полипептидный препарат из бурсы кур, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе

Формула изобретения

1. Полипептидный препарат из бурсы кур, полученный путем гомогенизации исходного сырья, экстрагирования, нагревания экстракта, удаления балластных термолабильных белков, удаления белков с молекулярной массой более 10 кД, полученный продукт содержит комплекс термостабильных пептидов с молекулярной массой до 10 кД и обладает иммуностимулирующими свойствами в отношении В-системы иммунитета.

2. Способ получения полипептидного препарата из бурсы кур, включающий измельчение бурсы до гомогенной массы, экстрагирование гомогената водной уксусной кислотой, удаление жмыха, освобождение экстракта от термолабильных балластных белков подогревом с последующим центрифугированием при 2000-4000 об/мин, ультрафильтрацию для удаления белков с молекулярной массой более 10 кД.

3. Фармацевтическая композиция на основе препарата, охарактеризованного в п. 1, содержащая следующие компоненты:

Полипептидный препарат - 3-10 мг

D-манит - 15-25 мг

Раствор натрия хлорида 0,9% - 1,0 мл

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению препаратов, применяемых для лечения первичных и вторичных иммунодефицитов. Изобретение может быть использовано в медицинской, а также ветеринарной промышленности для приготовления лиофилизированной инъекционной формы полипептидного препарата (ППП) в комплекте со стерильным физиологическим раствором или инъекционной водой.

Известен способ приготовления иммуномодулирующего полипептидного препарата, действующего на В-систему иммунитета, который отличается от предлагаемого тем, что получают препарат из костного мозга свиней и субстратов морских животных путем измельчения костного мозга и субстрата морских животных, трехкратной экстракции в 3% растворе трихлоруксусной кислоты на холоду, диализа экстракта в дистиллированной воде, удаления балластов из диализата сульфатом аммония, осаждения охлажденным ацетоном в течение 24 часов, сбора осадка на фильтре и его подсушивания на воздухе, растворения белков подогретым бидистиллятом, лиофилизации раствора, обессоливания и концентрирования препарата ультрафильтрацией на мембране "Amicon-10", после чего фильтрат лиофилизируют и порошок растворяют в ацетат-аммонийном буфере, подкисляя раствор 0,1 М раствором уксусной кислоты до полного растворения (1).

Известен также способ получения иммуномодулирующего средства из свиной грудной кости, отличающийся от предлагаемого тем, что получают препарат из красного костного мозга грудной кости путем его культивирования в специальной питательной среде с последующим отделением клеток центрифугированием, гель-хроматографией супернатанта на сефадексе G-50 с целью отделения балластных примесей и лиофилизацией активных фракций (2).

К недостаткам рассматриваемых способов получения иммуномодулирующих препаратов следует отнести их трудоемкость, а также сложность в получении исходного материала (получение и доставка живых костномозговых клеток).

Задачей изобретения является разработка иммуномодулирующего полипептидного препарата из бурсы кур, простого и эффективного способа получения этого препарата и фармацевтической композиции на его основе.

Указанная задача решается созданием препарата из бурсы кур путем гомогенизации исходного сырья, экстрагирования, нагревания экстракта, отделения на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой более 10 кД. Полученный ультрафильтрат содержит комплекс термостабильных пептидов с молекулярной массой до 10 кД и обладает иммуностимулирующими свойствами в отношении В-системы иммунитета.

Кроме того, создан способ выделения ППП из бурсы кур - практически бездефицитного, неограниченного сырьевого источника, не требующего трудоемкой подготовки, путем измельчения бурсы до гомогенной массы, экстрагирования гомогената в 0,1 М водной уксусной кислотой, удаления жмыха, освобождения экстракта от термолабильных балластных белков подогревом с последующим центрифугированием при 2000-4000 об/мин и ультрафильтрацией на мембране для удаления белков с молекулярной массой, превышающей 10 кД.

Третьим объектом изобретения является создание фармацевтической композиции на основе разработанного полипептидного препарата, содержащей следующие компоненты: полипептидный препарат в количестве 3-10 мг, D-манит - 15-25 мг и физиологический раствор (например, водный раствор натрия хлорида 0,9%) - 1,0 мл.

Приготовление фармацевтической композиции осуществляют путем разбавления ультрафильтрата до содержания в нем пептидов 3-10 мг/мл и добавления в разбавленный ультрафильтрат D-манита до его содержания в растворе 15-25 мг/мл. Для использования фармацевтической композиции проводят стерилизующую фильтрацию раствора через мембраны с размером пор 0,22 мкм и розлив стерильного ультрафильтрата по 1 мл во флаконы или ампулы с последующей лиофилизацией. Указанным способом получают сухую инъекционную форму композиции, к которой прилагают физиологический раствор для растворения перед употреблением.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

1 кг бурсы кур, измельченной на волчке, гомогенизируют с 1 л 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 3 минут, затем гомогенат переносят в экстрактор, добавляют в него 3 л 0,1 М раствора уксусной кислоты и при постоянном перемешивании проводят экстракцию в течение 0,5 часа. По истечении указанного времени через двойной слой марли отделяют жмых, а экстракт подогревают на водяной бане до температуры 70^oС и выдерживают его при указанной температуре в течение 3 минут, затем экстракт охлаждают до температуры 15^oС. Образовавшийся из термолабильных белков коагулят удаляют центрифугированием при 2000 об/мин и температуре 4^oС в течение 1 часа. Супернатант фильтруют через бумажный фильтр, затем осветленный фильтрат пропускают через мембранный фильтр, задерживающий пептиды с молекулярной массой более 10 кД. Ультрафильтрат разбавляют инъекционной водой до содержания сухого остатка 3 мг/мл, добавляют в разбавленный ультрафильтрат D (-) манит из расчета 17 мг на 1 мл, затем раствор фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и разливают по 1 мл во флаконы вместимостью 5 мл или в ампулы вместимостью 2 мл. После разлива ППП лиофильно высушивают, флаконы укупоривают пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а ампулы запаивают.

Пример 2.

1 кг бурсы кур, измельченной на волчке, гомогенизируют с 1 л 0,1 М раствора уксусной кислоты в течение 5 минут, затем гомогенат переносят в экстрактор, добавляют в него 3 л 0,1 М раствора уксусной кислоты и при постоянном перемешивании проводят экстракцию в течение 1 часа. По истечении указанного времени через двойной слой марли отделяют жмых, а экстракт подогревают на водяной бане до температуры 90^oС и выдерживают его при указанной температуре в течение 3 минут, затем экстракт охлаждают до температуры 20^oС. Образовавшийся из термолабильных белков коагулят удаляют центрифугированием при 4000 об/мин и температуре 10^oС в течение 1 часа. Супернатант фильтруют через бумажный фильтр, затем осветленный фильтрат пропускают через мембранный фильтр, задерживающий пептиды с молекулярной массой более 10 кД. Ультрафильтрат разбавляют инъекционной водой до содержания сухого остатка 10 мг/мл, добавляют в разбавленный ультрафильтрат D (-) манит из расчета 23 мг на 1 мл, затем раствор фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и разливают по 1 мл в флаконы вместимостью 5 мл или ампулы вместимостью 2 мл. После разлива ППП лиофильно высушивают, флаконы укупоривают пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а ампулы запаивают.

Пример 3.

Индекс стимуляции (ИС) представляет собой отношение средней величины селезеночных фолликулов опытных животных, получивших фармацевтическую композицию, к этому показателю у мышей контрольной циклофосфановой группы. Метод основан на способности фармацевтической композиции из бурсы кур увеличивать размер лимфатических фолликулов селезенки у мышей с иммунодепрессией, вызванной циклофосфаном.

Метод включает три этапа: первый этап - подавление иммунной системы однополых, нелинейных мышей с массой тела 18-20 г циклофосфаном; второй этап - стимуляция опытной группы мышей испытуемой композицией; третий этап - определение размера лимфатических фолликулов в селезенке опытных и контрольных мышей.

На первом этапе всем мышам внутрибрюшно однократно вводят циклофосфан в дозе 4 мг в 0,5 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Затем мышей делят на 3 группы, одна из которых контрольная, а две - опытные.

На втором этапе первой опытной группе мышей подкожно вводят фармацевтическую композицию в дозе 5 мкг/мышь, содержащуюся в 0,2 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций, второй опытной группе мышей в тех же условиях вводят фармацевтическую композицию в дозе 10 мкг/мышь.

Через трое суток после введения фармацевтической композиции контрольных и опытных мышей убивают и извлекают из них селезенку.

На третьем этапе определения индекса стимуляции В-системы иммунитета из извлеченной селезенки известными методами приготавливают гистологические препараты и определяют в них размеры лимфатических фолликулов. При этом измеряют величину не менее 10 фолликулов на двух срезах, полученных от каждого животного в данной группе. По результатам измерений находят среднюю величину размера лимфатических фолликулов для каждой группы животных.

Активность фармацевтической композиции определяют по отношению средней величины селезеночных фолликулов животных каждой опытной группы к этому показателю у мышей контрольной циклофосфановой группы.

Результаты анализа фармацевтической композиции, полученной из бурсы кур, на соответствие проекту временной фармакопейной статьи (ВФС) представлены в таблице.

Заявленная разработка позволит обеспечить здравоохранение и ветеринарию новым эффективным и недорогим отечественным средством для стимулирования В-системы иммунитета.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент Россия 1077089, кл. МКИ А 61 К 35/28 29.09.95 (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Сидорова).

2. Патент СССР 1836954, кл. МКИ А 61 К 35/28 30.09.93 (Владивостокский государственный медицинский институт).