очистка днк путем образования тройной спирали с иммобилизированным олигонуклеотидом

Формула изобретения

1. Способ получения лекарственного средства на основе двунитевой ДНК, отличающийся тем, что на первой стадии осуществляют очистку двунитевой ДНК путем пропускания раствора, содержащего указанную ДНК в смеси с другими компонентами, через носитель, с которым ковалентно связан олигонуклеотид, включающий богатую цитозинами гомопиримидиновую последовательность и способный образовывать за счет гибридизации тройную спираль со специфической гомопурингомопиримидиновой последовательностью, находящейся в вышеуказанной ДНК, причем указанная специфическая последовательность представляет собой последовательность, естественным образом присутствующую в двунитевой ДНК или искусственно введенную в нее с последующим использованием препарата очищенной таким образом ДНК в фармацевтической композиции.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что содержащим вышеуказанную ДНК раствором является клеточный лизат.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что клеточным лизатом является осветленный лизат.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что двунитевую ДНК предварительно очищают.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что специфическую последовательность искусственно вводят в двунитевую ДНК.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что олигонуклеотид включает последовательность поли-СТТ, а специфической последовательностью, имеющейся в ДНК, является последовательность поли-GAA.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет последовательность GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (последовательность 1).

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет последовательность (СТТ)₇ (последовательность 26).

9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность представляет собой последовательность (GAA)₇, (GAA)₁₄ или (GAA)₁₇.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность содержит последовательность 5, а олигонуклеотид включает последовательность 6 или последовательность 7.

11. Способ по п.4, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность включает последовательность 17, а олигонуклеотид включает последовательность 18.

12. Способ по п.4, отличающийся тем, что имеющаяся в ДНК специфическая последовательность включает последовательность (GA) 25, а олигонуклеотид включает последовательность 19.

13. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что специфической последовательностью является специфическая последовательность, которая естественным образом присутствует в двунитевой ДНК.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что естественным образом присутствующей в ДНК специфической последовательностью является гомопурин-гомопиримидиновая последовательность, имеющаяся в источнике репликации плазмиды.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что специфическая последовательность ДНК включает всю или часть последовательности 2, включаемой в источник репликации ColEI E.coli.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что олигонуклео-тид включает последовательность 3.

17. Способ по п.13, отличающийся тем, что специфическая последовательность ДНК включает всю или часть последовательности 4 или последовательности 8, входящих в ген -лактамазы плазмиды pBR 322.

18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что олигонуклеотид связывается с носителем за счет дисульфидной, простой тиоэфирной, сложноэфирной, амидной или аминной связи.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что олигонуклеотид фиксируют в колонке посредством плеча, образованного углеродсодержащей цепью (СН₂)_n, в которой n означает целое число от 1 до 18 включительно, причем вышеуказанное плечо связывается с олигонуклеотидом за счет фосфата, а с колонкой - за счет амидной связи.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что плечо образовано линейной углеродсодержащей цепью с 6 атомами углерода.

21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что плечо образовано линейной углеродсодержащей цепью с 12 атомами углерода.

22. Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что олигонуклеотид имеет по крайней мере одну химическую модификацию, делающую его устойчивым к или защищающую против нуклеаз или повышающую его сродство к специфической последовательности.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что олигонуклеотид включает гомопиримидиновую последовательность, в которой по крайней мере один из цитозинов метилирован.

24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что ДНК дополнительно содержит одну или несколько терапевтических последовательностей.

25. Способ по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что двунитевой ДНК является кольцевая ДНК, такая, как плазмида.

26. Способ по п.1, отличающийся тем, что специфическая последовательность, имеющаяся в двунитевой ДНК, включает несколько положений гибридизации с олигонуклеотидом.

27. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель выбирают среди используемых в хроматографии носителей, пластмассовых поверхностей и функционализированных латексных шариков.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что носителем является используемый в хроматографии носитель.

29. Способ по п.1, отличающийся тем, что лекарственное средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,5%.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что лекарственное средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,2%.

31. Способ по п.30, отличающийся тем, что лекарственное средство содержит хромосомную ДНК в количестве ниже или равном 0,1%.

32. Способ очистки двунитевой РНК, отличающийся тем, что он включает по крайней мере одну стадию, где содержащий вышеуказанную РНК в смеси с другими компонентами раствор пропускают через носитель, с которым ковалентно связан олигонуклеотид, включающий богатую цитозинами гомопиримидиновую последовательность и способный образовывать за счет гибридизации тройную спираль со специфической гомопурин-гомопиримидиновой последовательностью, находящейся в вышеуказанной РНК, причем указанная специфическая последовательность представляет собой последовательность, естественным образом присутствующую в двунитевой РНК или искусственно введенную в нее.

33. Способ очистки плазмидной ДНК, отличающийся тем, что он включает по крайней мере одну стадию, где содержащий вышеуказанную ДНК в смеси с другими компонентами раствор пропускают через носитель, с которым ковалентно связан олигонуклеотид, включающий богатую цитозинами гомопиримидиновую последовательность и способный образовывать за счет гибридизации тройную спираль со специфической гомопурин-гомопиримидиновой последовательностью, находящейся в вышеуказанной ДНК, причем указанная специфическая последовательность представляет собой последовательность, естественным образом присутствующую в двунитевой ДНК или искусственно введенную в нее.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новому способу очистки ДНК. Способ согласно изобретению позволяет быстро очищать двунитевую ДНК, используемую в фармакологии. Более конкретно, в способе очистки согласно изобретению используют специфическую гибридизацию между последовательностью ДНК и олигонуклеотидом.

Методы генной и клеточной терапии в настоящее время получили широкое развитие. Однако, для этих методов необходимо располагать возможностью получения значительных количеств ДНК фармацевтической чистоты. В самом деле, в случае этих новых видов терапии лекарственное средство часто образовано самой ДНК, и необходимо иметь возможность получать, в соответствующих количествах, выделять и очищать соответствующим образом ДНК для целей терапевтического использования в случае человека.

В настоящем изобретении описывается новый простой и особенно эффективный способ очистки ДНК. Этот способ в особенности позволяет достигать наиболее высокой чистоты при высоких выходах.

Способ согласно изобретению базируется главным образом на специфическом взаимодействии между включенной в очищаемую ДНК последовательностью и олигонуклеотидом, состоящим из природных или модифицированных оснований.

Недавно было показано, что некоторые олигонуклеотиды способны специфически взаимодействовать в большом просвете двойной спирали ДНК с образованием локально тройных спиралей, приводящих к ингибированию транскрипции генов-мишеней (Helene и Toulme, Biochem. Biophys. Acta, 1049, 99, (1990)). Эти олигонуклеотиды селективно распознают двойную спираль ДНК на уровне олигопуриновой-олигопиримидиновой последовательностей, то есть на уровне сайтов, обладающих олигопуриновой последовательностью на нити и олигопиримидиновой последовательностью на комплементарной нити, и образуют там локально тройную спираль. Основания третьей нити (олигонуклеотид) образуют водородные связи (связи Hoogsteen или противоположно Hoogsteen) с пуринами пар оснований Уотсон-Крика.

Использование этого типа взаимодействия для выделения плазмиды описывается в уровне техники. Так, Ito и др. (PNAS, 89, 495 (1992)) описывают использование биотинилированных олигонуклеотидов, способных распознавать определенную последовательность плазмиды и образовывать с ней тройную спираль. Таким образом полученные комплексы затем вводят в контакт с магнитными шариками, покрытыми стрептавидином. Взаимодействие между биотином и стрептавидином тогда позволяет выделить плазмиду путем отделения с помощью магнита шариков, затем элюирования. Однако, этот способ обладает некоторыми недостатками. В частности, необходимы два специфических последовательных взаимодействия: первое - между олигонуклеотидом и плазмидой, второе - между биотинилированным комплексом и шариками со стрептавидином. Кроме того, конечный раствор может быть загрязнен биотинилированным олигонуклеотидом, который не может быть использован в фармацевтической композиции.

В настоящем изобретении описывается новый улучшенный способ очистки ДНК, в котором прибегают к этому типу взаимодействия. Более конкретно, в способе согласно изобретению используют олигонуклеотиды, ковалентно связанные с носителем. Этот способ является особенно быстрым и приводит к особенно высоким выходам и особенно высоким степеням чистоты. С другой стороны, он позволяет очищать ДНК, исходя из сложных смесей, включающих, в частности, другие нуклеиновые кислоты, протеины, эндотоксины (такие, как липополисахариды), нуклеазы и т. д. Используемые носители, кроме того, могут быть легко повторно использованы, и полученные ДНК обладают улучшенными свойствами фармацевтической безопасности. Наконец, для этого способа, в противоположность уровню техники, требуется одна стадия.

Первым объектом изобретения, следовательно, является способ очистки двунитевой ДНК, согласно которому раствор, содержащий вышеуказанную ДНК в смеси с другими компонентами, пропускают через носитель, с которым ковалентно связан олигонуклеотид, способный образовывать путем гибридизации тройную спираль со специфической последовательностью, имеющейся в вышеуказанной ДНК. Специфической последовательностью может быть последовательность, имеющаяся по своей природе в двунитевой ДНК, или синтетическая последовательность, искусственно введенная в двунитевую ДНК.

Используемыми в настоящем изобретении олигонуклеотидами являются олигонуклеотиды, гибридизующиеся непосредственно с ДНК в виде двойной нити. Эти олигонуклеотиды могут содержать следующие основания:

- тимидин (Т), который способен образовывать триплеты с дублетами AT двунитевой ДНК (Rajagopal и др., Biochem., 28, 7859 (1989));

- аденин (А), который способен образовывать триплеты с дублетами A.T. двунитевой ДНК;

- гуанин (G), который способен образовывать триплеты с дублетами G.C двунитевой ДНК;

- протонированный цитозин, (C +), который способен образовывать триплеты с дублетами G.C двунитевой ДНК (Rajagopal и др., см. выше);

- урацил (U), который способен образовывать триплеты с парами оснований A.U или A.T.

Предпочтительно, используемый олигонуклеотид включает обогащенную цитозинами гомопиримидиновую последовательность, а специфическая последовательность, имеющаяся в ДНК, представляет собой гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность. Присутствие цитозинов позволяет иметь тройную спираль, стабильную при кислом значении pH, где цитозины протонированы, и дестабилизированную при щелочном значении pH, где цитозины нейтрализованы.

Для того чтобы могло произойти образование тройной спирали путем гибридизации, важным является то, чтобы олигонуклеотид и специфическая последовательность, имеющаяся в ДНК, были комплементарными. В этом отношении, для достижения наилучших выходов и наилучшей селективности, в способе согласно изобретению используют обязательно комплементарные олигонуклеотид и специфическую последовательность. Речь может идти, в частности, об олигонуклеотиде поли-CTT и специфической последовательности поли-GAA. В качестве примера можно назвать олигонуклеотид с последовательностью 5"-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT - 3" [GAGG (CTT)₇; последовательность N 1)], в котором основания GAGG не образуют тройной спирали, но позволяют отделять промежутком олигонуклеотид от плеча связывания; можно также назвать последовательность (CTT)₇ (последовательность N 26). Эти олигонуклеотиды способны образовывать тройную спираль со специфической последовательностью, включающей комплементарные элементы (GAA). В частности, речь может идти о сайте, включающем 7, 14 или 17 элементов GAA, как описывается в примерах.

Другой, представляющей интерес, специфической последовательностью является последовательность:

5" - AAGGGAGGGAGGAGAGGAA - 3" (последовательность N 5). Эта последовательность образует тройную спираль с олигонуклеотидами:

5" - AAGGAGAGGAGGGAGGGAA - 3" (последовательность N 6) или 5" - TTGGTGTGGTGGGTGGGTT - 3" (последовательность N 7).

В этом случае олигонуклеотид фиксируется в антипараллельном направлении на полипуриновой нити. Эти тройные спирали устойчивы только в присутствии Mg²⁺ (Vasquez и др. Biochemistry, 34, 7243- 7251 (1995); Beal и Dervan, Science, 251, 1360-1363 (1991)).

Как указано выше, специфическая последовательность может представлять собой присутствующую по своей природе (естественно) в двунитевой ДНК или синтетическую последовательность, введенную искусственно в двунитевую ДНК. Особый интерес представляет использование олигонуклеотида, способного образовывать тройную спираль с последовательностью, присутствующей по своей природе в двунитевой ДНК, например, в сайте репликации плазмиды или в гене-маркере. В этом отношении заявитель проанализировал последовательности плазмид и смог показать, что некоторые сайты (области) этих ДНК, особенно в исходном пункте репликации, могут содержать гомопуриновые-гомопиримидиновые участки. Синтез олигонуклеотидов, способных образовывать тройные спирали с этими естественными гомопуриновыми-гомопиримидиновыми участками, позволяет предпочтительно применять способ согласно изобретению к немодифицированным плазмидам, особенно к имеющимся в продаже плазмидам типа pUC, pBR322, pSV, и т. д. Из гомопуриновых-гомопиримидиновых последовательностей, присутствующих естественно в двунитевой ДНК, можно назвать последовательность, включающую всю или часть последовательности 5" - CTTCCCGAAGGGAGAAAGG - 3" (последовательность N 2), имеющуюся в исходном пункте репликации ColEl E.coli. В этом случае нуклеотид, образующий тройную спираль, имеет последовательность: 5" - GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC - 3" (последовательность N 3) и альтернативно фиксируется на двух нитях двойной спирали, как описывают Beal и Dervan (J. Am. Chem. Soc. , 114, 4976-4982 (1992)) и Jayasena и Johnston (Nucleic Acids Res., 20, 5279-5288 (1992)). Также можно назвать последовательность 5" - GAAAAAGGAAGAG - 3" (последовательность N 4) гена - лактамазы плазмиды pBR322 (Duval-Valentin и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 504-508 (1992)). Использование олигонуклеотида, способного образовывать тройную спираль с последовательностью, имеющейся в исходном пункте репликации или гене-маркере, особенно предпочтительно, так как она позволяет, с помощью одного и того же олигонуклеотида, очищать любую ДНК, содержащую вышеуказанный сайт репликации или вышеуказанный ген-маркер. Следовательно, нет необходимости модифицировать плазмиду или двунитевую ДНК для встраивания в нее специфической искусственной последовательности.

Хотя предпочтительны полностью комплементарные последовательности, однако, следует иметь в виду, что могут быть допустимы некоторые конъюгации между последовательностью олигонуклеотида и присутствующей в ДНК последовательностью того момента, как только они не приводят к слишком большой потере сродства. Можно назвать последовательность 5" - AAAAAAGGGAATAAGGG - 3" (последовательность N 8), имеющуюся в гене - лактамазы E.coli. В этом случае тимин, прерывающий полипуриновую последовательность, может распознаваться гуанином третьей нити, образующим таким образом триплет ATG, который стабилен, когда он вставлен между двумя триплетами TAT (Kiessling и др. Biochemistry, 31, 2829-2834 (1992)).

Согласно особому варианту осуществления, олигонуклеотиды согласно изобретению включают последовательность (CCT)_n, последовательность (CT)_n или последовательность (CTT)_n, в которой "n" означает целое число от 1 до 15 включительно. Особенно предпочтительно использовать последовательности типа (CT)_n или (CTT)_n. Заявитель в самом деле показал, что на эффективность очистки влияет количество C в олигонуклеотиде. В частности, как указано в примере 7, эффективность очистки повышается, когда олигонуклеотид включает меньше цитозинов. Само собой разумеется, что олигонуклеотиды согласно изобретению также могут сочетать в себе элементы (CTT), (CT) или (CTT).

Используемый олигонуклеотид может быть природным (состоящим из природных, немодифицированных оснований) или химически модифицированным. В частности, олигонуклеотид предпочтительно может быть подвергнут некоторым химическим модификациям, позволяющим повышать его резистентность или его защиту по отношению к нуклеазам или его сродство по отношению к специфической последовательности.

Согласно настоящему изобретению под олигонуклеотидом также понимают любую последовательность нуклеозидов, претерпевших модификацию скелета с целью придания большей устойчивости по отношению к нуклеазам. Из возможных модификаций можно назвать фосфоротиоатные олигонуклеотиды, которые способны образовывать тройные спирали с ДНК (Xodo и др., Nucleic Acids Res., 22, 3322-3330 (1994)), точно так же, как олигонуклеотиды, обладающие формацетальным или метилфосфонатным скелетами (Matteucci и др., J. Am. Chem. Soc., 113, 7767-7768 (1991)). Также можно использовать олигонуклеотиды, синтезированные с -аномерами нуклеотидов, которые также образуют тройные спирали с ДНК (Le Doan и др., Nucleic Acids Res., 15, 7749-7760 (1987)). Другой модификацией скелета является фосфорамидатная связь. Можно назвать, например, межнуклеотидную фосфорамидатную N3" - Р5" связь, описанную Gryaznov и Chen, которая дает олигонуклеотиды, образующие с ДНК особенно стабильные тройные спирали (J. Am. Chem. Soc., 116, 3143-3144 (1994)). Из других модификаций скелета можно также назвать использование рибонуклеотидов, 2"-0-метилрибозы, сложных фосфодиэфиров. . . (Sun и Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Содержащий фосфор скелет, наконец, может быть заменен полиамидным скелетом, как в ПНК (пептидные нуклеиновые кислоты), которые также могут образовывать тройные спирали (Nielsen и др., Science, 254, 1497-1500 (1991); Kim и др., J. Am. Chem. Soc., 115, 6477-6481 (1993)), или скелетом на основе гуанидина, как в ДНГ (дезоксирибонуклеиновые гуанидины; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6097-6101 (1995)), аналогичных поликатионных ДНК, которые также образуют тройные спирали.

Тимин третьей нити также может быть заменен 5-бромурацилом, в результате чего повышается сродство олигонуклеотида к ДНК (Povsic и Dervan, J. Am. Chem. Soc., 111, 3059-3061 (1989)). Третья нить также может содержать неприродного происхождения основания, из которых можно назвать 7-деаза-2"-дезоксиксантозин (Milligan и др. , Nucleic Acids Res., 21, 327-333 (1993)), 1-(2-дезокси- -D-рибофуранозил)-3-метил- 5-амино-1Н-пиразоло/4,3-d/пиримидин-7-он (Koh и Dervan, J. Am. Chem, Soc., 114, 1470-1478 (1992)), 8-оксоаденин, 2-аминопурин, 2"-0-метил-псевдоизоцитидин, или любую другую модификацию, известную специалисту (см. обзор Sun и Helene, Curr. Opinion Struct. Biol. 3, 345-356 (1993)).

Целью другого типа модификации олигонуклеотида предпочтительно является улучшение взаимодействия и/или сродства между олигонуклеотидом и специфической последовательностью. В частности, самая предпочтительная модификация согласно изобретению заключается в метилировании цитозинов олигонуклеотида (см. пример 5). Таким образом метилированный олигонуклеотид обладает замечательным свойством образовывать стабильную тройную спираль со специфической последовательностью в более близких к нейтральному ( 5) значениях pH. Следовательно, этот тип модификации позволяет работать при более высоких значениях pH, чем в случае олигонуклеотидов уровня техники, то есть при значениях pH, где очень снижены опасности разрушения плазмидной ДНК.

Длина используемого в способе согласно изобретению олигонуклеотида составляет по крайней мере 3 основания и предпочтительно от 5 до 30 оснований. Предпочтительно используют олигонуклеотид длиной выше 10 оснований. Длина может быть выбрана специалистом в зависимости от искомых селективности и стабильности взаимодействия.

Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы любым известным способом. В частности, они могут быть получены с помощью синтезаторов нуклеиновых кислот. Естественно, также может быть использован любой другой способ, известный специалисту.

Для его ковалентного связывания с носителем олигонуклеотид обычно функционализируют. Так, он может быть модифицирован концевой тиольной группой, аминогруппой или карбоксильной группой в положении 5" или 3". В частности, добавление тиольной, амино- или карбоксильной группы позволяет, например, связывать олигонуклеотид с носителем, который содержит дисульфидную, малеимидную, амино-, карбоксильную, сложноэфирную, эпоксидную, бромциановую или альдегидную функции. Эти сочетания происходят путем образования дисульфидной, простой тиоэфирной, сложноэфирной, амидной или аминной связей между олигонуклеотидом и носителем. Может быть использован любой другой, известный специалисту метод, такой, как, например, применение бифункциональных реагентов сочетания.

Кроме того, для улучшения гибридизации со связанным олигонуклеотидом, может быть предпочтительным, чтобы олигонуклеотид содержал "плечо" и "спейсер" - последовательность оснований. Использование плеча на деле позволяет фиксировать олигонуклеотид на выбранном расстоянии от носителя, позволяющем улучшать условия его взаимодействия с ДНК. Плечо предпочтительно образовано линейной углеводородной цепью, включающей 1-18 и предпочтительно 6 или 12 CH₂-групп, и амином, способствующим связыванию с носителем в колонке. Плечо связано с фосфатом олигонуклеотида или "спейсера", состоящего из оснований, не интерферирующих с гибридизацией. Так, "спейсер" может включать пуриновые основания. В качестве примера, "спейсер" может представлять собой последовательность GAGG. Плечо предпочтительно образовано линейной углеводородной цепью с 6 или 12 атомами углерода.

Для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы различные типы носителей. Речь может идти о функционализированных носителях, используемых в хроматографии, в насыпном состоянии или предварительно "упакованных" в колонку, функционализированных пластмассовых поверхностях или функционализированных шариках из латекса, магнитных или нет. Речь идет предпочтительно об используемых в хроматографии носителях. В качестве примера, применяемыми в хроматографии носителями, которые могут быть использованы, являются агароза, акриламид или декстран, так же, как их производные (такие, как сефадекс, сефароза, супероза, ...), полимеры, такие, как сополимер стирола с дивинилбензолом, или графт-сополимеризованный или нет диоксид кремния. Хроматографические колонки могут функционировать по методу диффузии или перфузии.

Для достижения наилучшей эффективности очистки, особенно предпочтительно использовать, в плазмиде, последовательность, включающую несколько положений гибридизации с олигонуклеотидом. Наличие нескольких положений (участков) гибридизации в самом деле благоприятствует взаимодействиям между вышеуказанной последовательностью и олигонуклеотидом, что приводит к улучшению эффективностей очистки. Так, для олигонуклеотида, содержащего "n" повторений элементов (CCT), (CT) или (CTT), предпочтительно использовать последовательность ДНК, включающую по крайней мере "n" комплементарных элементов и предпочтительно (n+1) комплементарных элементов. Содержащая (n+1) комплементарных элементов последовательность таким образом имеет два положения гибридизации с олигонуклеотидом. Предпочтительно, последовательность ДНК включает вплоть до 11 положений гибридизации, то есть (n+10) комплементарных элементов.

Способ согласно изобретению может быть использован для очистки любого типа двунитевой ДНК. Речь идет, например, о кольцевой ДНК, такой, как плазмида, включающая обычно один или несколько генов, представляющих интерес с точки зрения терапии. Эта плазмида может содержать также источник репликации, ген-маркер и т.д. ... Способ изобретения может быть применим непосредственно к клеточному лизату. При этом варианте осуществления, плазмиду, амплифицированную путем трансформации, затем клеточной культурой, очищают непосредственно после лизиса клеток. Способ согласно изобретению также может быть применим к осветленному лизату, то есть к супернатанту, полученному после нейтрализации и центрифугирования клеточного лизата. Этот способ очевидно также может быть применим к предварительно очищенному известными способами раствору. Этот способ также позволяет очищать линейную или кольцевую ДНК, включающую представляющую интерес последовательность, исходя из смеси, содержащей ДНК с различными последовательностями. Способ согласно изобретению также может быть использован для очистки двунитевой РНК.

Клеточный лизат может представлять собой лизат прокариотных или эукариотных клеток.

Что касается прокариотных клеток, то можно назвать, например, бактерии Е. coli, В. subtilis, S. typhimurium или Streptomyces. Что касается эукариотных клеток, то можно назвать животные клетки, дрожжи, грибы и т.д. ..., и особенно дрожжи Kluyveromyces или Saccharomyces или клетки COS, CHO, C127, NIH3T3, и т.д.

Способ согласно изобретению является особенно предпочтительным, так как он позволяет быстро и просто получать плазмидную ДНК очень высокой степени чистоты. В частности, как проиллюстрировано в примерах, этот способ позволяет эффективно отделять рассматриваемую плазмидную ДНК от загрязняющих компонентов, таких, как фрагментированная хромосомная ДНК, эндотоксины, протеины, нуклеазы, и т.д. ... Более предпочтительно, способ согласно изобретению позволяет получать препарат двунитевой ДНК, особенно плазмидной, содержащий хромосомную ДНК в количестве, ниже или равном 0,5%. Еще более предпочтительно, препараты ДНК, которые получают, имеют содержание хромосомной ДНК, ниже или равное 0,2%. Следовательно, настоящее изобретение относится к содержащим плазмидную ДНК композициям, используемым в фармацевтике, особенно в генной или клеточной терапии. В этом отношении, объектом изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая линейную или плазмидную двунитевую ДНК, полученную согласно вышеуказанному способу.

Изобретение также относится к препаратам плазмидных ДНК с содержанием хромосомной ДНК, ниже или равным 0,5%, предпочтительно 0,2% и еще более предпочтительно 0,1%.

Композиции могут содержать "голую" плазмидную ДНК или плазмидную ДНК, ассоциированную с транспортными векторами, такими, как липосомы, наночастицы, катионные липиды, полимеры, протеины или рекомбинантные вирусы, и т.д.

Настоящее изобретение описывается далее подробно в нижеследующих примерах, которые нужно рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие объема охраны изобретения.

Общие методы клонирования и молекулярной биологии

Классические методы молекулярной биологии, такие, как переваривание с помощью ферментов рестрикции, электрофорез на геле, превращение в E.coli, преципитация нуклеиновых кислот, и т.д., описаны в литературе (Maniatis и др. Т. , E.F. Fritsch, и J.Sambrook, 1989. "Молекулярное клонирование: пособие для лабораторных работ", второе издание; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк; Ausubel F.M., Brent R., Kinston R. E. , Moore D. D. , Smith J.A., Seidman J.G. и Struhl K., 1987: "Современные методики в молекулярной биологии 1987-1988 гг." изд. John Willey и Sons, Нью-Йорк). Нуклеотидные последовательности определяют по методу терминизации цепей согласно уже описанной методике (Ausubel и др., 1987).

Ферменты рестрикции были предоставлены фирмой New-England Biolabs, МА (Biolabs).

Для лигирований, фрагменты ДНК инкубируют в буфере из 50 ммоль ТРИС-HCl с pH 7,4, 10 ммоль хлорида магния, 10 ммоль дитиотреитола, 2 ммоль аденозин-5"-трифосфата (АТФ), в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 (Biolabs).

Олигонуклеотиды синтезируют, используя химию фосфорамидитов, защищенных в положении цианоэтильной группой (Sinha N.D., Biernat J., McManus J. и Koster H. , 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII; Использование -цианоэтил-N, N-диалкиламино- /N-морфолино- фосфоримидита дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК с легким снятием защиты и выделение конечного продукта. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles J.W. 1985. Успехи в автоматизированном синтезе ДНК. Am. Biotechnol., ноябрь/декабрь), с помощью автоматического синтезатора ДНК Biosearch 8600 при использовании рекомендаций изготовителя.

Лигированные или испытанные на их эффективность в отношении трансформации ДНК используют для трансформации продуцирующего компетентного штамма: E. coli DH5 [F"/end AI., hsdR17, supE44, thi-I, recAI, gyrA96, reIAI, (IacZYA-arqF) U169, deoR, Ф80dlac (IacZ М15)].

Минипрепараты плазмидной ДНК получают согласно методике Klein и др., 1980.

Культуральную среду LB используют для выращивания штаммов E. coli (Maniatis и др., 1982). Штаммы инкубируют при 37^oC. Бактерии наносят тонким слоем в чашки со средой LB, куда добавлены соответствующие антибиотики.

Пример 1

1.1. Подготовка колонки;

Материал:

Используемая колонка представляет собой колонку с HiTrap, активированным N-гидроксисукцинимидом (фармация) в количестве 1 мл, соединенную с перистальтическим насосом (расход < 1 мл/мин). Используемый специфический олигонуклеотид содержит группу NH₂ в положении 5". Его последовательность следующая:

5"- GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3" (последовательность N 1).

Используемыми в этом примере буферами являются следующие: буфер для реакции связывания: 0,2 М гидрокарбоната натрия, 0,5 М хлорида натрия, pH 8,3; буфер A; 0,5 М этаноламина, 0,5 М хлорида натрия, pH 8,3; буфер Б: 0,1М ацетата, 0,5 М хлорида натрия, pH 4.

Методика:

Колонку промывают с помощью 6 мл 1 мМ соляной кислоты, затем в колонку вносят олигонуклеотид, разбавленный буфером для реакции связывания (50 нмоль в 1 мл), и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Колонку промывают три последовательных раза с помощью 6 мл буфера A, затем 6 мл буфера Б. Олигонуклеотид таким образом связывается с носителем в колонке за счет связи CONH. Колонку хранят при температуре 4^oC в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 0,1% азида натрия (NaN₃) и ее можно использовать по крайней мере четыре раза.

1.2. Конструирование плазмид

Синтезируют два следующих олигонуклеотида:

олигонуклеотид 4817:

5"- GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3" (последовательность N 9);

олигонуклеотид 4818:

5" - AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3" (последовательность N 10).

Эти олигонуклеотиды, один раз гибридизированные и клонированные в плазмиде, вносят в соответствующую плазмиду гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность (GAA)₁₇, как описано выше.

Соответствующую этим двум гибридизованным олигонуклеотидам последовательность клонируют в многочисленных сайтах клонирования плазмиды pBKS⁺ (стратагенная система клонирования; La Jolla C.A.), которая содержит ген устойчивости к ампициллину. Для осуществления этого, олигонуклеотиды гибридизируют следующим образом:

По 1 мкг этих олигонуклеотидов вместе вносят в 40 мл конечного буфера из 50 мМ ТРИС-HCl, pH 7,4, и 10 мМ хлорида магния. Эту смесь нагревают до 95^oC, затем доводят до комнатной температуры так, чтобы температура понижалась медленно. 10 нг смеси гибридизованных олигонуклеотидов лигируют с 200 нг плазмиды pBKS⁺ (стратагенная система клонирования; La Jolla CA), переваривают с помощью BamHI и EcoRI в конечном объеме 30 мкл. После лигирования одну аликвоту превращают в DH5. Смеси после трансформации наносят тонким слоем на среду L, дополненную ампициллином (50 мг/л) и X-gal (20 мг/л). У рекомбинантных клонов должно отсутствовать синее окрашивание в этой среде в противоположность родственной плазмиде (pBKS⁺), что допускает -комплементацию w-фрагмента -галактозидазы E.coli. После минипрепарирования плазмидной ДНК из 6 клонов, у всех у них исчезает сайт PstI, расположенный между сайтами EcoRI и BamHI в pBKS⁺, наблюдается повышение молекулярной массы полосы PvuII из 448 п.о., содержащей мультисайт клонирования. Получают клон и соответствующую плазмиду называют pXL2563. Клонированную последовательность подтверждают последовательностью, используя праймер - 20 (5"-TGACCGGCAGCAAAATG-3" (последовательность N 11)) (Viera J. и Messing J., 1982. "pUC - Плазмиды в производимой от М13mp7 системе для инсерционного мутагенеза и секвенирования с помощью синтетических универсальных праймеров". Gene, 19, 259-268) плазмиды pBKS⁺ (стратагенная система клонирования; La Jolla CA). Плазмиду pXL2563 очищают при помощи набора Wizard Megaprep (Промега Корп., Мэдисон, WI), следуя рекомендациям поставщика. Этот препарат плазмидной ДНК используют впоследствии в нижеописываемых примерах.

1.3. Очистка плазмиды

Материал:

Плазмиду pXL2563 (описана в п. 1.2) очищают на колонке с HiTrap, связанным с описанным в п. 1.1. олигонуклеотидом, исходя из раствора, содержащего также плазмиду pBKS⁺. Используемые во время этой очистки буферы представляют собой следующие:

буфер Е: 2М NaCl, 0,2 М ацетата, pH 4,5-5;

буфер Д: 1М ТРИС-HCl, pH 9, 0,05 мМ ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота).

Методика:

Колонку промывают с помощью 6 мл буфера Е, затем плазмиды (20 мкг pXL2563 и 20 мкг pEKS⁺ в 400 мкл буфера Е) вносят в колонку и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. Колонку промывают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют элюирование с помощью буфера Д. Плазмиды идентифицируют после электрофореза на 1%-ном геле агарозы и окрашивания этидиумбромидом. Долю плазмид в растворах определяют путем их трансформантной активности в отношении E.coli.

Результат:

Исходя из смеси, содержащей 30% pXL2563 и 70% pBKS⁺, на выходе из колонки получают раствор со 100% pXL2563. Чистота, оцениваемая по соотношению оптических плотностей при 260 и 280 нм, составляет 1,9-2,5, что указывает на то, что этим способом удаляют загрязняющие протеины.

Пример 2

2.1. В этом примере описывается эксперимент по очистке плазмидной ДНК. Связывание олигонуклеотида (5"-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3" (последовательность N 1) с носителем в колонке осуществляют как указано в примере 1. Для сочетания (связывания), олигонуклеотид модифицируют по концу 5" с помощью аминогруппы, связанной с фосфатом спейсера с помощью плеча, содержащего 6 атомов углерода (модифицированный олигонуклеотид; Eurogentec S А, Бельгия). Плазмиду pXL2563 очищают с помощью набора Wizard Megaprep (Промега Корп., Мэдисон, WI), следуя рекомендациям поставщика. Используемыми в этом примере буферами являются следующие:

буфер Е: 0,2М NaCl; 0,2М ацетата; pH 4,5-5;

буфер Д: 1М ТРИС-HCl, pH 9; 0,5 мМ ЭДТК.

Колонку промывают с помощью 6 мл буфера Е, затем 100 мкг плазмиды pXL2563, разбавленные с помощью 400 мкл буфера Е, вносят в колонку и инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре. Колонку промывают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют элюирование с помощью буфера Д. Плазмиду квантифицируют путем определения оптической плотности при 260 нм.

В этом примере фиксацию осуществляют в буфере, молярность которого по NaCl изменяется от 0 до 2 моль (буфер Е). Эффективность очистки снижается, когда молярность NaCl увеличивается. pH-Значение буфера для фиксации может изменяться в пределах от 4,5 до 5, причем эффективность очистки лучше при 4,5. Также можно использовать другой буфер для элюирования с основным значением pH: так, элюирование осуществляют с помощью буфера из 50 мМ бората, pH 9, и 0,5 мМ ЭДТК.

2.2. Осуществляют связывание олигонуклеотида

5"-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3" (последовательность N 1) с носителем в колонке, как указано в примере 1. Плазмиду pXL2563 очищают с помощью набора Wizard Megaprep (Промега Корп., Мэдисон, WI), следуя рекомендациям поставщика. Используемыми в этом примере буферами являются следующие:

буфер Е: 0,1 М NaCl, 0,2 М ацетата, pH 5;

буфер Д: 1 М ТРИС-HCl, pH 9, 0,5 мМ ЭДТК.

Колонку промывают с помощью 6 мл буфера Е, затем 100

мкг плазмиды pXL2563, разбавленные с помощью 400 мкл буфера Е, вносят в колонку и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Колонку промывают с помощью 10 мл буфера Е, затем осуществляют элюирование с помощью буфера Д. Содержание геномной или хромосомной ДНК E.coli, присутствующей в образцах плазмиды, определяют до и после пропускания через колонку олигонуклеотида. Эту геномную ДНК квантифицируют с помощью полимеразной цепной реакции, используя праймеры, в гене gaIK E.coli, согласно следующей методике:

Последовательность праймеров описана Debouck и др., (Nucleic Acids Res., 13, 1841-1853 (1985)):

5"- CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3" (последовательность N 24) и

5"- CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3" (последовательность N 25).

Реакционная среда включает, в 25 мкл буфера для полимеразной цепьевой реакции (ПЦР) (Промега, Франция, Шарбоннье): 1,5 мМ MgCl₂; 0,2 мМ dXTP (фармация, Orsay); 0,5 мкмоль праймера; 20 ед./мл Taq-полимеразы (Промега). Реакцию осуществляют согласно следующей последовательности: - 5 минут при 95^oC;

- 30 циклов: 10 секунд при 95^oC

30 секунд при 60^oC

1 минута при 78^oC

- 10 минут при 78^oC.

Амплифицированный фрагмент ДНК длиной 124 пары оснований отделяют путем электрофореза на 3%-ном геле агарозы в присутствии SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, США), затем квантифицируют по отношению к гамме геномной ДНК Ultrapur Е. coli, штамм B (Сигма; обозначение D4889). В образце, введенном в колонку, количество хромосомной ДНК составляло 1%, а в образце, очищенном при использовании колонки с олигонуклеотидом, оно составляет 0,2%.

Пример 3. Эксперимент, проводимый при использовании осветленного лизата

В этом примере описывается очистка плазмидной ДНК, исходя из осветленного лизата бактериальной культуры, в так называемом "минипреп" масштабе:

1,5 мл Ночной культуры штаммов DH5 , содержащих плазмиду pXL2563, центрифугируют и осадок повторно суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ ТРИС-HCl, pH 8, 10 мМ ЭДТК. Добавляют 200 мкл 0,2 М раствора NaOH с 1% додецилсульфата натрия, содержимое пробирок затем перемешивают путем переворачивания, после чего добавляют 150 мкл 3 М раствора ацетата калия, pH 5, и содержимое пробирок перемешивают путем переворачивания. После центрифугирования, супернатант отделяют и вносят в колонку с олигонуклеотидом, подготовленную как описано в примере 1. Фиксация, промывки и элюирование идентичны таковым, описанным в примере 1. Из 1,5 мл культуры получают примерно 1 мкг плазмиды. Полученная плазмида, проанализированная с помощью электрофореза на геле агарозы и окрашивания этидиумбромидом, находится в виде одной полосы кольцевой "сверхзакрученной" ДНК. Никаких следов ДНК с высокой молекулярной массой (хромосомной), ни РНК не обнаруживают в плазмиде, очищенной этим методом. Соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм составляет величину выше 2.

Пример 4

4.1. В этом примере описывается эксперимент по очистке плазмидной ДНК, осуществляемый в тех же условиях, что и в примере 3, исходя из 20 мл бактериальной культуры штаммов DH5, содержащих плазмиду pXL2563. Осадок клеток обрабатывают в 1,5 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 25 мМ ТРИС-HCl, pH 8, 10 мМ ЭДТК. Лизис осуществляют с помощью 2 мл 0,2 М раствора NaOH с 1% додецилсульфата натрия, и нейтрализацию реализуют с помощью 1,5 мл 3 М раствора ацетата калия, pH 5. ДНК затем осаждают с помощью 3 мл пропан-2-ола, осадок после центрифугирования обрабатывают с помощью 0,5 мл раствора, содержащего 0,2 М ацетата натрия, pH 5, 0,1 М хлорида натрия, и загружают в колонку с олигонуклеотидом, подготовленную как описано в примере 1. Фиксацию, промывку колонки и элюирование осуществляют как описано в примере 1, за исключением буфера для промывки, молярность которого по NaCl составляет 0,1 М. Получают около 16 мкг плазмидной ДНК. Полученная плазмида, проанализированная путем электрофореза на геле агарозы и окрашивания этидиумбромидом, находится в виде одной полосы кольцевой "сверхсвернутой" ДНК. Никаких следов ДНК с высокой молекулярной массой (хромосомной), ни РНК в очищенной плазмиде не обнаруживают. Переваривание плазмиды ферментом рестрикции дает одну полосу с ожидаемой молекулярной массой 3 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Концентрация протеинов в образцах снижается от 125 мкг/мл в осветленном лизате до величины менее чем 1 мкг/мл в очищенной плазмиде (анализ Micro-BCA, Pierce). Концентрация эндотоксинов, оцениваемая путем анализа LAL (Biosepra), снижается более чем в 10 раз в очищенной плазмиде по отношению к исходному осветленному лизату.

4.2. Используемая плазмида включает кассету, содержащую промотор цитомегаловируса, кодирующий люциферазу ген, и гомопуриновую-гомопиримидиновую последовательность (GAA)₁₇, происходящую от плазмиды pXL2563. Штамм DHI (Maniatis и др., 1980), содержащий эту плазмиду, культивируют в ферментере емкостью 7 л. Осветленный лизат получают из 200 г клеток: осадок клеток обрабатывают в 2 л раствора, содержащего 25 мМ ТРИС, pH 6,8, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТК, к которым добавляют 2 л 0,2 М раствора NaOH с 1% додецилсульфата натрия. Лизат нейтрализуют путем добавления 1 л 3 М раствора ацетата калия. После диафильтрации 4 мл этого лизата наносят на колонку с 5 мл HiTrap-NHS, связанным с олигонуклеотидом с последовательностью 5"-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3" (последовательность N 1), согласно методу, описанному в примере 1.1. Промывку и элюирование осуществляют как описано в примере 1. Получают около 400 мкг плазмиды. Содержание геномной ДНК в этом образце, определенное по методике, описанной в примере 2.2., составляет 0,1%.

Пример 5: Использование модифицированного олигонуклеотида

В этом примере описывается использование олигонуклеотида, содержащего метилированные цитозины.

Используемой олигонуклеотидной последовательностью является следующая:

5"-GAGG^Me-CTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^Me-CTT3" (последовательность N 12).

Этот олигонуклеотид содержит аминогруппу в 5"^MeC, т.е. означает 5 метилцитозин. Этот олигонуклеотид позволяет очищать плазмиду pXL2563 в условиях примера 1, с помощью буфера для фиксации, pH 5 (таким образом уменьшают опасность разрушения плазмиды).

Пример 6:

В предыдущих примерах используемый олигонуклеотид модифицирован по 5"-концу с помощью аминогруппы, связанной с фосфатом плечом, содержащим 6 атомов углерода: NH₂-(CH₂)₆. В этом примере аминогруппа связана с фосфатом 5"-конца плечом с количеством атомов углерода, равным 12: NH₂-(CH₂)₁₂. Связывание олигонуклеотида и пропускание через колонку осуществляют как указано в примере 2 с помощью буфера Е: 2 М NaCl, 0,2 М ацетата, pH 4,5. Этот олигонуклеотид позволяет достигать лучших эффективностей очистки: получают выход 53%, тогда как при использовании олигонуклеотида с 6 атомами углерода, в тех же условиях, этот выход составляет величину порядка 45%.

Пример 7:

Используя методику клонирования, описанную в примере 1.2, конструируют две другие плазмиды, содержащие гомопуриновые-гомопиримидиновые последовательности: плазмиду pXL-2725, которая содержит последовательность (GGA)₁₅, и плазмиду pXL2726, которая содержит последовательность (GA)₂₅.

7.1. Конструирование плазмид

Плазмиды pXL2725 и pXL2726, аналогичные плазмиде pXL2563, конструируют согласно стратегии клонирования, описанной в примере 1.2., при использовании следующих пар олигонуклеотидов:

5986: 5"-GATCC(GA)₂₅GGG-3" (последовательность N 13);

5987: 5"- AATTCCC(TC)₂₅gG-3" (последовательность N 14);

5981: 5"- GATCC(GGA)₁₇-GG-3" (последовательность N 15);

5982: 5" - AATT(CCT)₁₇CCG-3" (последовательность N 16).

Пару олигонуклеотидов 5986 и 5987 используют для конструирования плазмиды pXL2726, клонируя олигонуклеотиды в сайтах BamHI и EcoRI pBKS⁺ (стратагенная система клонирования; La Jolla CA), тогда как олигонуклеотиды 5981 и 5982 используют для конструирования плазмиды pXL2725. Используют те же самые экспериментальные условия, что и для конструирования плазмиды pXL2563, и заменяют лишь одни пары олигонуклеотидов. Точно также, клонированные последовательности анализируют путем секвенирования в плазмидах. Это позволяет установить, что плазмида pXL2725 обладает модификацией по отношению к ожидаемой последовательности: вместо повторяемой 17 раз последовательности GGA имеется последовательность GGAGA(GGA)₁₅ (последовательность N 17).

7.2.: Получение колонок и очистка

Олигонуклеотиды, образующие тройные спирали с этими гомопуриновыми последовательностями, связывают с содержащимся HiTrap в колонках согласно способу, описанному в примере 1.1. Речь идет об олигонуклеотиде с последовательностью: 5"-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3" (последовательность N 18) для очистки плазмиды pXL2725 и об олигонуклеотиде с последовательностью:

5"-AGCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3" (последовательность N 19) для очистки плазмиды pXL2726.

Таким образом полученные две колонки позволяют очищать соответствующие плазмиды по методике, описанной в примере 2, при использовании следующих буферов:

буфер Е: 2 М NaCl; 0,2 М ацетата, pH 4,5;

буфер Д: 1 М ТРИС-HCl, pH 9; 0,5 мМ ЭДТК.

Полученные выходы составляют 23% и 31% для pXL2725 и pXL2726, соответственно.

Пример 8

Этот пример иллюстрирует влияние длины специфической последовательности плазмиды на эффективности очистки.

8.1. Конструирование плазмид

Геном-репортером, используемым в этих экспериментах для выявления активности композиций согласно изобретению, является ген, кодирующий люциферазу (Luc).

Плазмида pXL2621 включает кассету, содержащую промотор цитомегаловируса (CMV) длиной 661 пара основании, выделенный из pcDHK3 (Инвитроген Корп., Сан Диего, СА) путем расщепления с помощью ферментов рестрикции MIu I и HindIII, клонированную выше кодирующего люциферазу гена, в сайтах MIu I и Hind III, в векторе pGL основного вектора (Промега Корп., Мэдисон, WI). Эту плазмиду конструируют, используя стандартные методы молекулярной биологии.

Плазмиды pXL2727-l и pXL2727-2 конструируют следующим образом:

2 мкг Плазмиды pXL2621 линеаризируют с помощью BamHI; фермент инактивируют путем обработки в течение 10 минут при температуре 65^oC; параллельно, олигонуклеотиды 6006 и 6008 гибридизируют, как это описано для конструирования плазмиды RXL2563.

6006: 5"-GATCT(GAA)₁₇CTGCAGATCT-3" (последовательность N 20);

6008: 5"-GATCAGATCTGCAG(TTC)₁₇A-3" (последовательность N 21).

Эту смесь после гибридизации клонируют по концам BamHI плазмиды pXL2621 и после трансформации в DH5. рекомбинантные клоны определяют путем анализа с помощью ферментативной рестрикции по Pst I, так как олигонуклеотиды вводят сайт Pst I. Получают два клона и нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента контролируют, используя праймер (6282: 5"-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3" (последовательность N 22)) в качестве праймера реакции последовательности (Viera J. и Messing J., 1982. "pUC-Плазмиды в производимой от М13 р7 системе для инсерционного мутагенеза и секвенирования с помощью синтетических универсальных праймеров". Gene, 19, 259-268).

Первый клон (pXL2727-1) содержит повторяющуюся 10 раз последовательность GAA. Второй клон (pXL2727-2) содержит последовательность 5"-GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3" (последовательность N 23).

8.2. Получение колонок и очистка

Используют колонку, такую, как описанная в примере 1 и носитель в которой связан с олигонуклеотидом 5"-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3" (последовательность N 1).

В плазмиде pXL2727-1 14 раз повторяется последовательность GAA. Вышеописанный олигонуклеотид, который насчитывает только 7 повторений последовательности гибридизации, соответствующей CTT, следовательно, может гибридизироваться с плазмидой в 8 различных положения. Плазмида pXL2727-2, напротив, имеет гибридизирующую последовательность (GAA)₇ такой же длины, что и таковая фиксированного в колонке олигонуклеотида. Этот олигонуклеотид, следовательно, может гибридизироваться только в одном положении с pXL2727-2.

Эксперимент идентичен таковому, описанному в примере 2, при использовании следующих буферов:

буфер Е: 2М NaCl; 0,2 М ацетата; pH 4,5;

буфер Д: 1M ТРИС-HCl, pH 9; 0,5 мМ ЭДТК.

Выход после очистки составляет 29% с плазмидой pXL2727-1 и 19% с плазмидой pXL2727-2.

8.3. Трансфекция ин витро клеток млекопитающих

Используемыми клетками являются клетки NIH 3Т3, высеянные накануне эксперимента в культуральные планшеты с 24-мя лунками по 50000 клеток на лунку. Плазмиду разбавляют в 150 мМ растворе NaCl и смешивают с липофектантом RPR 115335. Используют соотношение положительных зарядов липофектанта к отрицательным зарядам ДНК, равное 6.

Смесь интенсивно перемешивают, оставляют на 10 минут при комнатной температуре, разбавляют с помощью среды без плодной телячьей сыворотки, затем добавляют к клеткам ДНК в количестве по 1 мкг на лунку с культурой. После выдерживания в течение двух часов при 37^oC добавляют 10%, в расчете на объем, плодной телячьей сыворотки клетки инкубируют в течение 48 часов при 37^oC в присутствии 5% диоксида углерода. Клетки промывают два раза с помощью ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) и люциферазную активность определяют по описанной методике (набор Промега Корп., Мэдисон, WI) на люминометре Lumat LB 9501 (EG и G Berthold, Evry). Очищенная, как описано в примере 8.2, плазмида pXL2727-1 приводит к в два раза более значительным эффективностям трансфекции, чем таковые, достигаемые при использовании такой же плазмиды, очищенной с помощью набора Wizard Megaprep (Промега Корп., Мэдисон, WI).

Список последовательностей

(1) Общие сведения:

(1) Заявитель:

(а) фирма: Рон-Пуленк Pope

(б) улица: 20 авеню Раймонда Айрона

(в) город: Антони Седекс

(д) страна: Франция

(е) почтовый индекс: 92165

(ж) телефон: 40.91.69.22

(з) телефакс: 40.91.72.91

(II) Название изобретения: Очистка ДНК путем образования тройной спирали с иммобилизованным олигонуклеотидом,

(III) Количество последовательностей: 25

(IV) Редактор на компьютере:

(а) носитель данных: дискета

(б) компьютер: персональный компьютер, совместимый с машинами фирмы ИБМ

(в) операционная система: ПК-ДОС/МС-ДОС

(г) программное обеспечение: патентная редакция

# 1.0,

версия # 1.30 (ОЕВ)

(2) Сведения о последовательности N 1:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 25 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 1:

GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25

(2) Сведения о последовательности N 2:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 2:

CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19

(2) Сведения о последовательности N 3:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 21 пара оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 3:

GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21

(2) Сведения о последовательности N 4:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 13 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 4:

GAAAAAGGAA GAG 13

(2) Сведения о последовательности N 5:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 5:

AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19

(2) Сведения о последовательности N 6:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 6:

AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19

(2) Сведения о последовательности N 7:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 19 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 7:

TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19

(2) Сведения о последовательности N 8:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 8:

AAAAAAGGGA ATAAGGG 17

(2) Сведения о последовательности N 9:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 9:

GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58

(2) Сведения о последовательности N 10:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 10: AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCCTTCTT CTTCTTCC 58

(2) Сведения о последовательности N 11:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 17 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 11:

TGACCGGCAG CAAAATG 17

(2) Сведения о последовательности N 12:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 25 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Отличительный признак:

(г) другая информация: каждый из цитозинов C последовательности метилирован

(XI) Описание последовательности N 12:

GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25

(2) Сведения о последовательности N 13:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 13:

GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG 58

(2) Сведения о последовательности N 14:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 14:

AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG 58

(2) Сведения о последовательности N 15:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 15:

GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG 58

(2) Сведения о последовательности N 16:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 58 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 16:

AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG 58

(2) Сведения о последовательности N 17:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 50 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 17:

GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA 50

(2) Сведения о последовательности N 18:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 25 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 18:

AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT 25

(2) Сведения о последовательности N 19:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 26 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 19:

AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT 26

(2) Сведения о последовательности N 20:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 66 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 20:

GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC 60

AGATCT 66

(2) Сведения о последовательности N 21:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 66 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 21:

GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 60

TCTTCA 66

(2) Сведения о последовательности N 22:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 21 пара оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 22:

ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G 21

(2) Сведения о последовательности N 23:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 39 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 23:

GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 39

(2) Сведения о последовательности N 24:

(1) Сведения о последовательности:

(а) длина: 27 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 24:

CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27

(2) Сведения о последовательности N 25:

(1) Характеристики последовательности:

(а) длина: 27 пар оснований

(б) тип: нуклеотидная

(в) число нитей: однонитевая

(г) конфигурация: линейная

(II) Тип молекулы: кДНК

(XI) Описание последовательности N 25:

CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27.