 выход бета-галактозидазы составлял 42 ед/мл после четырех суток роста. Штамм Penicillium canescens ВКПМ F-436 на этой среде продуцировал 100-130 ед бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости через 120-144 ч культивирования (авторское свидетельство СССР 1738854).

Для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens продуцентов бета-галактозидазы известна питательная среда, содержащая, г/л: свекловичный жом - 30, соевый шрот - 50, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 25, остальное - вода до 1 л. Эта среда рассматривается нами в качестве ближайшего аналога На этой среде рекомбинантный штамм Penicillium саnеsсens ВКПМ F-725 продуцировал 600-700 единиц бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости за 120 ч культивирования (патент РФ 2126049).

Свекловичный жом в питательной среде для Penicillium canescens является не только источником углерода, но и выполняет важнейшую функцию поставщика арабинозы, которая необходима как индуктор генов секретируемой бета-галактозидазы и эндоксиланазы (Николаев, Винецкий, Биохимия, т. 63. с.1523, 1998). Ферментные комплексы гриба Penicillium canescens гидролизуют пектин свекловичного жома с образованием в среде арабинозы.

Использование свекловичного жома при ферментации Penicillium canescens в колбах на качалке дает хорошие результаты, но для заводских многотоннажных ферментеров этот компонент среды создает много проблем. Помимо сезонного дефицита и дороговизны, свекловичный жом вследствие своей слоисто-комковатой консистенции требует предварительного размола, так как в противном случае происходит забивка трубопроводов ферментеров. В этой связи возникает задача замены свекловичного жома на другой компонент.

Задачей изобретения является разработка доступной в любое время года, дешевой и технологически более удобной питательной среды для культивирования штаммов гриба Penicillium canescens продуцентов ферментов бета-галактозидазы и эндо-(1-4)-бета-ксиланазы.

Для решения задачи предлагается среда, содержащая в качестве источника углерода грубо размолотый овес, а в качестве источника азота соевую муку при следующем соотношении компонентов, г/л:

Размолотый овес - 30 - 50

Соевая мука - 25 - 40

KH₂PO₄ - 15 - 25

Вода - Остальное до 1 л

Размолотый овес содержит ксилан, основная часть которого содержится в пленках семенной кожуры (техническое название "лузга"). Ксилан овса, как и у большинства зерновок злаковых, относится к типу L-арабино-D-ксиланов с арабинозными боковыми группами, которые гидролизуются ферментными комплексами гриба Penicillium canescens с образованием арабинозы, являющейся индуктором генов бета-галактозидазы и эндоксиланазы. Из всех доступных злаковых именно у овса самый высокий весовой процент ксилан-содержащих пленок - 23-45% (Мальцев. Технология бродильных производств. М., Пищепромиздат, 1960).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Сравнение продуктивности штамма Penicillium canescens ВКПМ F725 на заявляемой и известной средах.

Для получения посевного материала штамм Penicillium canescens ВКПМ F-725 выращивают на косяках на агаризованной среде Роулен-Тома при 30^oС в течение 5-7 суток. Водной суспензией конидий (10⁷ конидий/мл) инокулируют 100 мл известной среды следующего состава: свекловичный жом (30 г/л), соевый шрот - 50 г/л и КН₂РO₄ - 25 г/л, и 100 мл заявляемой среды следующего состава: размолотый овес - 40 г/л, соевая мука - 30 г/л, КH₂РО₄ - 25 г/л и культивируют в качалочных колбах объемом 750 мл при 30^oС в течение 120 ч на круговой качалке при 240 об/мин. Затем культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000 g, 15 мин) и в супернатанте определяют активность бета-галактозидазы.

Для определения активности бета-галактозидазы реакционную смесь, содержащую 3 мг О-нитрофенил-бета-галактопиранозида (ОНФГ) в 1,9 мл 0,05 М Na-ацетатного буфера, рН 4,5, и 100 мкл культуральной жидкости соответствующего разведения инкубируют 15 мин при 30^oС, затем добавляют 1 мл 1 М Na₂CO₃ и измеряют оптическую плотность раствора при 420 нм. За единицу активности бета-галактозидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата ОНФГ 1 мкмоль О-нитрофенола за 1 мин при данных условиях реакции.

При росте мультикопийного продуцента бета-галактозидазы Penicillium canescens ВКПМ F-725 на известной среде за 120 ч культивирования продуктивность штамма составила 565 ед бета-галактозидазы в 1 мл культуральной жидкости. На заявляемой среде продуктивность штамма составила 626 ед/мл.

Пример 2. Сравнение продуктивности штамма Penicillium canescens ВКПМ F832 на заявляемой и известной средах.

Получение посевного материала и условия культивирования, как в примере 1. Активность эндо-(1-4)-бета-ксиланазы определяют по количеству восстанавливающих сахаров, выделяемых при гидролизе ксилана из лиственницы. Инкубацию субстрата и фермента проводят при 50^oС в течение 10 мин. Проба включает 0.45 мл 1% раствора ксилана в 0.1М ацетатном буферном растворе, рН 5.0, и 0.05 мл фермента в соответствующем разведении. За единицу активности эндо-(1-4)-бета-ксиланазы принимают количество фермента, высвобождающее 1 мкмоль/мин восстанавливающих сахаров при указанных выше условиях. Восстанавливающие сахара определяют методом Шомоди-Нельсона.

При росте мультикопийного продуцента эндо-(1-4)-бета-ксиланазы Penicillium canescens ВКПМ F-832 на известной среде за 120 ч культивирования продуктивность штамма составила 629 единиц эндо-(1-4)-бета-ксиланазы в 1 мл культуральной жидкости. На заявляемой среде продуктивность штамма составила 648 ед/мл.