способы и композиции для обнаружения in vivo оральных злокачественных опухолей и предраковых состояний

Формула изобретения

1. Способ обнаружения in vivo предраковых оральных поражений и оральных карцином, включающий стадии последовательного промывания полости рта красящей композицией, которая избирательно удерживается раковыми и предраковыми тканями, и ополаскивающей композицией для удаления неудержанной композиции красителя, характеризующийся тем, что на ткань полости рта наносят красящую композицию, содержащую нетоксичный краситель, выбранный из группы, состоящей из Азура (кобальтовой сини) В, Азура С, Азура А и бриллиантового крезилового синего.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный краситель представляет собой бриллиантовый крезиловый синий.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный краситель выбирают из группы, состоящей из Азура В и Азура С.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный краситель представляет собой Азур В.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный краситель представляет собой Азур С.

6. Биологическая композиция для обнаружения in vivo раковой и предраковой ткани, содержащая нетоксичный краситель, выбранный из группы, состоящей из Азура (кобальтовой сини) В, Азура С, Азура А и бриллиантового крезилового синего, и фармацевтически приемлемый окислитель для лейкоформы красителя.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам обнаружения in vivo предраковых оральных повреждений (патологических изменений ткани) и оральных карцином.

В другом аспекте данное изобретение относится к композициям для проведения таких диагностических процедур.

В следующем аспекте изобретение относится к таким диагностическим процедурам in vivo и композициям, применимым в них, которые, в частности, применимы в скрининге больных на возможный оральный рак как части рутинных обследований стоматолога или врача или таких процедур, как периодические осмотры, обработки зубов и т. д.

Еще в одном аспекте данное изобретение относится к таким процедурам и композициям, которые используют красители, которые более легко доступны и/или являются менее дорогими и более легко синтезируемыми и/или очищаемыми, чем красители, используемые в прежних процедурах.

Еще в одном аспекте изобретение относится к процедурам in vivo и композициям, использующим красители, которые потенциально менее токсичны, чем применяемые ранее производные флуоресцеина и метиленовый синий, и которые, следовательно, могут использоваться путем промывания всей полости рта и/или посредством полоскания.

Диагностические процедуры in vivo для обнаружения предраковых оральных поражений или оральных карцином с использованием красящих композиций, которые избирательно удерживаются тканями, превращающимися в патологические вследствие дисплазии, гиперплазии, опухолеобразования и других активных поверхностных изменений, известны в данной области. Например, способы с использованием флуоресцеина или производных флуоресцеина описаны Chenz, Chinese Journal of Stomatology (27: 44-47 (1992)) и Filiurin (Stomatologiia (Russian) 72: 44-47 (1993)). Эти способы включают в себя использование красителя с последующим обследованием под ультрафиолетовым светом для обнаружения раковой/предраковой ткани, которая является избирательно флуоресцентной.

Другой известный способ включает в себя применение красителя in vivo посредством ополаскивания толуидиновым синим O с последующим обычным визуальным осмотром для обнаружения избирательно окрашенной ткани. Такие способы описаны, например, в U. S. Patent Tucci et al. N 5372801 и в U. S. Patent 4321251 Mashberg. Толуидиновый синий использовали в течение десятилетий в качестве гистопатологического красителя in vitro. В результате такого применения он стал известен как метахроматический краситель, окрашивающий богатые ДНК и РНК ядра в цвет от пурпурного до розового. Присущий толуидиновому синему глубокий синий цвет изменяется на пурпурный или розовый при связывании красителя с нуклеиновой кислотой или другой кислой клеточной макромолекулой. Конечно, этот тип окрашивания зависит от возможности доступа красителя к внутренним субклеточным структурам, таким как ядро. Такой доступ легко достигается только "фиксацией" пробы ткани формальдегидом или другим реагентом, который разрушает клеточную мембрану без разрушения основных клеточных структур.

В противоположность механизму, участвующему в использовании in vitro, окрашивание ткани полости рта in vivo толуидиновым синим O обусловлено его способностью проникать через увеличенные и более доступные интерстициальные пространства дисплазированной ткани, которая удерживает краситель дольше, чем зоны, содержащие нормальную ткань с ее плотными межклеточными местами соединения. Эмпирически наблюдали, что толуидиновый синий просто не проникает в нормальные межклеточные пространства эффективно и становится временно локализованным, он диффундирует со временем и не останется связанным с клетками, как это было бы, если бы он действительно "окрашивал" кислые субструктуры.

Способ Машберга предусматривает использование раствора толуидинового синего O в качестве раствора для промывания всей полости рта с полосканием, с последующими промываниями водой и уксусной кислотой для удаления красителя, который не удерживается раковой или предраковой тканью. Предварительный диагноз Машберга затем подтверждают прямым нанесением композиции толуидинового синего O на подозреваемое в наличии патологии место спустя 10-14 дней.

В Патенте 5372801 Tucchi описана усовершенствованная композиция толуидинового синего O для применения в основной процедуре Машберга.

Способ in vivo с использованием раствора Люголя (иод) и толуидинового синего O был предложен для обнаружения рака пищевода, одновременного со злокачественными опухолями аэропищеварительного тракта, в Papazian (Gastroenterologie Clinique et Biologique (9: 16-22, 1985). Из-за возможных токсичных свойств флуоресцеина, иода и метиленового синего считается, что они не пригодны для неразборчивого применения путем промывания и/или полоскания полости рта. Толуидиновый синий O не является токсичным, но был дорогим для синтеза и очистки в коммерческих количествах.

Поэтому было бы предпочтительно применение красителей, иных, чем флуоресцеин, производные флуоресцеина, иод, метиленовый синий или толуидиновый синий O, в диагностических процедурах для обнаружения in vivo предраковых оральных повреждений и оральных карцином.

В настоящее время обнаружены нетоксичные красители, иные, чем метиленовый синий или толуидиновый синий O, выбранные из соединений, имеющих структуру



и их ионные производные, где R¹ является H, низшей алкильной группой или N(R³)₂, R² является N, S или O и R³ является H или низшей алкильной группой, эффективные для обнаружения in vivo предраковых оральных повреждений или оральных карцином. Низшие алкильные группы могут быть C₁-C₄-группами с прямой или разветвленной цепью, предпочтительно метильными или этильными группами. Как правило, эти красители применяют в соответствии с тем же самым основным способом, описанным в Патенте 4321251 Mashberg, т. е. посредством последовательного промывания полости рта красящей композицией, которая избирательно удерживается раковыми и предраковыми тканями, и затем промывания полости рта для удаления неудержанной композиции красителя.

Определение, удерживается ли избирательно конкретный краситель, имеющий вышеописанную структуру, может быть легко выполнено специалистом в данной области без чрезмерного экспериментирования путем использования этого красителя согласно основной процедуре Машберта, описанной выше. Потенциальная токсичность конкретного красителя может быть легко определена известными в данной области способами и стандартами, например, в исследованиях с кормлением животных.

Пригодные композиции для использования описанных выше красителей получают смешиванием красителя с фармацевтически приемлемым окислителем, который окисляет любую лейкоформу красителя до хромоформы. Выбирают окислители, которые являются фармацевтически приемлемыми, т. е. являются нетоксичными и не вызывают нежелательных побочных реакций, разрушающих краситель. Специалисты в данной области смогут идентифицировать пригодные окислители для использования в соответствии с изобретением общепринятыми тестами известных нетоксичных мягких оксидантов. Например, в соответствии с предпочтительным в настоящее время осуществлением изобретения предпочтительно использовать пероксид водорода, либо непосредственно, либо посредством реакции известных предшественников пероксида водорода с водой в композициях, например, водорастворимых "пер"-соединений, таких как пероксид мочевины, перборат тетрагидрат натрия, перкарбонат натрия, пероксид кальция и т. п.

Композиции изобретения предпочтительно готовят с получением конечного раствора, который, по существу, является изотоническим и имеет pH в диапазоне приблизительно 2,5-7,0, предпочтительно 4,0-5,0. Это достигается добавлением подходящей водорастворимой буферной системы. Предпочтительной в данное время буферной системой является уксусная кислота-ацетат натрия. Другие пригодные буферные системы включают систему лимонная кислота - цитрат натрия или смешанные системы кислота - соль, такие как лимонная кислота - фосфат натрия и т. п.

Растворитель, применяемый для обеспечения жидких композиций красителя, представляет собой водный растворитель. Согласно предпочтительному осуществлению изобретения растворитель содержит фармацевтически приемлемый, т. е. нетоксичный, нереакционноспособный спирт, например этанол. Такие растворители не оказывают заметного влияния на механизм окрашивания ткани и сами не участвуют в восстановлении хромоформ красителя до лейкоформ.

Улучшающие вкус и запах агенты, стабильные к окислителю, могут быть добавлены для улучшения приятного вкуса раствора красителя при его использовании в качестве раствора для полоскания.

Количество красителя в жидких композициях предпочтительно таково, чтобы он имел концентрацию приблизительно 1 мас. % в конечной композиции, хотя можно использовать более высокие концентрации, а более низкие концентрации являются по меньшей мере частично эффективными, например, такие как ~ 0,5 - ~ 3,5 мас. %.

Неожиданно оказалось, что красители, имеющие вышеописанную структуру, близкородственные толуидиновому синему O, например метиленовый синий и тиониновый, являются неэффективными, тогда как другие красители, близкие толуидиновому синему O, например, Бриллиантовый крезиловый синий, Азур (кобальтова синь) A, Азур B и Азур C, являются эффективными.

В настоящее время Азур B и Азур C используют в соответствии с предпочтительным в настоящее время осуществлением данного изобретения.

Изобретение рассматривает также композиции для использования в соответствии со способами данного изобретения и способы получения такой композиции, в которых та или иная лейкоформа красителя, присутствующая в композиции, окисляется до хромоформы путем включения в композицию фармацевтически приемлемого окислителя аналогично способу, описанному Tucchi et al. в USA Patent 5372801.

Следующие примеры представлены для иллюстрации применения данного изобретения для специалистов в данной области, а не для ограничения объема изобретения.

Пример 1. Испытуемые композиции Азура B, Азура C, Бриллиантового крезилового синего ("BCB") и тионинового красителей и контрольную композицию толуидинового синего O ("TBO") готовят смешиванием каждого из этих красителей с указанными ингредиентами в следующих пропорциях, мас. %:

Очищенная вода, U. S. P. ^* - 83,86

Ледяная уксусная кислота, U. S. P. - 4,61

Ацетат тригидрат натрия, U. S. P. - 2,45

Этиловый спирт SD18 - 7,48

Пероксид водорода 30%, U. S. P. - 0,41

IFF Raspberry (малина) IC563457 - 0,20

Краситель - 1,00

^*Реагент фармацевтической чистоты согласно Фармакопее США

Пример 2. Раствор для полоскания готовят смешиванием следующих ингредиентов в указанных пропорциях, мас. %:

Очищенная вода, U. S. P. - 98,70

Ледяная уксусная кислота, U. S. P. - 1,0

Бензоат натрия, U. S. P. - 0,10

IFF Raspberry IC563457 - 0,2

Пример 3. Клиническую эффективность каждой из испытуемых смесей в сравнении с контрольной смесью TBO определяют с применением протокола Машберга.

Сначала больных подвергают скринингу на патологию полости рта с использованием контрольной смеси TBO. После обнаружения потенциальной раковой или предраковой патологии все следы TBO удаляют повторяющимися промываниями водой и раствором уксусной кислоты для полоскания. Затем больных, проявляющих патологию полости рта, используют в качестве тест-субъектов для каждой из испытываемых смесей. 2-3 мл каждой испытуемой смеси наносят намазыванием на патологические поверхности слизистой оболочки с последующим промыванием промывной смесью и водой для удаления избытка композиции красителя. После осмотра с каждым красителем и перед тестированием со следующим красителем все следы красителя удаляют из повреждения повторяющимся промыванием смесью для полоскания и водой.

Испытуемая смесь Азура (кобальтовой сини) B дает интенсивность окрашивания, локализацию повреждений и изображение границ повреждений, равноценные результатам с TBO. Соседние неокрашенные ткани обнаруживают слабое накопление красителя, но не до степени, мешающей различению повреждений.

Испытуемая смесь Азура C дает интенсивность окрашивания, локализацию повреждений и изображение границ повреждений, равноценные результатам с TBO. Соседние, не вовлеченные в патологию ткани окрашиваются до красного/пурпурного цвета, но не до степени, мешающей различению повреждений.

Испытуемая смесь Бриллиантового крезилового синего дает результаты, сходные с результатами Азура B и Азура C.

Испытуемая смесь с тиониновым красителем дает сильное красное фоновое окрашивание как на окрашенных, так и на неокрашенных тканях, так что различение границ повреждений является недостаточным.

Пример 4. Процедуры примера 3 повторяют, за исключением того, что испытуемые композиции и контрольную композицию наносят на слизистую оболочку полости рта ополаскиванием с полосканием вместо прямого нанесения на очаг подозреваемых участков. Получают эквивалентные результаты.

Изобретение описывается таким образом, чтобы специалисты в данной области могли приготовить заявленные смеси и использовать изобретение, и даются предпочтительные в настоящее время воплощения изобретения.