конъюгаты интерферона

Формула изобретения

1. Физиологически активный конъюгат ПЭГ--IFN, имеющий формулу



где R и R" независимо друг от друга обозначают низший алкил;

Х обозначает NH или О;

n и n" представляют собой целые числа, сумма которых составляет от 600 до 1500,

и средняя молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля в этом конъюгате составляет от 26000 до 66000 Да.

2. Конъюгат по п. 1, в котором молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля составляет от 35000 до 45000 Да.

3. Конъюгат по п. 2, в котором молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля составляет 40000 Да.

4. Конъюгат по п. 1, в котором R и R" обозначают метил.

5. Конъюгат по п. 1, в котором Х обозначает NH.

6. Конъюгат по п. 1, в котором -IFN представляет собой 2a-IFN.

7. Конъюгат по п. 1, в котором средняя сумма n и n" составляет от 850 до 1000.

8. Конъюгат по п. 1, в котором R и R" обозначают метил, Х обозначает NH, -IFN представляет собой -2a-IFN и один или оба n и n" равны 420.

9. Конъюгат по п. 1, в котором R и R" обозначают метил, Х обозначает NH, -IFN представляет собой -2a-IFN и один или оба n и n" равны 520.

10. Конъюгат по п. 1, обладающий антипролиферативной активностью, превосходящую таковую у -IFN и сниженной антивирусной активностью в сравнении с -IFN.

11. Способ получения конъюгата ПЭГ--IFN, обладающего антипролиферативной активностью, превосходящей таковую y -IFN и сниженной антивирусной активностью в сравнении с -IFN, заключающийся в том, что ковалентно связывают реагент формулы II



c -IFN с получением конъюгата ПЭГ--IFN.

12. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной и антивирусной активностью, содержащая конъюгат ПЭГ--IFN по любому из пп. 1-10 и терапевтически инертный носитель.

13. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики иммуномодуляторных нарушений, таких, как заболевания, относящиеся к опухоли, и инфекционных болезней, содержащая конъюгат ПЭГ--IFN по любому из пп. 1-10 и терапевтически инертный носитель.

14. Способ лечения или профилактики иммуномодуляторных заболеваний, включающий введение конъюгата ПЭГ--IFN по любому из пп. 1-10.

Описание изобретения к патенту

Интерферон, в частности 2a-интерферон, представляет собой фармацевтически активный протеин, который обладает антивирусной и антипролиферативной активностью. Например, интерферон применяют для лечения лейкемического ретикулеза и саркомы Капоши, и он также проявляет активность в отношении гепатита. Для улучшения стабильности и растворимости и уменьшения иммуногенности фармацевтически активные протеины, такие, как интерферон, могут быть конъюгированы с полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ).

Биологическая доступность терапий с использованием протеинов часто ограничена их коротким периодом полураспада в плазме, что препятствует достижению их максимального лечебного действия. В последние годы было подтверждено, что ПЭГ-конъюгированные биологические молекулы обладают полезными лечебными свойствами (Inada и др., J. Bioact. and Compatible Polimers 5, 343 (1990); Delgado и др., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249 (1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91 (1993). Они обладают лучшей физической стабильностью и теплостойкостью, защищены (нечувствительны) от ферментативного разложения, имеют повышенную растворимость, более продолжительный период полураспада в кровотоке in vivo, пониженный клиренс и повышенную эффективность. Были опубликованы данные о том, что разветвленные ПЭГ-конъюгаты обладают более высоким значением рН и теплостойкостью и большей стабильностью по отношению к протеолитическому разложению по сравнению с линейными ПЭГ-конъюгатами (Monfardini и др., Bioconjugate Chem. 6, 62 (1995)). Другими свойствами ПЭГилированных протеинов являются пониженная иммуногенность и антигенность, а также пониженная токсичность. Другим эффектом ПЭГилирования определенных протеинов может быть снижение активности in vitro, сопровождаемое увеличением активности in vivo. Это было обнаружено, в частности, на G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов) (Satake-Ishikawa и др., Cell Structure and Function 17, 157-160 (1992), на IL-2 (интерлейкин-2) (Katre и др. , Рrос. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487 (1987)), на TNF- (фактор некроза опухоли) (Tsutsumi и др., Jpn. J. Cancer Res. 85, 9 (1994)), на IL-6 (интерлейкин-6) (Inoue и др., J. Lab. Clin. Med. 124, 529 (1994)) и на CD4-IgG (антиген Т-лимфоцитов-иммуноглобулин G) (Chamow и др., Bioconj. Chem. 5, 133 (1994)) и на других.

Было обнаружено, что в случае интерферона ПЭГилирование снижает антивирусную активность in vitro, но увеличивает антипролиферативную активность в отношении клеток опухоли человека. Однако новый ПЭГ-конъюгат интерферона по настоящему изобретению обладает неожиданными свойствами, заключающимися в том, что антипролиферативная активность ПЭГ-интерферона существенно выше не только таковой самого интерферона, но и других ПЭГ-конъюгатов интерферона. Хотя антипролиферативная активность конъюгата существенно увеличена по сравнению с активностью других ПЭГ-конъюгатов -интерферона, однако в этом случае наблюдается аналогичное снижение антивирусной активности. Кроме того, ПЭГ-конъюгат -интерферона по настоящему изобретению не обладает иммуногенностью, в результате чего фактически при его введении не образуются антитела. В противоположность этому другие ПЭГ-конъюгаты -интерферона в определенной степени вызывают образование антител.

Следовательно, предметом изобретения является новый класс ПЭГ-производных -интерферона (-IFN). Конъюгат по настоящему изобретению, как описано ниже, включает ПЭГ, имеющий разветвленное строение. Разветвленный ПЭГ обладает тем преимуществом, что он имеет возможность присоединять две молекулы линейного ПЭГ в одной точке, удваивая таким образом массу присоединенного ПЭГ и не увеличивая количества точек ПЭГилирования.

По сравнению с немодифицированным -IFN (т.е. -IFN без присоединенного ПЭГ) конъюгат обладает увеличенным периодом полураспада в кровотоке и временем нахождения в плазме, уменьшенной иммуногенностью, пониженным клиренсом и увеличенной антипролиферативной активностью, что сопровождается пониженной антивирусной активностью in vitro. Конъюгат по настоящему изобретению по сравнению с другими конъюгатами ПЭГ--IFN обладает существенно более высокой антипролиферативной активностью, не связанной пропорциональной зависимостью с усилением или снижением других характеристик, и фактически не обладает иммуногенностью.

Физиологически активные виды конъюгата ПЭГ--IFN по настоящему изобретению имеют формулу:



Конъюгат по настоящему изобретению имеет такие же области применения, что и -IFN, например, в качестве антипролиферативного средства. В частности ПЭГ-конъюгаты -интерферона по настоящему изобретению пригодны для лечения иммуномодуляторных нарушений, таких, как заболевания, относящиеся к опухоли, например, лейкемический ретикулез, хронический миелолейкоз (ХМЛ) и саркома Капоши, и инфекционных болезней с помощью такого же способа, который применят для лечения этих болезней -интерфероном (в частности 2a-IFN). Однако конъюгат по настоящему изобретению обладает улучшенными свойствами, включающими лучшую стабильность, более высокую растворимость, увеличенный период полураспада в кровотоке и большее время нахождения в плазме. Кроме того, эти конъюгаты обладают антипролиферативной активностью, превосходящей таковую для -IFN. Также было потверждено, что конъюгат проявляет неожиданное разделение антивирусного и антипролиферативного действия. Это свойство дает дополнительное преимущество в том случае, если необходимо усилить определенную активность конъюгата и в то же время уменьшить или устранить нежелательную активность. Например, если нежелательное побочное воздействие связано с антивирусной активностью, то устранение этой активности будет устранять это побочное воздействие, сохраняя при этом антипролиферативную активность. Таким образом, настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции на основе соединений формулы I или их солей и способы их получения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, применяемые для лечения или предупреждения заболеваний, включают конъюгат интерферона общей формулы I и терапевтически инертный нетоксичный и терапевтически приемлемый носитель. Предназначенные для применения фармацевтические композиции могут быть приготовлены и дозированы в соответствии с принятой медицинской практикой с учетом подлежащего лечению заболевания, состояния конкретного пациента, места доставки конъюгата протеина, способа введения и других факторов, известных специалистам в данной области техники.

Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой физиологически активный конъюгат ПЭГ--IFN имеющий формулу



где R и R", независимо друг от друга, обозначают низший алкил; Х обозначает NH или О (X обозначает по крайней мере одну из функциональных групп в молекуле -IFN, выбранную из NH₂ или ОН); n и n" представляют собой целые числа, сумма которых составляет от 600 до 1500; и средняя молекулярная масса звеньев полиэтиленгликоля в этом конъюгате составляет от приблизительно 26000 Да до приблизительно 66000 Да. Конъюгат формулы I имеет разветвленное строение, в котором два фрагмента ПЭГ присоединены к протеину через простую связь.

Числа n и n" выбирают таким образом, чтобы образовавшийся конъюгат формулы I обладал физиологической активностью -IFN, причем эта активность может быть такой же, более высокой или представлять собой часть соответствующей активности немодифицированного -IFN. Числа n и n" (причем n и n" могут быть одинаковыми или разными) обозначают количество звеньев этиленгликоля в ПЭГ. Одно звено ПЭГ, ОСН₂СН₂, имеет молекулярную массу приблизительно 44 Да. Молекулярная масса конъюгата (за исключением молекулярной массы -IFN) зависит от чисел n и n". Сумма n и n" для конъюгата формулы I составляет от 600 до 1500, что приводит к получению конъюгата, имеющего общую среднюю молекулярную массу звеньев ПЭГ от приблизительно 26000 до 66000 Да и предпочтительно от приблизительно 35000 до 45000 Да, в частности от приблизительно 39000 до 40000 Да, причем особенно предпочтительна молекулярная масса 40000 Да. Предпочтительная сумма n и n" составляет от приблизительно 800 до 1200, причем средняя сумма составляет от приблизительно 850 до 1000, а предпочтительной суммой является приблизительно 910. Каждое из чисел n и n" по отдельности может быть равно 420 или 520, или оба могут быть равны 420 или 520, или оба могут быть равны 455. Предпочтительное отношение n к n" может составлять от приблизительно 0,5 до 1,5, причем наиболее предпочтительное отношение составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,2. Понятие "приблизительно" в отношении некоторого значения молекулярной массы означает, что она находится в статистически приемлемой области этого значения, определяемого стандартными аналитическими методами.

Также предпочтительным является конъюгат формулы I, в котором -IFN представляет собой 2a-IFN, конъюгат, в котором R и R" обозначают метил, конъюгат, в котором Х обозначает NH, и конъюгат, в котором n и n" каждый или оба вместе равны либо 420, либо 520. Такой конъюгат, обладающий всеми вышеуказанными характеристиками, является особенно предпочтительным.

R и R" могут обозначать любой низший алкил, представляющий собой алкильную группу, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, такой, как метил, этил, изопропил и т. д. Эта группа также включает разветвленные алкилы. Предпочтительным алкилом является метил. В двух группах ПЭГ формулы I R и R" могут быть одинаковыми или различными.

Под -IFN (-интерферон) и его разновидностями 2a-IFN понимают природный или рекомбинантный протеин, предпочтительно человеческий, получаемый из любого обычного источника, такого, как ткани, путем химического синтеза протеина из культуры клеток с использованием нативных и рекомбинантных клеток. Под объем настоящего изобретения подпадает любой протеин, обладающий активностью -IFN в том числе мутеины или модифицированные каким-либо другим образом протеины. Методика получения и выделения -IFN из природных или рекомбинантых источников хорошо известна (Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221, 1 (1983)). Предпочтительным -IFN, как указано выше, является 2a-IFN, получаемый известными способами (Pestka, Sci. Am. 249, 36 (1983); Европейский патент 43980)).

Физиологически активный конъюгат формулы I обладает активностью -IFN, под которой понимают любую частичную или усиленную известную активность -IFN, определяемую различными способами, известными в данной области техники. В частности конъюгаты по настоящему изобретению обладают активностью -IFN, а именно, как установлено, антипролиферативным действием в отношении клеток опухоли и антивирусной активностью в отношении клеток, зараженных вирусом. Эти виды активности являются известными активностями, свойствеными -IFN. Такая активность конъюгата может быть определена способами, хорошо известными в данной области техники, например, описанными ниже способами (см. , также у Rubinstein и др., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden и др., Cane. Res. 42, 4948 (1982)). Одним из предметов настоящего изобретения является конъюгат формулы I, обладающий более высокой антипролиферативной активностью и меньшей антивирусной активностью по сравнению с немодифицированным -IFN.

Конъюгат формулы I получают путем ковалентного связывания -IFN с ПЭГ, который может быть активирован замещением гидроксильной группы ПЭГ на связывающую группу с образованием реагента, представляющего собой производное ПЭГ в виде N-гидроксисукцинимидного эфира (в частности монометокси-ПЭГ) формулы II. Реагент может быть получен традиционными методами (Monfardini и др. , см. выше). Связывание происходит через амидную или эфирную связь. В предпочтительном конъюгате связывание происходит через амидную связь (X обозначает NH). Одним из предметов настоящего изобретения является способ усиления антипролиферативной активности -IFN при одновременном снижении антивирусной активности -IFN путем связывания -IFN, как описано выше, с реагентом формулы II с получением конъюгата ПЭГ-IFN.

Х обозначает место присоединения на -IFN, посредством которого ПЭГ-реагент формулы II ковалентно связывается с -IFN. Реагенты присоединяются к первичным аминогруппам (ХН = NH₂), например, лизина, или к N-концам -IFN. Реагенты также могут быть присоединены к гидроксилу (ХН = ОН), например, серина (см. схему 1 в конце описания).

Реагент формулы II (ПЭГ2-NHS), в котором в целом две цепи монометокси-ПЭГ (м-ПЭГ) связаны с лизином, каждая с - и -аминогруппами, через карбаматные (уретановые) связи и который содержит карбоксильную группу лизина, активированную до сукцинимидилового эфира, может быть получен обычными методами в соответствии с известными способами (Monfardini и др., см. выше), применимыми к реагенту, в котором R обозначает низший алкил и с требуемым значением n. Такой реагент поставляется, например, фирмой Shearwater Polymers, Inc. (Хантсвилл, шт. Алабама). Предпочтительная средняя молекулярная масса получаемого ПЭГ составляет приблизительно 20000 Да, что обеспечивает общую массу ПЭГ в ПЭГ2-NHS приблизительно 40000 Да (полимеры с другими молекулярными массами могут быть получены традиционными методами путем изменения значения n в исходных материалах для реагента формулы II, представляющих собой спиртовой ПЭГ).

Реагент формулы II может быть конъюгирован с -IFN традиционными способами. В частности реагент формулы II сначала подвергают взаимодействию с одной или несколькими первичными аминогруппами (например, с N-концевыми группами или с боковыми цепями лизина) -IFN (например, 2a-IFN) для образования амидной связи между -IFN и полимерной основой ПЭГ. Реакция ПЭГилирования также может происходить между ПЭГ2-NHS и свободными (если они присутствуют) гидроксильными группами (например, серина) -IFN с образованием сложноэфирной связи. Механизм реакции приведен выше. Условия реакции являются обычными для специалистов в данной области техники и более подробно приведены ниже. ПЭГ-реагент объединяют с -IFN в среднещелочных условиях при низкой температуре и в условиях, пригодных для нуклеофильного замещения, что приводит к получению конъюгата формулы I. Это также показано выше на схеме реакции.

Присоединение реагентов к -IFN может быть осуществлено традиционными методами. Могут быть использованы ПЭГ по настоящему изобретению с любыми выбранными молекулярными массами. Условия реакции могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить получение конъюгата по изобретению с одним присоединенным реагентом. Конъюгат формулы I, к которому присоединен один реагент формулы II, отделяют от немодифицированного -IFN и от конъюгатов, имеющих более одной присоединенной молекулы реагента, традиционными способами.

Для разделения конъюгатов на основе различия в зарядах могут применяться методы очистки, такие, как катионообменная хроматография, которая позволяет эффективно разделять конъюгаты на основе их различных молекулярных масс. Содержание фракций, получаемых в результате катионообменной хроматографии, может быть определено по молекулярной массе с использованием принятых способов, например, с помощью масс-спектроскопии, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ-ДСН) или других известных методов, применяемых для разделения молекулярных энантиомеров по молекулярной массе. Затем соответственно определяют фракцию, которая содержит конъюгат формулы I, очищенный от немодифицированного -IFN и от конъюгатов, имеющих более одного присоединенного реагента. Кроме того, реагенты формулы II при кислотном гидролизе высвобождают по одной молекуле лизина

на молекулу реагента, так что количество молекул лизина при гидролизе показывает количество групп ПЭГ, присоединенных к протеину, и таким образом может быть подтверждено количество молекул реагента, присоединенных к конъюгату.

Ниже изобртение проиллюстрировано на примерах, которые не ограничивают его объем. В этих примерах использован 2a-IFN. Другие виды -IFN также могут быть конъюгированы с ПЭГ способами, приведенными в примерах.

Описание чертежей

Фиг. 1: Противоопухолевая активность ПЭГ2-2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии А498. Всем животным за 33 дня до начала эксперимента (день-33) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии А498. Обработку с помощью ПЭГ2-2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 1 раз в неделю в течение 4-недельного периода.

Фиг. 2: Противоопухолевая активность 2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии А498. Всем животным за 33 дня до начала эксперимента (день-33) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии А498. Обработку с помощью 2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) 2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 3 раза в неделю в течение 4-недельного периода.

Фиг. 3: Противоопухолевая активность ПЭГ2-2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии ACHN. Всем животным за 25 дней до начала эксперимента (день-25) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии ACHN. Обработку с помощью ПЭГ2-2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 1 раз в неделю в течение 5-недельного периода.

Фиг. 4: Противоопухолевая активность 2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии ACHN. Всем животным за 25 дней до начала эксперимента (день-25) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии ACHN. Обработку с помощью 2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) 2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 3 раза в неделю в течение 5-недельного периода.

Фиг. 5: Противоопухолевая активность ПЭГ2-2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии G402. Всем животным за 45 дней до начала эксперимента (день-45) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии G402. Обработку с помощью ПЭГ2-2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (30, 60, 120 или 300 мкг) ПЭГ2-2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 1 раз в неделю в течение 5-недельного периода.

Фиг. 6: Противоопухолевая активность 2a-IFN, изученная на лишенных шерсти мышах, которым подкожно имплантировали почечные клетки человека линии G402. Всем животным за 45 дней до начала эксперимента (день-45) подкожно вводили имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии G402. Обработку с помощью 2a-IFN начинали в день 0 эксперимента. Указанные количества (10, 20, 40 или 100 мкг) 2a-IFN вводили подкожно в противоположный относительно опухоли бок, 3 раза в неделю в течение 5-недельного периода.

Пример 1

Получение конъюгата формулы I

Материалы

2a-Интерферон получали известными способами (Pestka, см. выше). Полиэтиленгликолевый (ПЭГ) реагент формулы II был приобретен у фирмы Shearwater Polymers, Inc. (Хантсвилл, шт. Алабама). Смола Fractogel EMD CM 650(S) с размером частиц 25-40 мкм поставляется фирмой ЕМ Separations (Гиббстаун, МА). Концентрированный (10Х) забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР), рН 7,3, был приобретен у фирмы BioWhittaker (Уолкерсвилл, MD). Наборы гелей для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-(лаурил)-сульфата натрия (ПААГ-ДСН) и приборы для электрофореза были приобретены у фирмы NOVEX (Сан Диего, шт. Калифорния). Концентрированный краситель Fast Stain для окрашивания протеина ПЭГ-конъюгатов при электрофорезе в ПААГ-ДСН был приобретен у фирмы Zoion Research, Inc. (Ньютон, МА). Набор для определения эндотоксина в тесте с использованием лизата амебоцитов (LAL-тест) был приобретен у фирмы Associates of Cape Cod, Inc. (Вудс Хол, МА). Все другие применяемые реагенты были наиболее высокого доступного качества. Крысы с канюлями, имплантированными в яремную вену, и мыши линии BDF-1 были приобретены у фирмы Charles River Laboratories (Вилмингтон, МА).

Методика эксперимента

А. Маломасштабное получение конъюгата формулы I

208 мг (5,2 мкмоля) реагента формулы II (средняя молекулярная масса 40000 Да) добавляли к 50 мг (2,6 мкмоля) -IFN в 10 мл 100 мМ боратного буфера, рН 8,0. Конечное молярное соотношение протеин:реагент составляло 1: 2. Реакционную смесь перемешивали при 4^oС в течение 2 часов. Реакцию прекращали путем доведения рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кислоты.

Реакционную смесь 50-кратно разбавляли водой, фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм и вносили в колонку типа Amicon, заполненную 100 мл (3,2х13 см) смолы Fractogel EMD CM 650(S) при скорости потока 20 мл/мин. Колонку предварительно уравновешивали с помощью 10 мМ ацетата аммония, рН 4,5. Выходящий из колонки продукт анализировали с помощью УФ-абсорбции при 280 нм. Затем колонку промывали уравновешивающим буфером до тех пор, пока УФ-абсорбция не возвращалась к базовому уровню. Конъюгаты ПЭГ-IFN, имеющие более одного присоединенного реагента формулы II (олигомеры ПЭГ-IFN), элюировали с помощью 40 мМ ацетата аммония, рН 4,5, а конъюгат формулы I элюировали с помощью 0,12 М NaCl в 40 мМ аммоний-ацетатном буфере. Оставшийся на колонке немодифицированный IFN элюировали с помощью 0,5 М NaCl в таком же буфере. Колонку регенерировали, промывая 1,0 М NaCl, с последующей промывкой уравновешивающим буфером. Объединенные фракции конъюгатов формулы I концентрировали с использованием вакуумного фильтра для перемешанных клеток типа Amicon, снабженного мембраной типа YM10, до концентрации приблизительно 1 мг/мл.

Примененная для очистки катионообменная смола Fractogel CM 650(S) эффективно адсорбировала ПЭГ и немодифицированный IFN. Интенсивность адсорбции зависела от степени ПЭГилирования. Конъюгаты связывались менее сильно по сравнению с немодифицированным IFN. Олигомеры ПЭГ-IFN элюировали с помощью 40 мМ ацетата аммония, в то время как конъюгат формулы I элюировали с помощью 0,12 М NaCl. Немодифицированный IFN элюировали с помощью 0,5 М NaCl. Все препараты содержали <5 ЭЕ (эндотоксиновых единиц)/мг эндотоксинов. Образовавшийся препарат содержал >99% конъюгата формулы I и был лишен немодифицированного IFN.

Б. Крупномасштабное получение конъюгата формулы I

6240 мг (156 мкмолей) реагента формулы II (средняя молекулярная масса 40000 Да) растворяли при 4^oС в 63 мл 1 мМ НС1 и быстро добавляли к 125 мл раствора, содержащего 1000 мг (52 мкмоля) интерферона в 50 мМ боратном буфере, рН 9,0. Конечное отношение протеин/реагент составляло 1:3, а конечная концентрация протеина в реакционной смеси была равна 5,3 мг/мл. Реакционную смесь перемешивали при 4^oС в течение 2 часов. Реакцию прекращали путем доведения рН до 4,5 с помощью ледяной уксусной кислоты.

Реакционную смесь 10-кратно разбавляли водой и наносили на колонку, заполненную 600 мл смолы Fractogel EMD CM 650 (М) и предварительно уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 4,5, при линейной скорости 1,3 см/мин. Колонку промывали уравновешивающим буфером, а затем 10 мМ NaCl для удаления избытка реагента, побочных продуктов реакции и олигомеров ПЭГ-IFN. Конъюгат формулы I элюировали с помощью уравновешивающего буфера, содержащего 200 мМ NaCl. Немодифицированный интерферон, еще сохранившийся на колонке, удаляли, промывая 0,75 М NaCl в уравновешивающем буфере. Конъюгат формулы I, который элюировали при концентрации 0,3-0,5 мг/мл, затем концентрировали и для окончательного приготовления лекарственного средства фильтровали путем диализа в 20 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, содержащем 150 мМ NaCl. Общий выход конъюгата формулы I составлял 40-45%.

Очищенный ПЭГ-IFN из препарата при крупномасшабном способе получения состоит более чем на 99% из конъюгата формулы I. Средняя молекулярная масса конъюгата формулы I из этого примера составляет 62000 Да, включая молекулярную массу 2a-IFN, которая равна 19241 Да, и среднюю молекулярную массу реагента, которая находится в интервале между 40000 Да и 45000 Да, составляя приблизительно 43000 Да.

Пример 2

Характеристика конъюгата формулы I

Определение протеина

Концентрации протеина определяли, используя значение А₂₈₀, равное 1, для раствора с концентрацией 2a-IFN 1 мг/мл.

Анализ с использованием ПААГ-ДСН

Конъюгат анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (8-16%) в присутствии додецил-(лаурил-) сульфата натрия в восстановительных условиях в соответствии с методами Laemmli (Nature 227, 680 (1970)). ПААГ-ДСН-гели, содержащие ПЭГ-конъюгаты, окрашивали для определения протеина, используя краситель Fast Stain (фирма Zoion Research, Inc.), в соответствии с инструкциями производителя.

Определение уровней эндотоксина

Уровни эндотоксина определяли, используя LAL-тест в соответствии с инструкциями производителя. Все препараты содержали <5 ЭЕ/мг эндотоксинов.

Пример 3

Биологические активности in vitro конъюгата формулы I

Антивирусная активность в бычьих почечных клетках

Антивирусную активность in vitro 2a-IFN и конъюгата формулы I, полученного по описанной в примере 1.А методике, определяли с помощью биологического анализа культуры клеток, используя бычьи почечные клетки линии Madin-Darby (MDBK), зараженные вирусом везикулярного стоматита (Rubinstein и др. , см. выше). Показатели антивирусных активностей приведены в таблице 1 наряду с соответствующими остаточными активностями в процентах по отношению к исходному IFN.

Антипролиферативная активность in vitro на клетках опухоли человека

Антипролиферативную активность in vitro определяли на человеческих клетках линии Daudi (лимфома Беркитта), как описано у Borden и др. Человеческие клетки линии Daudi поддерживали в виде стационарных суспензионных культур в среде RPMI 1540, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой и 2 мМ глутамином (Grand Island Biologicals, Гранд Исланд, шт. Нью-Йорк). Клетки подвергали скринингу и было обнаружено, что они лишены микоплазмы. Клетки (2х10⁴) добавляли в лунки планшетов для микротитрования (Costar, MA) с 100 мкл среды. Различные концентрации IFN и конъюгата формулы I, полученного по описанной в примере 1.А методике, добавляли в лунки объемом 100 мкл. Планшеты инкубировали при 37^oС в 5% СО₂ в течение 72 часов. За 16 часов до сбора клеток их обрабатывали ³Н-тимидином (New England Nuclear, Бостон, MA) в дозе 0,25 мкКи/лунку. Клетки собирали на стеклянные фильтры и измеряли радиоактивность с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. Результаты выражали в виде % ингибирования, вычисляемого по формуле:

% ингибирования = [(А-В)/А]х100,

где А обозначает количество импульсов в минуту в контрольной культуре (клетки, инкубированные в чистой среде);

В обозначает количество импульсов в минуту в экспериментальной культуре.

Опыты проводили в четырех повторностях, а стандартное отклонение во всех случаях составляло менее 20% от среднего значения. Эксперименты повторяли по крайней мере дважды, получая сопоставимые результаты.

Антипролиферативные активности (IC₅₀) IFN и конъюгата формулы I приведены в таблице 2. Данные показывают, что существует 28-кратное увеличение антипролиферативной активности конъюгата формулы I по сравнению с таковой у IFN.

Пример 4

Фармакокинетика

Самок крыс линии Sprague Dawley со средней массой тела 240-260 г, которым хирургическим путем имплантировали канюли в яремные вены, размещали каждую по отдельности, обеспечивая свободный доступ к пище и воде, и содержали при 12-часовом светотемневом цикле. Через 4-6 часов после введения канюли, находящиеся в яремных венах, заливали ЗФР. На следующий день после введения в канюли 0,15-0,2 мл ЗФР крысам инъецировали 2х10⁶ единиц -IFN в 0,2-0,4 мл ЗФР, а затем вновь инъецировали 0,15-0,2 мл ЗФР, чтобы гарантированно обеспечить поступление всего количества лекарства в организм животного. Таким образом, каждое животное получало дозу 8х10⁶ единиц -IFN/кг массы тела.

Через 5, 15 и 30 минут, а также через 1, 3, 5, 12 и 24 часа после инъекции IFN и конъюгата формулы I отбирали образцы крови. После отбрасывания первой порции крови объемом 0,15-0,2 мл через яремную канюлю каждый раз отбирали аликвоту крови объемом 0,5 мл, используя новый шприц. При комнатной температуре образцы помещали в пробирки для отделения сыворотки. Сразу после того, как все образцы в рассматриваемый момент времени были собраны, пробирки центрифугировали при 14000xg в течение 10 минут в центрифуге Эппендорфа с охлаждением. Отделенную сыворотку переносили в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и замораживали при -80^oС до проведения биологического анализа. Образцы сыворотки соответствующим образом разбавляли и для каждого момента времени определяли антивирусную активность, как описано ранее. Из графика зависимости активности от времени определяли окончательный период полураспада конъюгата формулы I и -IFN, эти данные приведены в таблице 3, в которой также указано время его нахождения в плазме.

Окончательный период t_1/2 определяли методом линейной регрессии в логарифмическом масштабе.

Пример 5

Иммуногенность

Нормальным мышам линии BDF-1 (десять особей в группе) внутрибрюшинно инъецировали один раз в день пять раз в неделю различные препараты интерферона, содержащие 300000 единиц антивирусной активности. Некоторым мышам также инъецировали составную форму 2a-IFN, которая является более иммуногенной, чем мономерная форма. Образцы крови брали на 19 день после последней инъекции и анализировали сыворотку на наличие нейтрализующих антител.

Как видно из таблицы 4, мыши, которым инъецировали 2a-IFN, вырабатывали нейтрализующие антитела, и эта реакция была сильно увеличена у мышей, которым инъецировали составные формы интерферона. У большинства животных, которым инъецировали конъюгат по настоящему изобретению, не было обнаружено антител.

Пример 6

Противоопухолевая активность in vivo

Противоопухолевую активность in vivo конъюгата формулы I (ПЭГ2-2a-IFN) и немодифицированного 2a-IFN оценивали путем определения их способности уменьшать размер различных человеческих клеток опухоли, подкожно имплантированных мышам. Результаты показаны на фиг. 1-6.

Методика: Лишенным шерсти мышам (линии Harlan), у которых отсутствовала вилочковая железа, подкожно вводили в заднюю часть левого бока имплантат, содержащий 2х10⁶ почечных клеток человека линии А498 (фиг. 1 и 2), почечных клеток человека линии ACNH (фиг. 3 и 4) или почечных клеток человека линии G402 (фиг. 5 и 6). В течение 3-6 недель опухолям давали оформиться, как указано далее. Критерий размера, приемлемого для исследования, составлял от 0,05 до 0,5 см³. Мышам вводили совокупные ежедневные дозы ПЭГ2-2a-IFN или немодифицированного 2a-IFN, составляющие 30, 60, 120 или 300 мкг. В случае ПЭГ2-2a-IFN мышей обрабатывали один раз в неделю (в понедельник), используя по 30, 60, 120 или 300 мкг ПЭГ2-2a-IFN на обработку. В случае немодифицированного 2a-IFN мышей обрабатывали три раза в неделю (в понедельник, среду и пятницу), используя по 10, 20, 40 или 100 мкг 2a-IFN на обработку. Продолжительность обработки составляла 4-5 недель в зависимости от интенсивности роста (агрессивности) опухоли. Объемы опухоли измеряли каждый понедельник до обработок.

Результаты: ПЭГ2-2a-IFN привел к заметному уменьшению размера опухоли, вызванной клетками А498, по сравнению с немодифицированным 2a-IFN при всех исследованных уровнях еженедельных доз на 7 день, 14 день, 21 день и 28 день после начала обработки (фиг. 1 и 2). Обработку продолжали в течение 4 недель. Через семь дней после прекращения обработки трех мышей в каждой группе умервщляли. У трех мышей, подвергавшихся обработке ПЭГ2-2a-IFN, не обнаружили остатков опухоли. У мышей, подвергавшихся обработке немодифицированным 2a-IFN, масса опухоли, вызванной клетками А498, составила 1,28 г, 0,62 г и 1,60 г соответственно у каждой из трех мышей. Масса опухоли, вызванной клетками А498, составила 2,32 г, 2,37 г и 1,94 г у каждой из трех мышей в контроле. На 80 день после окончания четырехнедельного периода обработки наличие опухоли определяли пальпацией семи мышей. При пальпации у всех семи мышей не обнаружили наличия опухолевой ткани.

ПЭГ2-2a-IFN привел к значительному уменьшению размера опухоли, вызванной клетками ACNH, по сравнению с немодифицированным 2a-IFN при уровнях еженедельных доз 60, 120 и 300 мкг на 14 день, 21 день, 28 день и 35 день (фиг. 3 и 4).

ПЭГ2-2a-IFN привел к значительному уменьшению размера опухоли, вызванной клетками G402, по сравнению с немодифицированным 2a-IFN при уровнях еженедельных доз 60 и 120 мкг на 14 день, 21 день, 28 день и 35 день (фиг. 5 и 6).