способ оценки токсичности коклюшных вакцин

Формула изобретения

Способ оценки токсических свойств коклюшных вакцин путем иммунизации экспериментальных животных, отличающийся тем, что мышам внутрибрюшинно вводят коклюшную вакцину, предварительно обработанную низкочастотным ультразвуком (42 - 50 кГц) в течение 5 мин, через 7 суток мышей декапитируют, ультраструктурные срезы головного мозга исследуют в электронном микроскопе и по наличию демиелинизации миелиновых волокон в форме "косичек" судят о токсическом действии коклюшных вакцин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а точнее к микробиологии и вакцинопрофилактике, и может быть использовано для оценки токсичности коклюшных вакцинных препаратов, выпускаемых в серийное производство.

Анализ данных по осложнениям у детей, вызванных вакцинными препаратами, показал, что на первом месте по количеству и тяжести осложнений стоит АКДС-вакцина, в которой основным фактором, обусловливающим ее отрицательную характеристику, является коклюшный компонент (Marshall L. e.a. "Неудача программы вакцинации". , Int. Health. Med. 1992, N 2, 21-23, Hodder Sh., Mortimer E. A. "Эпидемиология коклюша и реакции на коклюшную вакцину" Epidemiol. Rev. 1992, 14: 243-267. Prins. G., Sherlman P. "Коклюш"., Русс.медицин. жур. Т. 1, N 2, Май 1995 г.). Тяжелейшие осложнения, индуцируемые коклюшной корпускулярной вакциной, послужили основанием для отказа от прививок против коклюша в таких странах, как Япония, Англия, Швеция и др. (Steller H. S. e. a. "Польза, риск и судебные органы", G. Pediiater., 1985, Т. 227, N 692, p. 1289), но это повлекло за собой массовые вспышки коклюшной инфекции у не привитых детей с большим процентом тяжелых форм, вплоть до смертельных исходов ("Смерть от коклюша", Brit. Med. G. 1993, T.286, N 327, p.1208 и др. ).

Таким образом, применение коклюшной вакцины может повлечь за собой тяжелые поствакцинальные осложнения самого широкого спектра вплоть до энцефалопатий и энцефаломиелитов, а отказ от нее - возможность заболеванием коклюшем с поражением жизненноважных функций организма вплоть до летальных исходов. Для устранения сложившейся ситуации, наряду с разработкой вакцин с пониженными токсическими свойствами, очевидна актуальность поисков информативных методов оценки критериев безвредности коклюшных вакцинных препаратов, выпускаемых в серийное производство.

Одним из серьезнейших проявлений реактогенности коклюшной инфекции являются осложнения со стороны нервной системы, такие как: энцефаломиелиты, энцефалопатии, энцефаломиелинорадикулиты, миелиты, в основе которых лежит повреждение функциональных структур нервной ткани (нарушение проницаемости гематоэнцефалитического барьера, деструкция миелиновых волокон коры больших полушарий) (А. Х. Канчурин, В.Б.Гервазиева "К вопросу о патогенезе поствакцинальных коклюшных нейроаллергических осложнений", В сб. "Иммунология нервных и психических заболеваний", М., 1974, 276-280; Брагинская В.П. с соав. "Вакцинальные неврологические осложнения у детей", журн. Нервопатол. и психиатр, 1990, N 5, 67-83, Prins G., Sherlman P., "Коклюш"., Русс.мед.жур., т. 1, N 2, май 1995 г. и др.).

Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе выявлен ряд способов определения повреждающего действия коклюшных вакцин на нервную систему макроорганизма.

Так, А.А.Бабахин в статье "Бласттрансформация лимфоцитов периферической крови при экспериментальном аллергическом энцефалите (коклюшном) сб. "Иммунология нервных и психических заболеваний", М., 1974, с.276-280), описывает способ оценки токсического действия коклюшных препаратов на нервную ткань методом бласттрансформации лимфоцитов периферической крови морских свинок, иммунизированных коклюшными вакцинами, где в качестве митогена используется мозговой антиген. В жур. "Пат. физиол. и экспер. терапия" (1972, N 4, с.36-40), А.Х.Канчуриным и В.Б.Гервазиевой ("Гематотоксический эффект иммунных лимфоцитов при коклюшном ЭАЭ") излагается метод цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов от животных, привитых коклюшными антигенами, на клеточные культуры нервной ткани. М.М. Зотова предлагает использовать для этого цитотоксическое действие сывороток и их гамма-глобулиновых фракций при коклюшном ЭАЭ, выявляемое с помощью подавления миграции макрофагов (В сб. "Иммунология нервных и психических заболеваний", М., 1974, с. 298-299). Однако, вышеуказанные способы не дают полной информации о характере повреждающего действия коклюшных препаратов, отличаются высокой вариабельностью, кропотливостью исследований и использованием дорогостоящих реактивов.

Прототипом данного изобретения является метод, описанный в РД 42-28-10-90 "Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы". (Руководящий документ по стандартизации, утвержденный Минздравом СССР 12.03.90 г.). Метод основан на индукции бактериальными препаратами экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ), который является моделью аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы человека. ЭАЭ опосредуется развитием клеточного иммунного ответа на введение энцефалитогенной эмульсии, содержащий антигены мозговой ткани в полном адъюванте Фрейнда.

Развитие клинической симптоматики у животных в значительной степени определяется свойствами антигена в эмульсии, его способностью к запуску поликлонального синтеза аутоантител к антигенам центральной нервной системы и срыву толерантности к соответствующему антигену. Замена в полном адъюванте энцефалитогенной эмульсии туберкулезных бактерий на коклюшный вакцинный препарат и введение его с неполным адъювантом и мозговым антигеном животным позволяет оценить способность исследуемых препаратов вызывать развитие клеточно-опосредованных аутоиммунных реакций со стороны нервной системы.

Для воспроизведения ЭАЭ используют морских свинок (5 шт.), которых иммунизируют однократно энцефалитогенной эмульсией внутрикожно в подушечки лап в объеме 0,2 мл в каждую лапу. Энцефалитогенную эмульсию готовят следующим образом: 1) в неполном адъюванте Фрейдна эмульгируют 2010⁶ микробных тел коклюшных бактерий, обработанных формалином, 2) готовят гомогенат головного и спинного гомологичного мозга (мозговой антиген), 3) смешивают 2 части мозгового антигена и 3 части эмульсии - получают энцефалитогенную смесь.

Контрольным животным вводят мозговой антиген в неполном адъюванте Фрейдна (без коклюшных микробов).

Продолжительность опыта составляет 1 месяц, в течение которого, начиная с 5 суток (латентный период), регистрируют: нарушение координации движения, отставание в весе, паретичность конечностей, паралич гладких мышц сфинктеров мочевого пузыря и прямой кишки, а также летальность. По степени выраженности клинической картины ЭАЭ, летальности животных и гистологии срезов головного и спинного мозга судят о повреждающем действии коклюшных препаратов на нервную систему. Этому способу свойственны следующие недостатки: длительность сроков исследования, использование дорогостоящих животных, низкая воспроизводимость и высокая вариабельность за счет индивидуальности оценки клинических проявлений ЭАЭ, регистрируемых визуально.

Целью настоящего изобретения является упрощение метода, сокращения сроков исследования, дорогостоящих материалов и животных.

Эта цель достигается путем иммунизации экспериментальных животных коклюшной вакциной, приготовленной по МРТУ - 42 N 263 - 68 (Технические условия на приготовление коклюшной вакцины, утвержденные Минздравом СССР, 1968 г.), предварительно обработанной низкочастотным ультразвуком (42-50 кГц) в течение 5 минут, в дозе, составляющей 1,5 млрд м.т. (микробных тел), через 7 суток мышей декапитируют, ультраструктурные срезы мозговой ткани исследуют в электронном микроскопе и по наличию демиелинизации миелиновых волокон судят о токсических свойствах коклюшных вакцин.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СПОСОБА И ПРИМЕР ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Испытуемую коклюшную вакцину, приготовленную по МРТУ-42 N 263-68 и содержащую 500 млрд. м.т. в 1 мл, обрабатывают низкочастотным (42-50 кГц) ультразвуком с амплитудой колебания волновода-дезинтегратора 10-30 мкм, при экспозиции воздействия 5 минут, и оставляют на 24 часа при температуре 4-8^oC. Затем ее разводят стерильным 0,15 M раствором хлорида натрия до концентрации, составляющей 1,5 млрд м.т., в объеме 0,5 мл и этой дозой иммунизируют 3-5 мышей внутрибрюшинно. Через 7 дней мышей декапитируют в соответствии с "Правилами проведения экспериментальных работ на лабораторных животных" и забирают мозговую ткань. Кусочки мозга фиксируют в 2% растворе четырехокиси осмия (pH 7,3), для проведения дегидратации. Затем ткани заключают в смесь эпона с аралдитом. Ультраструктурные срезы, окрашенные уранилацетатом и цитратом свинца, изучают в электронном микроскопе УЭМВ - 100 К. Обнаружение демиелинизации миелиновых волокон является одним из ведущих признаков развития энцефалопатических реакций (Хорунжая Т.А., Бардахчьян Э.А., Сааков Б.А. "Механизмы экспериментальной демиелинизации". В сб. "Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии", Ростов-на-Дону, 1975, с.110-116) и свидетельствуют о выраженности токсического действия коклюшной вакцины на нервную ткань макроорганизма.

Обработка коклюшных вакцин ультразвуком применялась для обеспечения выхода субстанций, ответственных за энцефалитогенную активность из бактериальной клетки, для наиболее полной оценки токсических свойств испытуемых препаратов. Для этого использовали низкочастотный ультразвук (42-50 кГц) с амплитудой колебания волновода-дезинтегратора 10-30 мкм, при экспозиции воздействия 5 минут. Выбор такого режима обусловлен тем, что низкочастотный ультразвук имеет значительные преимущества по сравнению с высокочастотным ультразвуком, так как позволяет уменьшить акустическую мощность воздействия, увеличивая экономичность исследований. Кроме того, низкая трансформация энергии из акустической в тепловую позволяет предотвратить деградацию токсических субстанций коклюшных микробов, представляющих собой липопротеиды, в процессе ультразвукового воздействия (Ф.И. Брагинская, "Количественные закономерности действия ультразвука на биомолекулы и клетки и ультразвуковая спектроскопия биологических структур", Автореф. докт. дисс., М., 1981, с. 39).

Для отработки предлагаемого способа были проведены соответствующие исследования. В этих опытах использовали коклюшные вакцины, приготовленные из разных штаммов коклюшных бактерий, полученных из Государственного института стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича. Высокотоксичные коклюшные вакцины были приготовлены из штаммов 688, 703, средней токсичности - из штаммов 345 и 187 и слабой токсичности - из штамма 222 по МРТУ - 42 N 263-68.

Результаты изучения ультраструктуры больших полушарий головного мозга мышей спустя 7 суток после введения коклюшных препаратов показали, что использование коклюшных вакцин из штаммов 688 и 703 приводило к гипертрофии аппарата Гольджи, микроциркуляторным расстройствам, к резкому увеличению количества пиноцитозных везикул в гипертрофированных эндотелиальных клетках, что указывало на повышение проницаемости гематоэнцефалитического барьера. Характерной особенностью являлась демиелинизация по типу "косичек" миелиновых волокон, контактирующих с глиальными клетками или находящихся рядом с ними (фото 1).

При использовании коклюшных вакцин из среднетоксичных штаммов 545 и 187 наблюдали преобладание пикноморфных нервных клеток с набухшими митохондриями, резкое увеличение перенуклеарного пространства в олигодендроцитах, однако признаки миелоагрессии отсутствовали (фото 2).

Введение коклюшной вакцины из слабо токсичного штамма 222 существенного повреждающего действия на ультраструктуру головного мозга не оказывало: глиальные клетки практически не повреждались, сосудистая проницаемость менялась незначительно, демиелинизация в этом случае характеризовалась несущественными нарушениями упорядоченности миелиновых волокон (фото 3).

Совершенно очевидно, что коклюшные вакцины, вызывающие демиелинизацию миелиновых волокон, являющуюся признаком последующих энцефалитических расстройств вплоть до энцефалопатий и энцефаломиелитов, в практике производства вакцинных препаратов должны быть исключены.

На основании проведенных исследований выявлен ряд отличительных признаков предлагаемого способа по сравнению с прототипом, которые представлены в таблице.

Таким образом, как видно из таблицы, предлагаемый способ по сравнению с прототипом обладает следующими преимуществами: на 23 дня сокращается срок исследования, в 2 раза количество животных, в 24 раза их стоимость, в 13 раз расход испытуемых вакцин, а также существенно упрощается трудоемкость процесса.