способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии
| Классы МПК: | G09B23/28 в медицине |
| Автор(ы): | Запускалов И.В., Кривошеина О.И. |
| Патентообладатель(и): | Сибирский медицинский университет, Запускалов Игорь Викторович, Кривошеина Ольга Ивановна |
| Приоритеты: |
подача заявки:
2000-05-10 публикация патента:
10.05.2002 |
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам моделирования пролиферативной витреоретинопатии. Способ обеспечивает повышение точности воспроизводимости и сокращение времени получения модели. Вводят в стекловидное тело взвесь клеточных элементов в физиологическом растворе с последующим периодическим гистологическим исследованием серийных срезов глазного яблока, при этом в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови и для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14-, 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели. 10 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10
Формула изобретения
Способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающийся во введении в стекловидное тело взвеси клеточных элементов в физиологическом растворе и последующем периодическом гистологическом исследовании серийных срезов глазного яблока, отличающийся тем, что в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови и для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к способам моделирования пролиферативной витреоретинопатии. Известны способы моделирования данного патологического процесса, заключающиеся во введении в стекловидное тело различных видов клеток [2-7] и последующем гистологическом исследовании, подтверждающем развитие заболевания. Серийные срезы окрашивают гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. Однако данные методы имеют следующие недостатки:- в качестве ведущего патогенетического фактора используются клетки (фибробласты, активированные макрофаги), изначально играющие важную роль в процессах пролиферации и обеспечивающие морфогенетическую функцию соединительной ткани;
- длительность эксперимента - до 6 месяцев и более. Наиболее близким по технической сущности является способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающийся в введении в стекловидное тело взвеси активированных тромбоцитов с последующим гистологическим исследованием через 2 недели, 1, 3, 12 месяцев [1]. Однако данный способ является недостаточно точным, т.к.:
- в ходе эксперимента не проводилась непрямая офтальмоскопия;
- получение описанной модели зависит от дозы введенных активированных тромбоцитов. Следовательно, страдают воспроизводимость и точность способа моделирования пролиферативной витреоретинопатии. Процесс создания модели также отличается длительностью - 12 месяцев. Новый технический результат, повышающий точность и воспроизводимость способа моделирования, сокращающий время получения модели, достигают применением нового способа моделирования пролиферативной витреоретинопатии, заключающегося во введении в стекловидное тело взвеси клеточных элементов в физиологическом растворе и последующем периодическом гистологическом исследовании серийных срезов глазного яблока, причем в качестве клеточных элементов используют мононуклеары крови, а для контроля проводят непрямую офтальмоскопию и гистологические исследования на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день и по развитию массивных витреоретинальных мембран судят о получении модели. Способ осуществляют следующим образом. Мононуклеары крови выделяют с помощью градиента фиколл-гипак. Кровь, полученную от животного, разбавляют в 2 раза физиологическим раствором. Полученную суспензию наслаивают на 3 мл смеси фиколла-гипака. Пробы центрифугируют в течение 15 мин при 800 g (2000 об/мин). После центрифугирования интерфазный слой, содержащий мононуклеары и располагающийся между плазмой и градиентом, забирают пастеровской пипеткой. Добавляют 1 мл физиологического раствора и полученную суспензия вновь центрифугируют в течение 7 мин при 400 g (15500 об/мин) для отмывания полученных мононуклеаров (схема разделения мононуклеаров представлена на фиг. 1). Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл-гипак, составляет до 96%. После эфирного наркоза каждому животному выполняют интравитреальные инъекции: через плоскую часть цилиарного тела в один глаз вводят 0,05 мл физиологического раствора, содержащего мононуклеары из расчета 2700/мм3, во второй глаз для контроля вводят 0,05 мл физиологического раствора. Способ апробирован на 20 крысах породы Wistar весом 200-250 г. Обзор экспериментального материала. В ходе эксперимента проводили непрямую офтальмоскопию на 1-, 3-, 5-, 7-, 14- и 21-й день после инъекции в условиях медикаментозного мидриаза (инсталляции S.Tropicamidi). В глазах с введенными мононуклеарами выявлены следующие изменения. На 3-й день после инъекции у всех животных в центральных отделах стекловидного тела отмечены локальные малоподвижные помутнения серовато-белого цвета, сетчатка не изменена. На 5-7-й дни офтальмоскопия затруднена из-за ограниченных фиксированных помутнений в стекловидном теле. На 14-й день у 2 животных отмечено помутнение задних отделов хрусталика, препятствующее офтальмоскопии; в глазах остальных животных грубое фиксированное помутнение в преретинальных и центральных отделах стекловидного тела, что затрудняло оценку состояния сетчатки. На 21-й день у всех животных рефлекс с глазного дна отсутствовал из-за развития катаракты. В контрольных глазах с инъекцией физиологического раствора изменений не выявлено. В ходе эксперимента после каждой офтальмоскопии за исключением 1-го дня умерщвляли по 4 животных и выполняли энуклеацию. При подготовке материала для гистологических исследований макроскопически, начиная с 14-го дня, появились признаки субатрофии экспериментальных глаз (у 3 животных передне-задний размер составил 5-6 мм, в норме 7-8 мм). На 21-й день во всех экспериментальных глазах субатрофия (передне-задний размер около 4 мм). Весь полученный материал зафиксирован для световой и электронной микроскопии по стандартным методикам. Серийные срезы для световой микроскопии окрашены гематоксилин-эозином по Браше и по Ван-Гизону. Полутонкие срезы для электронной микроскопии окрашены толуидиновым синим. В ходе гистологического исследования на 3-й день после введения мононуклеаров наблюдали скопления макрофагов в стекловидном теле (см. фиг.2 - полутонкий срез для электронной микроскопии. Здесь и на фиг. 3, 4 окраска толуидиновым синим. х1200). На 7-й день после инъекции - позади хрусталика скопления макрофагов и фибробластоподобных клеток (см. фиг.3), преретинально - обширные скопления фибробластов и клеток мононуклеарного ряда, окруженные коллагеновыми фибриллами (см. фиг.4). Эти морфологические изменения формировали преретинальную мембрану, которая к 14-му дню превращалась в довольно мощное образование в результате слияния отдельных, изолированных преретинальных мембран (см. фиг.5 - световая микроскопия. Окраска гематоксилин-эозином. х600). Отмечено формирование эпиретинальных мембран с деструкцией внутренних слоев сетчатки (см. фиг.6 - световая микроскопия. Окраска по Браше. х600), локальная тракционная отслойка сетчатки (см. фиг.7 - световая микроскопия. Окраска по Браше. х600). На 21-й день были обнаружены грубые изменения в виде массивных интравитреальных мембран (см. фиг.8 - световая микроскопия. Окраска гематоксилинэозином. х600), а также развитие преретинальной и интраретинальной фиброзной ткани с полной утратой структуры сетчатки (см. фиг.9 - световая микроскопия. Окраска гематоксилин-эозином. х600; см. фиг.10 - световая микроскопия. Окраска по Ван-Гизону. х600). В контрольных глазах с инъекцией физиологического раствора изменений не выявлено. Таким образом, офтальмоскопические и гистологические исследования в ходе эксперимента показали развитие преретинального швартообразования, являющегося основным признаком пролиферативной витреоретинопатии. Следовательно, предлагаемый способ моделирования является не только подтверждением участия мононуклеаров крови в патогенезе данного патологического процесса, но и позволяет создать более точную и высоко воспроизводимую модель пролиферативной витреоретинопатии и за более короткий срок - 21 день. Источники информации
1. Хорошилова-Маслова И.П., Бабижаев М.А., Киселева О.А., Илатовская Л. В. Пептид клеточной адгезии в профилактике посттравматической пролиферативной витреоретинопатии (экспериментально-морфологическое исследование) // Вестн. офтальмол. 1997. 4. С. 27-31,
2. Algvere PV; Hallnas K; Dafgard E; Hoog A. Panretinal photocoagulation aggravates experimental proliferative vitreoretinopathy. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1990; 228(5): p. 461-6
3. Chandler DB; Quansah FA, Hida T; Machemer R. A refined experimental model for proliferative vitreoretinopathy. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1986; 224(1): p. 86-91. 4. de Juan E Jr; Dickson J; Hatchell DL. Interaction of retinal glial cells with collagen matrices: implications for pathogenesis of cell-mediated vitreous traction. // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1989; 227(5): p. 494-8. 5. Forrester JV; Stott DI; Hercus KM. Naturally occurring antibodies to bovine and human retinal S antigen: a comparison between uveitis patients and healthy volunteers. // Br. J Ophthalmol, 1989, Feb; 73(2): p. l55-9. 6. Hitchins CA; Grierson I., Hiscott PS. The effects of injections of cultured fibroblasts into the rabbit vitreous. // Graefes Arch Clin. Exp. Ophthalmol, 1985, 223 (5): p. 237-49. 7. Hui YN; Goodnight R; Sorgente N; Ryan SJ. Fibrovascular proliferation and retinal detachment after intravitreal injection of activated macrophages in the rabbit eye. // Am. J. Ophthalmol, 1989, Aug. 15, 108(2): p. l76-84.