способ получения вещества, обладающего иммуномодулирующей активностью

Формула изобретения

Способ получения вещества, обладающего иммуномодулирующей активностью из клеток Scorzonera hispanica ВСКК-ВР 35, характеризующийся тем, что осуществляют экстракцию вещества из клеточной биомассы водным раствором этанола, сгущение экстракта, его растворение в системе хлороформ: метанол: вода - 5: 6: 4 об. ч. , выделение фракции, содержащей вещество, упаривание ее, затем растворение в системе гексан: метанол - 7: 4 об. ч. , упариванине образующегося нижнего слоя и очистку методом жидкость - жидкостной хроматографии в системе хлороформ: метанол: вода - 5: 6: 4 об. ч. и перекристаллизацией из этанола.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности, в частности к производству лекарственных препаратов и лечению иммунодефицитных и аутоиммунных заболеваний.

Известен штамм клеток корончато-галловой опухоли растения Scorzonera hispаniсa ВСКК-ВР 35, обладающий биологической активностью (Гамбург К. З. и др. Пат. РФ, 2059718 от 10.05.1996). Недостатком известного способа является ограниченный срок хранения и непостоянство химического состава, отражающееся на показателях биологической активности.

В качестве прототипа выбран иммуномодулятор и адаптоген природного происхождения жидкий экстракт элеутерококка (И. В. Дардымов, Э. И. Хасина. "Элеутерококк", Санкт-Петербург: Наука, 1993, 124 с. ). Его получают экстракцией корней растения элеутерококк колючий водным спиртом с последующим сгущением, отстаиванием и фильтрованием. Недостатками прототипа являются относительно высокая стоимость, недостаточная и нестабильная клиническая эффективность и ограниченные запасы медленно возобновляемого сырья.

Целью изобретения является получение чистого химического вещества из штамма клеток Scorzonera hispаniсa ВСКК-ВР 35, обладающего способностью регулировать реактивность иммунной системы и пригодного для лечения иммунодефицитных и аутоиммунных заболеваний.

Поставленная цель достигается за счет того, что из вышеупомянутого штамма клеток готовится спиртовая вытяжка, из которой путем процессов многоступенчатой экстракции и использования жидкость-жидкостной хроматографии выделяется чистое химическое вещество, обладающее стабильностью, постоянством состава и воспроизводящее биологические свойства штамма клеток Scorzonera hispanica.

Опыты на животных показывают, что внутрибрюшинные инъекции вещества ускоряют заживление ожогов и повышают показатели иммунной реактивности животных, подвергнутых иммуносупрессии.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Биомассу клеток Scorzonera hispаniсa ВСКК-ВР 35 освобождают от культуральной среды фильтрованием и дважды экстрагируют смесью этанола и воды (1: 1). Полученный экстракт сгущают в вакууме до небольшого объема при температуре <50С и экстрагируют хлороформом. Дальнейшей обработке подвергаются как хлороформный, так и водный слои. Хлороформный экстракт упаривают досуха и распределяют между метанолом и гексаном, взятым в объемном соотношении 7: 4. Отбирают метанольный слой (фракция 1). Процедуру повторяют трижды. Водный слой тщательно экстрагируют нижней фазой системы растворителей хлороформ-метанол-вода 5: 6: 4 об. ч. (система А) и органическую фазу объединяют с фракцией 1. Объединенные вытяжки упаривают досуха и подвергают очистке методом жидкость-жидкостной хроматографии с использованием системы А. Собирают фракции, содержащие вещество К212. О его наличии судят с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках силуфол в системе растворителей хлороформ-метанол 17: 3, проявитель ванилинфосфорная кислота. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают. Остаток дважды перекристаллизовывают из этанола. Получают белое кристаллическое вещество, обозначаемое как К212, с т. пл. 177-179^oС и []²⁵₅₄₆-7⁰ (с= 0,72, этанол).

Пример 2

Биомассу клеток Scorzonera hispаniсa ВСКК-ВР 35 дважды экстрагируют этиловым спиртом в соотношении 1: 1. Экстракт отфильтровывают на воронке Бюхнера через фильтровальную бумагу.

Объединенный экстракт упаривают на роторном испарителе в вакууме при температуре <50C. Сухой остаток растворяют в верхней фазе системы хлороформ-метанол-вода 5: 6: 4 об. ч. (система А) и выливают в делительную воронку с той же системой А. После встряхивания и отстаивания отделяют нижний слой, а верхний дважды экстрагируют нижней фазой системы А. Объединенный нижний слой промывают небольшим количеством верхней фазы системы А и упаривают досуха при температуре <50C.

Для извлечения целевого вещества К212 используют систему растворителей гексан-метанол в объемном соотношении 7: 4 (система Б). Сухой экстракт растворяют в нижней фазе системы Б и выливают в делительную воронку с этой же системой. После встряхивания и расслаивания верхний слой удаляют, а нижний дважды экстрагируют верхней фазой системы Б. Нижний слой, содержащий целевой продукт, упаривают в вакууме при температуре <50C.

Выделение чистого вещества К212 производят на противоточном жидкость-жидкостном хроматографе в системе растворителей А, как описано в примере 1

Пример 3.

Действие вещества К212 на показатели клеточного и гуморального иммунитета изучалось на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной классическим иммунодепрессантом азатиоприном. Эксперименты проведены на мышах обоего пола линии F₁(CBAxC57B1 6) и на мышах-самцах линии СВА, массой 20-22 г.

Терапевтическую дозу вещества К212 в физиологическом растворе вводили внутрибрюшинно. В качестве препарата сравнения использовали жидкий экстракт Eleuterococcus senticosus в дозе 5 мл/кг перорально. В качестве иммунодепрессанта использовали азатиоприн, который вводили перорально в дозе 0,1 мл/мышь в течение 5 дней. Через 1 сутки после последнего введения изучаемых средств взвешивали лимфоидные органы и рассчитывали отношение их массы к массе тела животного в %. Контролем служила группа интактных животных того же возраста и пола, получавших только очищенную воду.

Состояние клеточного иммунитета оценивали в реакции ГЗТ по стандартной методике. Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток, определяемых методом локального гемолиза.

Результаты экспериментов сведены в таблицы 1 и 2.

Таким образом, исследование иммуномодулирующих свойств препарата К212 выявило его эффективность по отношению к реакциям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа. Он способен отменять супрессивное действие азатиоприна на клеточно-опосредованную иммунную реакцию и антителогенез, что выражается в восстановлении иммунных реакций до уровня таковых у контрольных животных. Исследованное вещество по выявленному иммуномодулирующему эффекту превосходит прототип - жидкий экстракт элеутерококка.