способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков
Классы МПК: | A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные |
Автор(ы): | Беляков Н.В., Коробицын Л.П., Пивоваров А.М., Прокопьев А.А. |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "Протеиновый контур" |
Приоритеты: |
подача заявки:
2001-06-26 публикация патента:
10.03.2002 |
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения лекарственных форм рекомбинантных белков. Сущность изобретения состоит в том, что при приготовлении жидкой лекарственной формы соответствующего рекомбинантного белка эффективное количество последнего растворяют в биосовместимом буферном растворе, содержащем неионный детергент и в некоторых случаях дополнительно стабилизатор. Для приготовления лекарственной формы берут буферный раствор со значением рН, отличающийся более чем на 1 единицу от изоэлектрической точки белка. Это обеспечивает стабильное нахождение белка при низких концентрациях (1-100 мкг/мл) в растворах без агрегации и олигомеризации. В качестве детергента можно использовать Tween-20, Tween-80, Tween-60, Nonidet P-40 и др. В качестве биосовместимых буферных систем могут быть использованы изотонические буферные растворы на основе цитратов, ацетатов, фосфатов и др. В ряде случаев для корректировки осмолярности растворы могут содержать в качестве стабилизатора биосовместимые полимерные компоненты - многоатомные спирты, декстрины, поливинилпирролидоны и др. Технический результат заключается в том, что в результате разработанного способа получают более дешевый и безопасный препарат. 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7
Формула изобретения
1. Способ получения жидких лекарственных форм рекомбинантных белков (белков генно-инженерного происхождения), включающий растворение данных белков в биосовместимом буферном растворе, отличающийся тем, что в биосовместимый буферный раствор добавляют неионный детергент, после чего вводят рекомбинантный белок эффективной концентрации, при этом используют буферный раствор, имеющий значение показателя водородного потенциала более чем на одну единицу отличающегося от изоэлектрической точки данного белка. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что детергент вводят в буферный раствор в количестве 0,01-0,05 мас. %. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в биосовместимый буферный раствор дополнительно вводят стабилизатор углеводной природы в количестве 2-5 вес. %. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биосовместимый буферный раствор содержит в качестве стабилизатора многоатомные спирты и/или водорастворимый полимер.Описание изобретения к патенту
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения лекарственных форм рекомбинантных белков. Терапевтически значимые белки, полученные на основе технологии рекомбинантных ДНК, в последние годы получили широкое распространение для лечения широкого круга заболеваний. К наиболее значимым и распространенным препаратам данного класса следует отнести препараты, созданные на основе рекомбинантных эритропоэтина, интерферона-альфа, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и некоторых других цитокинов человека. Общим для данного класса веществ является практическая невозможность и нецелесообразность выделения их из природных источников и, как следствие, получение их в искусственно созданных прокариотических (как правило, E.Coli) или эукариотических (обычно СНО) системах. Белки данного класса обладают высокой удельной биологической активностью, вследствие чего их разовая терапевтическая доза находится в микрограммовом диапазоне. Некоторые из используемых в медицинской практике белков данного класса (как правило, получаемых в прокариотических системах) находятся в частично денатурированном состоянии и склонны к агрегации и выпадению в осадок. В первую очередь это относится к рекомбинантным интерферонам-альфа. В процессе приготовления лекарственных форм на основе белков данного класса наиболее распространенным в настоящее время подходом является введение в состав готового лекарственного средства в качестве стабилизатора сывороточного альбумина и/или сублимационная сушка. Однако оба этих подхода не свободны от недостатков. Введение в качестве стабилизатора сывороточного альбумина человека повышает риск вирусных контаминаций препарата и ограничивает его применение пациентами некоторых религиозных конфессий. Сублимационная сушка не только снижает активность препарата, но и вызывает частичную денатурацию альбумина, что в свою очередь иногда приводит к аллергическим реакциям у пациентов. Ранее было описано и реализовано приготовление лекарственной формы препарата рекомбинантного интерферона-альфа человека, свободного от сывороточного альбумина человека. Для этого в состав для сушки в качестве наполнителя вводили декстраны (РЕАЛЬДИРОН, БИОТЕХНА, Литва). Подобный подход позволяет произвести сушку препарата, но стабильность в растворе остается низкой за счет потерь на стенках сосуда и агрегации. Другим подходом к решению проблемы стабильности рекомбинантных белков в готовых лекарственных формах является введение в композицию мочевины, комплекса амфотерных электролитов (аминокислот) и детергентов с последующей лиофильной сушкой (RU 2043118), где удалось получить стабильную лекарственную форму рекомбинантного эритропоэтина человека. В то же время имеются существенные ограничения на срок хранения препарата после его растворения. Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ приготовления готовых форм рекомбинантных белков [US 5,656,730, 1996, МПК А 61 К 035/14; А 61 К 38/00; С 07 К 014/505; С 07 К 014/535] , согласно которому лекарственные формы рекомбинантных белков приготовляли с использованием сложных композиций, состоящих из комплекса аминокислот, хлорбутанола, бензилового спирта, бензалкониумхлорида и неорганических компонентов буферных растворов. Согласно прототипу для получения готовой лекарственной формы, содержащей 10-2000 мкг/мл рекомбинантного белка, в указанном растворе растворяют соответствующее количество субстанции и используют полученный раствор в равной степени для приготовления жидкой или лиофилизованной формы. Существенным недостатком данного подхода является необходимость использования крайне сложной композиции, содержащей такие компоненты, как 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанол, бензиловый спирт и бензалкониум хлорид. Задачей изобретения является разработка более простого и дешевого способа получения лекарственных форм рекомбинантных белков, обладающих стабильной биологической активностью при хранении. Технический результат заключается в том, что в результате разработанного способа получают более дешевый и безопасный препарат, не включающий токсичных компонентов. Поставленная задача решается посредством того, что при приготовлении жидкой лекарственной формы соответствующего рекомбинантного белка эффективное количество последнего растворяют в биосовместимом буферном растворе, содержащем неионный детергент и в некоторых случаях дополнительно стабилизатор. Для приготовления лекарственной формы берут буферный раствор со значением рН, отличающимся более чем на 1 единицу от изоэлектрической точки белка. Это обеспечивает стабильное нахождение белка при низких концентрациях (1-100 мкг/мл) в растворах без агрегации и олигомеризации. В качестве детергента можно использовать Tween-20, Tween-80, Tween-60, Nonidet P-40 и др. В качестве биосовместимых буферных систем могут быть использованы изотонические буферные растворы на основе цитратов, ацетатов, фосфатов и др. В ряде случаев для корректировки осмолярности растворы могут содержать в качестве стабилизатора биосовместимые полимерные компоненты - многоатомные спирты, декстрины, поливинилпирролидоны и др. Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Получение жидкой лекарственной формы рекомбинантного интерферона-альфа человекаДля получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного интерферона-альфа использовали высокоочищенный препарат, выделенный из телец включения штамма E.Coli IF212S, не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза и примесей белков клеток-продуцентов. Удельная биологическая активность препарата составляла 2









Для получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного эритропоэтина человека использовали высокоочищенный препарат, выделенный из кондиционированной культуральной жидкости клеток СНО SP/M pZip NeoEPO SV(x) DFR в соответствии с методом, описанным в патенте [RU 2145610, М.кл6 C 12 N 11/00] и не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза, и примесей белков клеток-продуцентов. Удельная биологическая активность препарата составляла 1,4






Для получения жидкой лекарственной формы рекомбинантного Г-КСФ человека использовали высокоочищенный препарат, выделенный из кондиционированной культуральной жидкости клеток СНО pZip NeoGCSF CMV(x) DFR, не содержащий заметных примесей олигомерных форм, продуктов протеолиза, и примесей белков клеток-продуцентов (фиг. 5). Удельная биологическая активность препарата составляла 1,1




Для исследования влияния стабилизирующих свойств некоторых компонентов небелковой природы была приготовлена серия растворов лактозы, маннита, поливинилпирролидона 8000 (ПВП) и декстрана 10000 в 0,02 М натрий-фосфатном буферном растворе, содержащем 0,15 М хлорида натрия, 0,02% Твин-20, рН=7,0. Рекомбинантный Г-КСФ человека, как в примере 3, был внесен из расчета 3

Класс A61K38/00 Лекарственные препараты, содержащие пептиды
Класс A61K38/02 пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные