устройство для проведения электрофореза

Формула изобретения

Устройство для проведения электрофореза, содержащее ряд камер, каждая из которых включает кювету с перегородкой, разделяющей ее на две полости для буфера, на которой размещен держатель с ацетатцеллюлозной мембраной, и крышку с электродами, отличающееся тем, что держатель состоит из двух скрепленных замками частей П-образной формы, который установлен на перегородку кюветы и имеет по всей длине держателя не менее двух параллельных буртиков, при этом на нижнюю часть натянута одна или несколько мембран, которые зажимаются между буртиками нижней и верхней частей при помощи замков и удерживаются в натянутом прижатом состоянии на протяжении всего процесса электрофореза, при этом верхняя часть держателя имеет ряд окон и содержит один или несколько рядов направляющих прорезей для фиксированного прохождения аппликатора, а электроды выполнены из титана и имеют Г-образную форму, причем положительный электрод покрыт платиной.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано во всех медицинских учреждениях.

Известны устройства для проведения электрофореза в гелевых и на мембранных носителях (в дальнейшем мембранах) по патентам, авторским свидетельствам, свидетельствам на промышленные образцы и ГОСТам, выданным на имя Соболева В.И., патент N 1780513 от 20.11.90 г. "Устройство для проведения электрофореза в геле", А.С. N 967470 от 26.04.77 г., А.С. N 997672 от 23.10.79 г. , А. С. N 1517938 от 10.06.87 г., свидетельства на промобразцы N 11918, N 11919, N 11920 от 30.04.80 г., ГОСТ 27153-86 "Приборы и аппараты медицинские для обработки пробы методами электрофореза."

Все они содержат ряд камер, каждая из которых включает кювету с перегородкой, разделяющей ее на две полости для буфера, на которой размещен держатель с мембраной или гелем, и крышку с электродами. Мембраны и гель служат для нанесения на них проб, а также для электрического соединения анодно-катодного пространства черед буфер.

Однако с помощью данных устройств нельзя проводить ряд диагностических биохимических методик, указанных ниже.

Для осуществления новых методик необходимы новые конструктивные решения с применением мембран и держателей других конструкций, которые бы позволяли просто, быстро и надежно крепить мембраны, наносить пробы, подключать камеру к источнику питания и получать четкие фракции.

Прототипом заявляемого устройства является устройство (патент N 1780513 от 20 ноября 1990 г. ), содержащее ряд камер, каждая из которых включает кювету с перегородкой, разделяющей ее на две полости для буфера, на которой размещен держатель геля с рабочей поверхностью, с двух сторон от которой выполнены параллельные вертикальные прорези, а также крышку с электродами. На держателе с двух сторон от рабочей поверхности выполнены планки, верхняя поверхность которых параллельна рабочей поверхности держателя. На планки накладывается по крайней мере одна ацетатцеллюлозная мембрана, концы которой введены в снабженные прижимами вертикальные прорези держателя со стороны ее нерабочей поверхности. Устройство снабжено шаблоном с двумя параллельными буртиками, которые соприкасаются с мембраной и верхними поверхностями планок. Шаблон имеет ряд окон, две стороны каждого из которых выполнены с выемками для нанесения проб.

Данное устройство удобно для крепления одиночных полос мембран шириной 28 мм при необходимости исследования небольшого количества проб, но неудобно при креплении мембран стандартных размеров 90х90 мм и 180х90 мм. Поэтому недостатком данного устройства является то, что время, затрачиваемое на крепление шести полос мембран шириной 28 мм, составляет 15 мин. Время, затрачиваемое на крепление мембраны 90х90 мм и 180х90 мм в заявляемом устройстве, составляет 0,5 мин.

Целью изобретения является возможность проведения следующих методик:

- электрофоретическое фракционирование белков и липопротеидов сыворотки крови;

- электрофоретическое разделение изоферментов лактатдегидрогеназы и щелочной фосфотазы;

- определение однородности препаратов -глобулинов сыворотки крови;

- определение однородности осажденной -липопротеидной фракции.

Все эти методики отработаны на заявляемом устройстве на кафедре биохимии С-Петербургской санитарно-гигиенической Академии.

Предлагаемое устройство и методики необходимы для диагностики липидного обмена, возникающего при ишемической болезни сердца и атеросклерозе, онкологических заболеваниях, острых и хронических воспалительных процессах на ранних стадиях.

Предлагаемое устройство необходимо при определении чистоты при изготовлении и использовании -глобулиновых препаратов, например, на станциях переливания крови.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом устройстве держатель состоит из двух скрепленных замками частей П-образной формы. Нижняя часть установлена на перегородку кюветы и имеет по всей длине держателя не менее двух параллельных буртиков, при этом на нижнюю часть натянута одна или несколько мембран, которые крепятся буртиками верхней части держателя и замками, которые удерживают буртики в прижатом состоянии и мембраны в натянутом состоянии на протяжении всего процесса электрофореза. При этом верхняя часть держателя имеет ряд окон и содержит один или несколько рядов направляющих прорезей для фиксированного прохождения аппликатора. Электроды выполнены из титана и имеют Г-образную форму, причем положительный электрод покрыт платиной.

Предлагаемое устройство для проведения электрофореза (в дальнейшем "устройство") содержит одну или несколько электрофоретических камер и блок питания (не показан).

На фиг. 1 изображена камера для проведения электрофореза; на фиг. 2 и 3 - нижняя часть держателя; на фиг. 4 и 5 - верхняя часть держателя; на фиг. 6 - электрод; на фиг. 7 - замок в разрезе.

Камера (фиг. 1) содержит кювету 1 с перегородкой 2, разделяющей ее на две полости для буфера 3, на которой размещен держатель 4 с ацетатцеллюлозной мембраной 6. Держатель состоит из двух скрепленных замками 13 частей П-образной формы. Нижняя часть установлена на перегородку 2 кюветы 1 и имеет по всей длине держателя не менее двух параллельных буртиков 5. На нижнюю часть натянута одна или несколько мембран 6, которые крепятся буртиками 8 верхней части держателя 7. Таким образом буртики верхней и нижней частей зажимают между собой мембрану, а замки 13 удерживают их в таком состоянии до конца процесса электрофореза. Верхняя часть держателя имеет ряд окон 9 и содержит один или несколько рядов направляющих прорезей 10 для фиксированного прохождения аппликатора. Электроды 12 (фиг. 1 и 6) имеют Г-образную форму. Положительный электрод покрыт платиной.

П-образная форма нижней и верхней частей держателя придают П-образную форму мембране 6, в результате чего мембрана обеспечивает электрический контакт между двумя буферно-электродными пространствами 3 кюветы 1.

На нижнюю часть держателя 4 натягивается предварительно намоченная в буфере мембрана 6.

Сверху устанавливается верхняя часть держателя 7, и при нажатии замки защелкиваются. При этом буртики 5 нижней части и буртики 8 верхней части накладываются друг на друга и замки 13 удерживают мембрану 6 в натянутом состоянии до завершения процесса электрофореза.

Окна 9 верхней части держателя необходимы для визуального наблюдения момента соприкосновения аппликатора с мембраной при нанесении пробы, чтобы исключить повреждение мембраны и обеспечить нанесение пробы в одно и то же место. Направляющие прорези 10 служат для фиксированного нанесения проб на мембрану, так как проба может наноситься в одно и то же место от одного до трех раз.

Целью исследований была разработка серийно пригодных электродов для электрофореза, снижение их стоимости, повышение механической прочности с сохранением устойчивости к агрессивным средам.

При выборе материалов электродов для электрофореза исходили из того, что электрод должен обладать малым поляризационным сопротивлением, быть серийно пригодным, механически прочным, при этом должен быть устойчив к агрессивной кислотно-щелочной среде при воздействии ионизации и электролиза.

Известно, что минимальным поляризационным сопротивлением обладают платина, палладий и титан. Электроды с малым поляризационным сопротивлением позволяют уменьшить нагрев электродов и буфера, благодаря чему можно снизить разрушительное воздействие электролиза и ионизации и создать более благоприятные условия для электрофореза. Электроды с малым поляризационным сопротивлением позволяют уменьшить энергопотребление и повысить КПД прибора в целом.

Повышение серийнопригодности, в том числе экономичности электродов из титана, по сравнению с электродами из платины и палладия объясняется тем, что титан в 400 раз дешевле платины и в 100 раз дешевле палладия.

Электроды из титана обладают значительно большей механической прочностью, кроме того, диаметр электродов и их длина могут быть увеличены до необходимых конструктивных размеров. Расчеты показывают, что диаметр электродов должен быть в пределах от 4 до 10 мм, что подтвердилось в работающих камерах. Кроме того, титан позволяет разработать электроды любых конструктивных форм: из прутка круглые, пластинчатые, фигурные и т.д.

В устройстве применены электроды из прутка Г-образной формы. Желательно при электрофорезе применять электроды большего диаметра, так как это уменьшает плотность электрического тока при контакте электродов с буфером, вследствие того, что при незначительном увеличении диаметра электрода значительно увеличивается рабочая площадь электрода. С уменьшением плотности электрического тока уменьшается нагрев электродов и буфера. Это особенно важно при больших токах. Так, при использовании в качестве носителя геля электрический ток может достигать 200 мА. Применение в качестве носителя мембран позволяет уменьшить электрический ток на порядок. Так, при использовании стандартной ацетатцеллюлозной мембраны "ВЛАДИПОР" размером 180х90 мм ток составляет 15-20 мА. При ширине мембраны 90 мм - ток 7,2 мА, при полосе шириной 28 мм величина тока составляет 1,3 - 1,5 мА.

До сих пор в электрофоретических камерах в качестве электродов применяется платиновая проволока диаметром 0,1- 0,3 мм. Она подсоединяется к токоведущему штырю при помощи винта. Место соединения за счет электролиза быстро окисляется, разрушается и выходит из строя.

Предлагаемая Г-образная форма электрода позволяет исключить какие-либо механические соединения электрода с токоведущими деталями, что значительно (в десятки раз) повышает долговечность электродов и камеры в целом и обеспечивает электрофорез со стабильными параметрами.

Платинирование электродов позволяет исключить их коррозию и эррозию. Опыты показывают, что при использовании в качестве электродов чистого титана быстрей разрушается положительный электрод, причем, чем больше электрический ток, проходящий через электроды, тем больше разрушение. Поэтому можно платинировать только положительный электрод, что в два раза экономит платинохлористоводородную кислоту при нанесении платинового покрытия.

Устройство работает следующим образом.

1. В устройстве используется ацетатцеллюлозная мембрана "ВЛАДИПОР" МФА-МА N 4 или N 5, которая имеет стандартные размеры 90х90 мм и 180х90 мм ТУ 6- 05-1903-87. Держатель позволяет закреплять мембрану любой ширины от 180 мм и меньше почти мгновенно.

2. Используется буфер следующего состава:

- барбитал натрия - 12,75 г

- барбитал - 2,3 г заливают дистиллированной водой до 1000 мл и ставят в водяную баню.

3. Готовят 7%-ный раствор уксусной кислоты, для чего 7 мл ледяной уксусной кислоты разводят дистиллированной водой до 100 мл.

4. Для окрашивания белков готовят 0,25%-ный раствор амидочерного, для чего 250 мг амидочерного красителя растворяют в 100 мл 7%-ной уксусной кислоты.

5. Для окрашивания липопротеидов используют судан черный, судан 3 или судан 4 (красный цвет). Небольшое количество красителя (на кончике скальпеля) помещается в 5 мл изопропилового спирта. После полного растворения красителя добавляется 10 мл 5% NaOH.

6. Для просветления ацетатцеллюлозных мембран применяют раствор, состоящий из метанола - 87 мл, ледяной уксусной кислоты 12 мл и глицерина - 1 мл. Данный раствор пригоден только для фракционирования белков.

Порядок работы

1. В каждую часть 3 кюветы 1 заливают буфер от 45 до 50 мл.

2. Увлажняют мембрану, поместив ее на 1-3 мин в буфер.

3. Мембрану вынимают из буфера и кладут между двумя листами фильтровальной бумаги.

4. Мембрану помещают в держатель, который устанавливают на перегородку 2 кюветы 1.

5. Через прорези 10 аппликатором на мембрану наносится пробы.

6. Кювета с держателем, мембраной и буфером закрывается крышкой и сразу подключается к источнику питания.

7. На камеру подается постоянное стабилизированное напряжение, величина которого определяется в зависимости от проводимой методики:

- при фракционировании белков и липопротеидов сыворотки крови ... 100-150В, при времени 20-30 мин.

- при фракционировании лактатдегидрогеназы и щелочной фосфотазы ... 270В при времени 50 мин.

- при определении однородности препаратов -глобулинов сыворотки крови . .. 100-200В при времени 30-40 мин.

9. После окончания электрофореза мембрану помещают в фиксирующий раствор на 10 мин, затем - в окрашивающий раствор. Буфер из обеих частей кюветы сливают в одну емкость для повторного использования.

10. Для обсчета полученных фракций мембрану помещают в глицерин или обрабатывают следующим образом. Мембрану промывают в воде в течение 10-15 мин. Остатки влаги удаляют фильтровальной бумагой. Помещают в этиловый спирт на 2-3 мин для окончательного вытеснения воды. Затем мембрану кладут на стекло, выдавив из-под нее воздух, и помещают в осветляющую жидкость на 3-4 мин. Затем мембрану помещают в термостат при 100^oC на 4-5 мин.

Преимущества устройства

1. Основным преимуществом устройства является осуществление вышеописанных диагностических методик.

2. Улучшено качество крепления мембран, уменьшено время, затрачиваемое на их крепление. Мембрана любой ширины закрепляется мгновенно.

3. Повышена долговечность устройства за счет предлагаемой конструкции камеры и электродов, устройство просто и надежно в эксплуатации.

Автоматизация процесса

1. Устройство подключается к источнику питания простым вдвижением камеры в разъем. Напряжение подается одним поворотом ручки таймера, при этом устанавливается время проведения электрофореза. Камера отключается автоматически.

2. Среди имеющихся методов обработки электрофореграмм наиболее предпочтителен метод денситометрирования. Однако в течение последнего времени широко внедряется компьютерный метод обработки.

В настоящее время на базе С.-Петербургского НИИ кардиологии МЗ РФ разработана нами компьютерная система для электрофоретического исследования сыворотки крови.

В систему входит прибор электрофоретический, оптический блок, компьютер типа Пентиум 200-ммх, программное средство автоматизированной обработки электрофореграмм.

Система позволяет автоматически определять процентное соотношение фракций и их массовую концентрацию в г/л, выявлять присутствие аномальных белков, "парапротеинов", не свойственных крови здорового человека, выявлять отсутствие фракций, улавливать изменения структуры какого-либо белка, апроксимировать электрофореграммы в зависимости от вводимых в программу поправок и т.д.

3. Устройство может быть включено в комплектацию приборов, которые серийно выпускаются и успешно используются более десяти лет:

- прибор электрофоретический ПЭФАГ-1 ТУ 64-1-3174-80, рег. удостоверение N 78/626-82,

- приборы иммуноэлектрофоретические ПИЭФ-01, ПИЭФ-01-1, ПИЭФ-01-2, ПИЭФ-01-3 ТУ 64-1-3945-85, рег. удостоверение N 96/386-178.

Данные приборы внесены в Государственный РЕЕСТР медицинских изделий Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации, М., 1996 г., стр. 124.