антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения и способ его получения

Формула изобретения

1. Антитимоцитарный глобулин для внутривенного введения, представляющий собой фракцию иммуноглобулинов с содержанием IgG и IgM не менее 90%, глицин и забуференный физиологический раствор хлористого натрия рН 7,3-7,5, при следующем соотношении компонентов в 1 мл препарата:

Фракция иммуноглобулинов с содержанием IgG и IgM не менее 90% с активностью в лимфоцитотоксическом тесте - 1024-2048

Глицин - 15-25 мг

Забуференный физиологический раствор хлористого натрия рН 7,3-7,5 - До 1 мл

2. Антитимоцитарный глобулин по п. 1, отличающийся тем, что он представляет собой лиофилизированную форму.

3. Способ получения антитимоцитарното глобулина для внутривенного введения путем иммунизации животных клетками вилочковой железы человека и последующего фракционирования и очистки белков крови риванолом, отличающийся тем, что плазму иммунизированных животных истощают человеческой плазмой АВ (IV) группы крови, из смеси после фракционирования риванолом оставшийся риванол удаляют сорбцией активированным углем, а полученную надосадочную жидкость последовательно истощают путем обработки ее эритроцитами и тромбоцитами четырех групп крови человека, целевой продукт осаждают из надосадочной жидкости полиэтиленгликолем-6000, растворяют его в физиологическом растворе хлористого натрия, добавляют к нему глицин и проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что истощение плазмы иммунизированных животных проводят плазмой АВ (IV) группы крови человека при соотношении 20-25: 1-1,5 объем/объем.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что фракционирование белков плазмы проводят 2%-ным риванолом при соотношении риванол : плазма= 0,2-0,6: 1 объем/объем.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что истощение надосадочной жидкости проводят эритроцитами четырех групп крови человека при соотношении надосадочная жидкость : эритроциты, равном 1: 0,5-1 объем/объем.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что истощение надосадочной жидкости тромбоцитами человека четырех групп крови после истощения эритроцитами проводят из расчета 1,5-2 мл/л исходной плазмы крови иммунизированных животных.

8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что конечная концентрация полиэтиленгликоля-6000 при осаждении целевого продукта составляет 10-12%.

9. Способ по п. 3, отличающийся тем, что после осветляющей и стерилизующей фильтрации дополнительно проводят лиофилизацию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммунобиологических лекарственных препаратов, используемых для внутривенного введения при коррекции иммунодефицитных состояний различного генеза.

Известен способ получения иммуноглобулина из биологических жидкостей путем их адсорбции на активированном угле (1).

Недостатком этого способа является малая емкость углей в отношении иммуноглобулинов и низкая избирательная способность указанного сорбента, что позволяет выделять не более 1% иммуноглобулинов от общего количества адсорбированного белка.

Известен также способ извлечения иммуноглобулинов из биологических жидкостей путем их пропускания через сорбенты, в качестве которых используются макропористый сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий группы несимметричных диметилэтилен-бис-аммониевых оснований (2).

Недостатком указанного способа является его трудоемкость и невысокая степень очистки, что не позволяет использовать препарат для внутривенного введения ввиду его несоответствия современным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.

Известен способ получения иммуноглобулинов путем фракционирования белков крови с использованием этанола (3).

Недостатком указанного способа является необходимость использования высоких концентраций этанола, создающих опасность денатурации белков, что делает необходимым проведение процесса при отрицательных температурах.

Другим недостатком этого способа является необходимость последующего восстановления гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны, что значительно усложняет процесс и повышает стоимость целевого продукта.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ приготовления антилимфоцитарного глобулина, основанный на получении препарата из сыворотки крови животных, иммунизированных клетками вилочковой железы человека, освобождении иммунной сыворотки от гетероагглютининов путем адсорбции эритроцитами человека с последующим фракционированием риванолом для освобождения от балластных белков (4).

Недостатком указанного способа является низкий выход иммунной сыворотки, использующейся для получения целевого продукта.

Другим недостатком является контаминация иммунной сыворотки свободным гемоглобином крови животных в результате гемолиза эритроцитов в процессе заготовки сыворотки, что ухудшает физико-химические свойства целевого продукта (изменяют его прозрачность и цветность) и требует проведения дополнительного контроля и очистки.

Следующим недостатком указанного способа является необходимость использования 1,5-2-кратного объема донорских эритроцитов человека по отношению к объему обрабатываемой иммунной сыворотки для освобождения последней от гетероагглютининов, что увеличивает продолжительность технологического процесса и значительно повышает стоимость целевого продукта.

Еще одним недостатком указанного способа является низкая степень очистки целевого продукта, содержащего не более 70% иммуноглобулинов, что не соответствует современным международным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения людям.

Задачей данного изобретения является получение высокоочищенного ареактогенного препарата иммуноглобулина для внутривенного введения.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что животных, например коз, кроликов, лошадей, иммунизируют клетками вилочковой железы человека, выделяют плазму иммунизированных животных, истощают ее плазмой донорской AB (IV) группы крови человека, добавляя последнюю в соотношении 20-25: 1-1,5 (об. /об. ) соответственно. Затем смесь разбавляют дистиллированной водой до концентрации по белку 10-15 м/мл, фракционируют риванолом при добавлении его к полученной смеси в соотношении 0,2-0,6: 1 (об. /об. ) соответственно, с последующим удалением избытка риванола центрифугированием и последующей адсорбцией активированным углем. Потом фракционированную смесь, так называемый полупродукт, последовательно истощают эритроцитами человека, вносимыми в соотношении 1: 0,5-1, и тромбоцитами, добавляемыми из расчета 1,5-2 мл/л исходной иммунной плазмы. После центрифугирования из надосадочной жидкости осаждают целевой продукт с помощью полиэтиленгиколя (ПЭГ)-6000, вносимого в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 10-12%, с последующим центрифугированием. Полученный осадок белка, состоящий в основном из иммуноглобулинов, растворяют физиологическим раствором хлористого натрия, добавляют в качестве стабилизатора глицин в концентрации 15-25 г/л растворенного белка, а затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, после чего осуществляют розлив и лиофильное высушивание препарата. Активность целевого продукта в лимфоцитотоксическом тесте (ЛЦТТ) равна - 1024-2048.

Техническим результатом использования изобретения является получение высокоочищенного антитимоцитарного глобулина (АТГ), который полностью соответствует требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения, и может быть использован для предупреждения и купирования кризов отторжения трансплантатов органов, в частности почек, печени, а также для лечения апластической анемии, борьбы с гнойно-септическими состояниями и т. д.

Способ осуществляется следующим образом. Многократно иммунизируют животных, например коз, кроликов, лошадей, взвесью клетками вилочковой железы человека, взятой от плода, погибшего в результате асфиксии или родовой травмы (при первой иммунизации используют полный адъювант Фрейнда). Спустя 2 недели после последней иммунизации проводят эксфузию крови животных-продуцентов, используя гемоконсерванты для предотвращения гемолиза эритроцитов, и последующее отделение иммунной плазмы. К полученной плазме добавляют плазму донорской крови человека AB (IV) группы в соотношении 20-25: 1-1,5 соответственно. Затем смесь разбавляют дистиллированной водой до концентрации белка 10-15 мг/мл, фракционируют 2%-ным раствором риванола, добавляемым в соотношении 0,2-0,6 (об. /об. ), центрифугируют, избыток риванола сорбируют активированным углем. Надосадочную жидкость (полупродукт) собирают, истощают последовательно эритроцитами и тромбоцитами смеси четырех групп крови человека и центрифугируют. Из полученной надосадочной жидкости целевой продукт осаждают с помощью ПЭГ-6000, вносимого в конечной концентрации 10-12% (вес/объем). После центрифугирования осадок белков, представляющий собой в основном иммуноглобулины, растворяют физиологическим раствором хлористого натрия и добавляют в качестве стабилизатора глицин (15-25 г/л растворенного белка), затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив и последующую лиофилизацию. Целевой продукт перед использованием растворяют в физиологическом растворе.

Пример 1. Здоровых коз обоего пола в возрасте 1-3 года весом 18-30 кг 6-кратно иммунизируют взвесью клеток, полученных из вилочковых желез трупов новорожденных детей, погибших в результате асфиксии или родовой травмы. При первой иммунизации животных антиген вводят одновременно с полным адьювантом Фрейнда. Смесь, состоящую из 2 мл взвеси клеток вилочковой железы человека в концентрации 310⁸ и 2 мл адьюванта, вводят козам внутримышечно по 1 мл в четыре точки. Через две недели проводят 5 последующих иммунизаций с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови с гемоконсервантом, что исключает гемолиз эритроцитов. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием. Затем эту плазму обрабатывают плазмой крови человека AB (IV) группы, добавляя последнюю в соотношении 25: 1,5. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике.

На следующий день к смеси добавляют 2%-ный раствор риванола в соотношении 1: 0,4 (об. /об. ) соответственно при непрерывном перемешивании в условиях комнатной температуры. Затем смесь центрифугируют 15 мин при температуре 10^oC. Надосадочную жидкость сливают в стерильную емкость. Избыток риванола сорбируют активированным углем.

Для освобождения фракционированной смеси (полупродукта) от антител к нелимфоидным антигенам вносят последовательно донорскую эритроцитарную массу и концентраты тромбоцитов смеси четырех групп крови человека. Суспензию отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,75: 1 (об. /об. ). Спустя 10 мин смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10^oC, а затем добавляют тромбоциты человека из расчета 1,75 мл/л исходной плазмы, оставляют на 30-минутный контакт при комнатной температуре, после чего центрифугируют 20 мин при 3900 об/мин при температуре 10^oC. Надосадок собирают в стерильную посуду и проводят выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 11% при непрерывном перемешивании в течение 30 мин. Потом смесь центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, надосадок удаляют, а к осадку белка добавляют физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. Содержание общего белка в полупродукте, определяемое, например, биуретовым методом, составляет 10-15 мг/мл. На следующем этапе добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 20 г/л растворенного белка, доводят pH до 7,3-7,5, а затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через мембранные фильтры типа "Миллипор" с соответствующими размерами пор, розлив препарата в ампулы и его лиофилизацию.

В одной ампуле целевого продукта объемом 3-5 мл содержится 40-60 мг белка, который при контроле методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках на 90% и более состоит из иммуноглобулинов (преимущественно IgG и IgM). Такая степень очистки соответствует национальным и международным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения. Препарат не содержит консервантов и антибиотиков, его активность в ЛЦТТ равна не менее 1024 - 2048.

Пример 2. Кроликов весом 2,5-3 кг иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 1,510⁸, как описано в примере 1. Через две недели после первой иммунизации проводят 5 последующих иммунизаций с интервалом в 3-5 дней. Каждому животному внутримышечно вводят по 2 мл антигена. Через две недели после последней иммунизации производят заготовку крови с гемоконсервантом. Иммунную плазму отделяют от клеток крови центрифугированием в условиях стерильного бокса. Затем полученную плазму обрабатывают плазмой крови человека в соотношении 20: 1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике.

На следующий день доводят pH смеси до 8,2 и добавляют 2%-ный раствор риванола при непрерывном помешивании в течение 30 мин при комнатной температуре в соотношении 0,2: 1 (об. /об. ), соответственно. Затем смесь центрифугируют в течение 15 мин при температуре 10^oC. Надосадочную жидкость (полупродукт) сливают в стерильную емкость. Избыток риванола сорбируют активированным углем.

Для освобождения полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят донорскую эритроцитарную массу и концентраты тромбоцитов четырех групп крови человека. Смесь отмытых эритроцитов добавляют к полупродукту в соотношении 0,5: 1 (об. /об. ). После перемешивания в течение 10 мин смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10^oC. Надосадок сливают в стерильную емкость и добавляют тромбоциты человека из расчета 1,5 мл на 1 л исходной иммунной плазмы. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего центрифугируют. Надосадок собирают в стерильную посуду и выделяют целевой продукт с помощью ПЭГ-6000, который вносят в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 10%, проводят непрерывное перемешивание в течение 30 мин и потом центрифугируют. Надосадок удаляют, а к осадку белка при непрерывном перемешивании добавляют физиологический раствор хлористого натрия до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному осадку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 15 г/л растворенного осадка и доводят pH до 7,3-7,5, а затем проводят операции, как описано в примере 1. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет не менее 1024.

Пример 3. Лошадей в возрасте 1-2 лет иммунизируют 6-кратно взвесью клеток вилочковой железы человека в концентрации 110¹⁰, как описано в примере 1. Иммунную плазму заготавливают, как описано в примерах 1, 2, и истощают плазмой крови человека в соотношении 20: 1. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на ночь в холодильнике.

На следующий день доводят pH смеси до 8,2 и при непрерывном помешивании в течение 30 мин при комнатной температуре вносят в нее 2%-ный раствор риванола в соотношении 1: 0,6 (об. /об. ) соответственно. Затем смесь центрифугируют в течение 15 мин при температуре 10^oC. Надосадочную жидкость сливают в стерильную емкость. Избыток риванола сорбируют активированным углем.

Для освобождения полученного полупродукта от антител к нелимфоидным антигенам вносят последовательно донорскую эритроцитарную массу и концентраты тромбоцитов смеси четырех групп крови человека. Отмытые эритроциты добавляют к полупродукту в соотношении 1: 1 (об. /об. ). После перемешивания в течение 10 мин смесь полупродукта с клеточной суспензией центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин при 10^oC. Надосадок сливают в стерильную емкость и добавляют тромбоциты человека из расчета 2 мл на 1 л исходной плазмы. Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин, после чего проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3900 об/мин при 10^oC. Надосадок собирают в стерильную посуду и затем проводят выделение целевого продукта с помощью ПЭГ-6000, который вносят в объемно-весовом соотношении до конечной концентрации 12%. После непрерывного перемешивания в течение 30 мин проводят центрифугирование в течение 10 мин при 3000 об/мин. Надосадок удаляют, а к осадку белка добавляют физиологический раствор до полного растворения осадка. На следующем этапе к растворенному белку добавляют в качестве стабилизатора глицин из расчета 25 г/л и доводят pH до 7,3-7,5. Все последующие операции проводят, как описано в примере 1. Активность целевого продукта в ЛЦТТ составляет 1024-2048.

Высокая эффективность препарата АТГ, полученного предлагаемым методом, и его ареактогенность, иллюстрируется примерами 4-6.

Пример 4. Полученный предлагаемым способом АТГ был использован для лечения больного Б. 86 лет (история б-ни N 6537) с общим серозным перитонитом после резекции по поводу ушивания паховой грыжи. Лечение проводилось в Главном военном госпитале им. Н. Н. Бурденко. Больной поступил в отделение в тяжелом состоянии, через сутки произведена операция по поводу основного заболевания. Послеоперационное состояние тяжелое с явлениями перитонита и присоединившейся бронхопневмонии. Больному проводилось интенсивное лечение антибиотиками, коллоидными и кристаллоидными кровезаменителями, сердечно-сосудистыми средствами, но состояние оставалось крайне тяжелым. Добавлено лечение АТГ, который вводили двукратно внутривенно из расчета 0,7 мг/кг массы тела. Обе трансфузии препарата протекали без осложнений и побочных реакций. На 4-й день после введения указанного препарата состояние больного заметно улучшилось. Объективно отмечалось стихание явлений перитонита, нормализовалась иммунограмма. В удовлетворительном состоянии больной был выписан домой.

Пример 5. Больной Ш. 42 лет находился на лечении в Главном военном госпитале им. Н. Н. Бурденко в августе 1998 г. Диагноз - хронический гломерулонефрит, хроническая почечная недостаточность III степени. 11.08.1998 г. произведена аллотрансплантация донорской почки. Послеоперационный период был осложнен некрозом терминального отдела мочеточника. На фоне повторных оперативных вмешательств у больного начался криз отторжения, который не удавалось купировать, несмотря на комплексное лечение с применением циклоспорина A и иммурана. В программу лечения был добавлен АТГ, приготовленный предлагаемым способом, в дозе 7 мг/кг/сутки. Всего проведено 6 внутривенных введений. Уже после второго введения препарата снизился индекс резистентности сосудов трансплантата, что свидетельствовало о начавшемся купировании криза отторжения. После курса лечения АТГ отмечено улучшение показателей крови. В удовлетворительном состоянии больной был выписан домой в ноябре 1998 г. До настоящего времени он находится под наблюдением врачей госпиталя. Трансплантированная почка функционирует удовлетворительно.

Пример 6. Больной Г. , 23 лет в январе-феврале 1996 г. находился на лечении в гематологическом отделении клиники Российского НИИ геронтологии с диагнозом апластическая анемия.

Больному проведен курс лечения АТГ. Препарат вводили внутривенно капельно в физрастворе. Разовая доза составляла 15 мг/кг веса тела. Курс лечения длился 5 дней. На 6-й день с начала введения АТГ у больного появились кожные высыпания типа крапивницы (реакция на введение чужеродного белка), которые купировались преднизолоном и антигистаминными препаратами. Через 3 месяца у больного улучшились показатели крови, он был выписан домой в состоянии клинико-гематологической ремиссии. До настоящего времени сохраняется стойкая ремиссия.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лопухин Ю. М. , Молоденков М. Н. Гемосорбция. - М. - Медицина. - 1978. С. 31-34; 139-141.

2. Авторское свидетельство СССР N 1121619 от 30.10.84.

3. Заявка N 96124332/14 от 26.12.96.

4. Авторское свидетельство СССР N 523696 от 05.08.76.