способ определения in vitro остеоинтегративных свойств материалов для костных имплантатов

Формула изобретения

Способ определения in vitro остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов, заключающийся в определении биологической совместимости материала с костной тканью с помощью культивирования тест-объекта, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют лишенный надкостницы фрагмент теменной или лобной кости крысенка-сосунка в возрасте до 1 недели, на который помещают образец испытуемого материала и определяют отношение площади заселенной остеобластподобными клетками поверхности к площади верхней поверхности образца на 4 сут и толщину отложенного клетками слоя коллагена на 14 сут.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и предназначено для предварительного скрининга различных материалов биологической и небиологической природы в органной клеточной культуре с целью определения их остеоинтегративных свойств.

Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов небиологической природы, в качестве которых использовали титан и его сплавы с различными покрытиями [патент РФ 2159094]. Опыты проводились на самцах мышей линии Balb/c, находящихся в стандартных условиях и на диете. Мышей предварительно выдерживали в течение 2-3 недель в карантине, больные и нестандартные животные выбраковывались. Каждому животному после дачи эфирного наркоза подкожно вводили по 4 диска. Для определения остеокондуктивных свойств на диск предварительно наносили столбик костного мозга, выделенного из бедренной кости путем вымывания 1-2 мл среды Д-МЕМ с 5%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Остеоиндуктивность исследовали без нанесения на диски костного мозга. Через 1 месяц животных забивали, определяли физическими методами силу сцепления дисков с окружающей тканью. Предварительную оценку размеров очагов костеобразования осуществляли с помощью бинокулярного микроскопа МБС-2, после чего делали гистологический, цитологический и цитохимический анализ для определения качественного состава костных и других клеток на поверхности имплантанта и реакции на него окружающей ткани. Результаты обрабатывали методом непараметрической статистики.

Известен способ определения остеоинтегративных свойств материалов в зубных имплантатах, заключающийся в определении поверхности перехода имплантата, помещенного 4 собакам. По истечении 15, 30, 60 и 120 дней после помещения имплантата в челюстную кость животных проводили гистологическую оценку тканей, окружающих имплантат. Определяли также рост костной ткани через отверстия имплантата по направлению к внутреннему костному столбику. При микроскопическом исследовании образцов, полученных от собак, выведенных из эксперемента на 60-й день, определяли поверхность перехода кость/металл [Lum. L. B., Beime O.R. Viability of the retained bone core in the core-vent dental implant. J. Oral ImplantoL, 1987, 13, 3, 402-408].

Известны способы определения остеоинтегративных свойств материалов для костных имплантантов и трасплантатов биологической и небиологической природы, заключающиеся в непосредственном вживлении испытуемых материалов в кость экспериментальных животных [Diert E., Fischer-Brandies E., Bagambisa F. REM-Untersuchungen an den Grenzschichtstrukturen Hydroxylapatik. Knochen. Dtsch. Zahnarztl. Z., 1988, 43, 1, 22-25].

Недостатками известных способов являются: крайне затрудненное определение количественной оценки костной интеграции (отношение площади участков прямого контакта костных культур с поверхностью имплантанта к общей площади имплантата); для достоверного суждения требуются значительно большие группы животных; необходимы более длительные эксперименты; нет прямой зависимости от техники выполнения операции на животном.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому способу является способ определения остеоинтегративных свойств материалов для имплантатов, заключающийся в определении биосовместимости путем помещения культуры остеобластов человека, которая являлась тест-объектом, на фрагменты размером 1-3 мм² из исследуемого материала и количественной оценки роста остеобластов на исследуемом материале через 15 дней. Рост остеобластов изучали методом сканирующей электронной микроскопии. [A comparison of the biocompatibility of bone graft substitutes for human osteoblasts. Begley C.T. J. Anat. 1993, 183, 1, с. 176]. Оценка остеоинтегративных свойств материалов проводилась по возможному размножению культуры. Отбраковывался материал, на котором клетки не приживались.

Недостатком известного прототипа является невозможность количественной оценки остеоинтегративных свойств материалов, а также невозможность прямого перенесения полученных результатов на целый организм, так как поведение изолированных клеток значительно отличается от реакции in vivo.

Цель данного изобретения - упрощение способа определения остеоинтегративных свойств костного имплантата с остеобластами человека, уменьшение количества используемых лабораторных животных, получение качественных и количественных показателей поведения клеток остеобластов на исследуемом имплантате, что позволит оперативно прогнозировать перспективность дальнейших испытаний на животных.

Поставленная цель достигается за счет использования способа определения in vitro остеоинтегративных свойств исследуемых материалов для костных имплантатов, заключающегося в помещении образца исследуемого материала на тест-объект, в качестве которого используют лишенный надкостницы фрагмент теменной или лобной кости крысенка-сосунка в возрасте до 1 недели, и определении скорости заселения остеобластподобными клетками поверхности исследуемого материала и толщины отложенного клетками слоя коллагена на поверхности исследуемого материала известным методом.

Пример реализации способа.

На лишенный надкостницы фрагмент теменной или лобной кости крысенка-сосунка в возрасте до 1 недели помещают стандартный прямоугольный образец исследуемого материала размером 1х1 мм, толщиной 0,15 мм. Тест-объект помещают в ячеи стандартного планшета для культивирования и заполняют питательной средой. Далее планшет переносят в термостат и при 37^oС и содержании углекислоты в воздухе 5% проводят культивирование. В первые часы культивирования остеобластподобные клетки поднимаются на боковые и верхнюю поверхности образца, заселяя их на несколько миллиметров от края. При этом хорошо сохраняются контакты между отростками клеток, находящихся даже на значительном расстоянии друг от друга. В процессе перемещения клетки распластаны по поверхности образца и контурируют его рельеф. В клетках, наиболее удаленных от края образца, активность синтеза коллагена меньше, чем в клетках у его края, где определяется сеть вновь отложенных коллагеновых фибрилл, среди которых обнаруживаются многочисленные клеточные отростки. Увеличение клеточной популяции на поверхности образцов происходит не только путем переселения клеток с крыши черепа, но и путем активного деления. При более длительных сроках культивирования эти клетки полностью покрывают поверхность образца, а под ними определяется слой вновь синтезированного коллагена.

Быстрота заселения поверхностей образца клетками (% покрытой ими поверхности) и толщина синтезированного клетками коллагена являются количественными критериями выраженности остеоинтегративных свойств испытуемого материала. Оптимальным сроком для оценки этих показателей являются 4 суток культивирования для определения % покрытой остеобластподобными клетками поверхности образца и 14-е сутки для оценки толщины синтезируемого клетками слоя коллагена.

В качестве заменителей костной ткани для имплантатов использовали как биологические композиты, так и различные материалы небиологической природы (металлы, полимеры, их комплексные конструкции), выделенные авторами при исследовании в три группы:

1. По литературным данным оптимальным с точки зрения остоинтегративных свойств материалов для имплантации в кость является деминерализованный костный матрикс (ДКМ) - объект 1 (таблица).

2. Другим часто используемым в ортопедической и травматологической практике биологическим имплантируемым материалом являются фрагменты фиксированной лиофизированной или консервированной кости - объект 2 (таблица).

3. Использование в ортопедической и травматологической практике в качестве имплантируемых материалов трасплантатов небиологической природы (керамика, биологическое стекло, гидроксиапатиты) - образец 3 (таблица) [Перечень полимерных материалов, рекомендуемых для изделий медицинского назначения. М. , 1987 г. , ВНИИМТ и ВНИИФ] и металл и его сплавы - образец 4 (таблица).

Для первой группы исследуемых материалов по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 4 суток культивирования. Остеобластподобные клетки заселили 90-100% верхней поверхности аутогенного ДКМ и 50-80% гетерогенного ДКМ. Через 14 суток толщина отложенного клетками слоя коллагена была достаточно равномерна и превышала 0,3 мкм.

Для второй группы исследуемых материалов по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 4 суток культивирования. Остеобластподобные клетки заселили 5-30% верхней поверхности образца. Через 14 суток толщина отложенного клетками слоя коллагена неравномерна: в участках у края образца она была 0,1-0,2 мкм, а в его центральных отделах выявлялась сеть разрозненных коллагеновых волокон.

Для третьей группы исследуемых материалов по заявляемому способу определяли их остеоинтегративные свойства через 4 суток культивирования. Остеобластподобные клетки заселили 0,1-5% верхней поверхности образца. Через 14 суток слой отложенного клетками коллагена на поверхности образца не выявляется, а по его краям обнаруживается лишь сеть разрозненных коллагеновых волокон.

Результаты проведенных исследований по определению остеоинтегративных свойств материалов костных имплантатов сведены в таблицу.