полинуклеотид, способы получения растений, геном растения, клетки, плоды, семена, способы получения семян, применения олигонуклеотида, плазмида, микроорганизм

Формула изобретения

1. Рекомбинантный полинуклеотид, который может быть использован для получения растения с мужской стерильностью и который содержит а) ингибиторный ген, способный ингибировать экспрессию гена-мишени, присутствующего в указанном растении и кодирующего фермент пути биосинтеза халкона, в) промотор, который является активным в клетках тапетума пыльников указанного растения, включающий фрагмент промотора высокого уровня экспрессии и пыльниковый бокс, имеющий последовательность TNGAGGWGAMRDARWW, где N=A, G, С или Т; W=A или Т; М=А или С; R=A или G; D=A,G или Т, и который операбельно соединен с указанным ингибиторным геном с целью осуществления экспрессии этого ингибиторного гена в пыльниках указанного растения.

2. Рекомбинантный полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что промотор получен из области промотора группы генов, включающей chs-A ген, chi-В ген, chs-J ген и dfr-А ген.

3. Рекомбинантный полинуклеотид по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный ген-мишень кодирует фермент, выбранный из группы, состоящей из циннамат 4-гидроксилазы (СН4; Е.С. 1.14.13.11); 4-кумароил-СоА-лигазы (4CL; Е. С. 6.2.1.12) и халкон-синтазы (CHS; Е.С. 2.3.1.74).

4. Рекомбинантный полинуклеотид по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что ингибиторный ген представляет собой антисмысловой ген.

5. Рекомбинантный полинуклеотид по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что промотор высокого уровня включает фрагмент промотора CaMV 35S и пыльниковый бокс, имеющий последовательность TAGAGGTGACAGAAAT, вставленную в указанный фрагмент в положении -90 по отношению к сайту инициации транскрипции.

6. Способ получения растения с мужской стерильностью, включающий следующие стадии: а) перенос рекомбинантного полинуклеотида по любому из пп.1 - 5 в клетки растения с мужской фертильностью, б) генерирование целых новых растений из клеток, обладающих указанным инсерцированным рекомбинантным полинуклеотидом и в) отбор растения, обладающего мужской стерильностью.

7. Способ получения фертильных семян растения, указанного в п.6, с мужской стерильностью, включающий стадии а) контактирования пестика растения с мужской стерильностью с пыльцой этого же растения с мужской стерильностью в присутствии подходящего флавоноидного соединения; б) проращивания пыльцы на пестике и оплодотворения растения с мужской стерильностью и в) получения семян данного растения.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что пыльца суспендирована в приемлемой для пыльцы среде, содержащей флавоноидное соединение, выбранное из группы, состоящей из мирицетина, кверцитина и кемпферола, в концентрации от 100 нМ до 3 мкМ, а затем осуществляют контактирование пестика растения с мужской стерильностью с пыльцой.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что среда для пыльцы имеет следующий состав: 100 мг/л НЗВО₃, 300 мг/л CaNO₃, 200 мг/л MgSO₄, 100 мг/л KNO₃ и 12,5% сахарозы в стерильной воде.

10. Олигонуклеотид, содержащий последовательность TNGAGGWGAMRDARWW, где N=A, G, С или Т; W=A или Т; М=А или C; R=A или G; D=A,G или Т, для получения растения с мужской стерильностью.

11. Олигонуклеотид по п.10, отличающийся тем, что он включает последовательность, выбранную из группы, содержащей

(a) TAGAGGTGACAGAAAT

(b) TAGAGGTGACAAAAAT

(с) TNGAGGTGACAAAGAT

(d) TAGAGGAGAAGTAATA

где N=A, G,C или Т.

12. Плазмида, включающая последовательность рекомбинантного полинуклеотида по любому из пп.1 - 5.

13. Плазмида по п.12, отличающаяся тем, что она выбрана из группы состоящей из pTS20, pTS21 и pTS22.

14. Плазмида по п.12 или 13, для включения в микроорганизм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к рекомбинантной ДНК, предназначенной, в частности, для использования в генетическом конструировании растений. Кроме того, настоящее изобретение относится к растениям, обладающим нуклеарно мужской стерильностью, обусловленной экспрессией указанной рекомбинантной ДНК; а также к частям указанных растений, которые являются репродуцируемыми либо путем полового размножения, либо путем бесполового размножения, либо тем и другим способом.

Уже давно известно, что семена, полученные в результате перекрестного опыления различных сортов растений одного вида, дают потомство, приспособляемости к внешним условиям и сопротивляемости к болезням по сравнению с семенами, полученными в результате самоопыления. Это явление обычно называют гетерозисом. Поэтому, целью промышленного производства семян обычно является получение гибридных семян многих сельскохозяйственных и садовых культур, поскольку такие семена имеют более высокую коммерческую ценность.

Однако, к сожалению, многие культурные растения имеют мужские и женские репродуктивные органы на одной и той же особи, в которых в значительной степени превалирует самоопыление по сравнению с перекрестным опылением. Поэтому, для получения семян от перекрестного опыления, желательно получить такие акцепторные растения, которые были бы неспособны к самоопылению вследствие отсутствия у них (правильно функционирующей) пыльцы. Такие растения, обладающие мужской стерильностью, или материнские особи затем подвергают перекрестному оплодотворению с использованием растения-донора с мужской фертильностью в целях продуцирования гибридных семян.

Для получения гибридных семян в больших количествах, обычно, растения, имеющие мужскую стерильность, и растения с мужской фертильностью выращивают вместе на полях в целях стимуляции перекрестного опыления, после чего проводят селекцию гибридных семян. В зависимости от типа растений с мужской стерильностью, используемых для перекрестного опыления, селекцию или отделение гибридных семян проводят либо до сбора урожая, т.е., путем уничтожения или удаления растений-доноров с мужской фертильностью, продуцирующих негибридные семена, либо после сбора урожая, например, на основании маркера, такого, как цвет у кукурузы, или на основании другого легко обнаружимого фенотипа. Доурожайная селекция может быть проведена в том случае, когда особи с мужской стерильностью и особи с мужской фертильностью являются легко отличимыми друг от друга, а поэтому особь с мужской фертильностью может быть удалена или уничтожена. Альтернативно, если локус мужской стерильности присоединить непосредственно к селектируемому маркеру (такому, как резистентность к гербициду), то растения с мужской стерильностью, дающие гибридные семена, смогут успешно конкурировать с растениями, имеющими мужскую фертильность, посредством соответствующего давления отбора.

В качестве материнской линии, имеющей мужскую стерильность, используют, например, растения, у которых были физически удалены несозревшие пестики, либо натуральные растения-мутанты с цитоплазматически или нуклеарно кодированной мужской стерильностью. Однако, указанные натурально стерилизованные растения имеют свои недостатки, которые заключаются в трудоемкости их получения, наличии дополнительных нежелательных свойств, трудности в их выращивании и размножении, непредсказуемости наследственности или ограниченной возможности получения натуральных мутантов с мужской стерильностью для коммерчески ценных культурных растений.

Лишь недавно стало известно, что генетически сконструированные растения с нуклеарно кодированной мужской стерильностью могут быть использованы для получения гибридных семян, и что эти растения не имеют, по крайней мере, некоторых из вышеуказанных недостатков большинства натуральных мутантов с мужской стерильностью.

В Международной патентной заявке WO 90/08830 ICI предлагаются способы получения воспроизводимых растений, заключающиеся, главным образом, в экспрессии а) либо гена, кодирующего ингибитор белка, либо b) так называемого летального гена, который, при экспрессии его в мужских цветках, вызывает гибель клеток пыльника и ассоциированных с ним тканей. Например, указанные летальные гены, после их экспрессии, оказывают воздействие на метаболизм митохондрий.

В Международной патентной заявке WO 90/08831 ICI раскрывается ингибирование клеточного дыхания путем экспрессии летального гена, которую осуществляют в целях ингибирования митохондриальной функции, что, в свою очередь, приводит к гибели клеток, в которых экспрессируются указанные гены. Предпочтительными белками гена-дезинтегратора являются: а) несвязывающийся белок (UCP) млекопитающего; b) мутированная форма гена, кодирующая - I-субъединицу F₁-ATP-азы, так, что имеющиеся мутации вызывают неспособность этих субъединиц к сборке в функциональную ATP-синтазу; с) мутированная синтетическая форма гена olil, кодирующего субъединицу 9 F₀-ATP-азы; d) мутированные формы митохондриального транзитного пептида для ингибирования транспорта белка в митохондрии; е) генные конструкции, включая гибриды между дрожжевым геном - -субъединицы (ATP-азы) и геном - -галактозидазы от Е. coil, экспрессия которых приводит к продуцированию разрушающихся гибридных белков. Предпочтительно, если указанная экспрессия в соответствии с описанием вышеуказанной заявки, будет осуществляться под контролем тапетум- или пыльце-специфического промотора.

В Международной патентной заявке WO 89/10396 PGS предлагаются способы, которые, в общих чертах, относятся к получению растений, обладающих мужской стерильностью, путем трансформации нуклеарного генома растения с помощью так называемой ДНК с мужской стерильностью, которая, как считается, кодирует РНК или полипептид, способный ингибировать правильный метаболизм, функционирование, и/или развитие любой клетки тычинки, в которой экспрессируется указанная ДНК с мужской стерильностью, что приводит к гибели любой такой клетки тычинки. Примерами таких ДНК с мужской стерильностью являются ДНК, кодирующие ДНК-азы, РНК-азы, протеазы или ферменты, ответственные за фитогормональный синтез, например, такие, как цитокин. Альтернативно, предлагается отбор ДНК с мужской стерильностью из антисмысловых ДНК, "которые кодируют нить ДНК, комплементарную нити ДНК, естественно транскрибированной к клетках тычинки растения". За исключением гена ТА29, ТА26 и ТА13, все тапетум-специфические гены, происходящие от табака, не дали какого-либо ключа к разгадке того, что конкретно эти гены означают. В статье Колтунова и др., (1990) Koltunow et al., клоны ТА13 и ТА29 были идентифицированы как гены, кодирующие так называемые глицин-обогащенные белки, тогда как клон ТА26 соответствует кДНК пока еще неизвестной природы.

В Европейской патентной заявке ЕР-А-0329308 Palladin Hybrids, предлагается способ получения растений с мужской стерильностью, который заключается в продуцировании генетически трансформированной материнской особи, в основном, путем введения в геном указанного растения рекомбинантных ДНК-последовательностей, включающих в себя антисмысловую ДНК, которая блокирует продуцирование функциональных пыльцевых зерен, либо способствует развитию пыльцевых зерен, восприимчивых к определенному химическому агенту или физиологическому стрессу, который блокирует продуцирование функциональных пыльцевых зерен. Предпочтительно, если указанные антисмысловые гены экспрессируются под контролем пыльца-специфического промотора. В соответствии с описанием указанной заявки, гены, являющиеся критическими в отношении продуцирования функциональных пыльцевых зерен, могут быть выбраны из генов, специфически экспрессированных в микроспорах, предпочтительно в предмейотической стадии. Примерами микроспоро-специфических клонов являются L4 и L19, происходящие от Brassica napus. Кроме общих упоминаний о предмиотических генах и вскользь названных клонах, никаких указаний на природу генов, экспрессия которых должна быть блокирована, в этой заявке не приводится.

В заявке ЕР-А 0335451 под названием "Vereniging voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs" указывается, что ингибирование экспрессии гена (наринген) халконсинтезы у цветущих растений с использованием антисмыслового сконструированного гена приводит к изменению пигментации цветка. В этом эксперименте, этот антисмысловой ген находился под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S. Растения с измененной пигментацией цветков были, однако, способными продуцировать фертильную пыльцу.

Нарингенхалконсинтеза является основным ферментом, ответственным за биосинтез флавоноида. Этот фермент катализирует постадийную конденсацию трех ацетатных остатков из малонил-CoA и одного остатка из 4-коумароил-CoA с образованием нарингенинхалкона (Heller и Hahlbrock, 1980). Изомеризация и последующее замещение этих центральных интермедиатов приводят, в конечном счете, к продуцированию флавоноидов. Флавоноиды являются вторичными метаболитами, которые, как известно, играют ключевую роль в пигментации цветков и плодов. Кроме того, флавоноиды, по всей вероятности, участвуют в защите растения против фитопатогенов (Lamb и др., 1989), и против воздействия УФ-излучения (Schmelzer и др., 1988), а также в индуцировании узлообразования (Long и др. , 1989). Флавоноиды также участвуют в регулировании транспорта ауксина (Jacobs и Oubery, 1988) и резистентности к насекомым (Hedin и Waage, 1986).

Такая многофункциональность флавоноидов требует соответствующей сложной регуляции генов, кодирующих различные ферменты пути метаболизма. Например, экспрессия генов биосинтеза антоцианина является цветко-специфической, светозависимой и эволюционно регулируемой (van Tunen и др., 1988; Koes и др., 1989 г). Однако, экспрессия этих генов в других тканях может быть индуцирована УФ-излучением, что приводит к повреждениям ткани и грибковой атаке (Dixon, 1986; Koes и др., 1989а; Lamb и др., 1989).

Сравнение промотора CHS-A с другими промоторами от генов синтеза флавоноидов, которые являются активными в незрелой ткани пыльника, например, CHS-J, DFR-A и CHI-B, выявило наличие в них строго консервативной области, названной "пыльниковым блоком" (van Tunen и др., 1989). Делекционный анализ промотора CHS-A позволяет предположить, что пыльниковый блок сам по себе не является ответственным за пыльник-специфическую экспрессию, но он может участвовать в регуляции пыльник-специфической экспрессии вместе с другими последовательностями, присутствующими в промоторе CHS-A (vander Meer и др., 1990).

В 1981 году Coe и др. обнаружили, что полноценная на вид белая пыльца не осуществляет свою нормальную функцию в кукурузе, и этот факт позволяет предположить, что синтез или отложение пигмента является жизненно важным для нормальной функции пыльцы. Однако, в этой статье не делается каких-либо выводов об участии флавоноидов в образовании пыльцы, если вообще этот факт не подвергается сомнению, поскольку в последующие годы, как известно, никаких сообщений, свидетельствующих об участии флавоноидов в образовании жизнеспособной пыльцы, зарегистрировано не было.

Пояснения к терминологии

Пыльниковый блок: нуклеотидная последовательность, которая является идентичной, или, по крайней мере, в высокой степени гомологичной любой из последовательностей, изображенных на фиг. 1.

Антисмысловой ген: ген или нуклеотидная последовательность, происходящая от этого гена и имеющая гомологию более чем на 50%, а предпочтительно более чем на 80%, с геном-мишенью, определенным ниже; причем, указанный ген сцеплен с промотором в ориентации, обратной ориентации 5" - 3" по отношению к гену-мишени.

Ген: нуклеотидная последовательность, которая может быть экспрессирована в виде РНК-молекулы и/или полипептида.

Гибридный промотор: промотор, состоящий из нуклеотидных последовательностей или отдельных нуклеотидов, которые в природе не ассоциируются друг с другом или не располагаются в данном порядке.

Ингибиторный ген: ген или антисмысловой ген, экспрессия которого приводит, в конечном счете, к ингибированию экспрессии гена-мишени, определенного ниже.

Промотор: нуклеотидная последовательность, которая способна стимулировать экспрессию гена или антисмыслового гена; либо нуклеотидные последовательности, происходящие от нее; причем, указанная экспрессия осуществляется в виде РНК-молекулы и/или полипептида.

Восстановительный ген: ген, предпочтительно гибридный ген, включающий в себя, по крайней мере, какую-либо нуклеотидную последовательность, которая является достаточно идентичной, аналогичной или гомологичной части гена-мишени, определенного ниже, и способной, после экспрессии, к комплементарной ассоциации с транскриптом, продуцированным ингибиторным геном, определенным выше.

Ген-мишень: ген, экспрессия которого ингибируется надлежащей экспрессией соответствующего ингибиторного гена, определенного выше.

В целях настоящего изобретения, все указания положений оснований даются по отношению к предлагаемому сайту инициации транскрипции соответствующего гена, находящегося под его контролем.

Целью настоящего изобретения является получение растений, которые имеют мужскую стерильность и которые могут быть надежно использованы для продуцирования гибридных семян. Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является получение растений с мужской стерильностью, которые могут быть продуцированы в гомозиготной форме с последующим их использованием для продуцирования экономически выгодных гетерозиготных растений с мужской стерильностью в крупных масштабах.

Настоящее изобретение относится к рекомбинатным полинуклеотидам, которые могут быть использованы для получения растений с мужской стерильностью и которые, в основном, включают в себя: (а) ингибиторный ген, способный ингибировать экспрессию гена-мишени в указанном растении, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе халкона; и (b) промотор, который является активным в пыльниках указанного растения и который при правильном присоединении к указанному ингибиторному гену способствует его экспрессии в пыльниках указанного растения.

В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительный ген-мишень кодирует фермент, выбранный из группы, включающей в себя: циннамат 4-гидроксилазу (C4H; E.C. 1.14.13.11), 4-кумароил-CoA-лигазу (4CL; E.C. 6.2.1.12) и халконсинтазу (CHS; E.C. 2.3.1.74). Особенно предпочтительным геном-мишенью является ген, кодирующий халконсинтазу (CHS) в растении.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, ингибиторным геном является антисмысловой ген, направленный против гена-мишени.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, промотор, который является активным в пыльниках растения, включает в себя фрагмент промотора высокого уровня и пыльниковый блок, получаемый из области промотора группы генов, состоящей из гена chs-A, гена chi-B, гена chs-J и гена dfrA от Petunia. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, промотор высокого уровня включает в себя фрагмент промотора CaMV 35S и пыльниковый блок, имеющий последовательность TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: N 2), вставленную в этот фрагмент в положении - 90 по отношению к сайту инициации транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к способу получения растения с мужской стерильностью, включающему в себя следующие стадии:

(а) перенос рекомбинантного полинуклеотида настоящего изобретения в клетки растения с мужской фертильностью; (b) генерирование целиком новых растений из клеток, содержащих введенный указанный рекомбинантный полинуклеотид; и (c) отбор растений, имеющих мужскую стерильность.

В еще одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантному геному растения, который содержит введенный в него рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения.

Другим предметом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, а именно:

TNGAGGWGAMRDARWW (SEQIDNO: N 1),

где N= A, G, C или T; W=A или T; M=A или C; R=A или G и D = A, G или T, предназначенная для использования в способе получения растения с мужской стерильностью. В еще более предпочтительном своем варианте, настоящее изобретение относится к олигонуклеотидной последовательности, выбранной из следующей группы последовательностей:

(a) TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: N 2)

(b) TAGAGGTGACAAAAAT (SEQIDNO: N 3)

(c) TNGAGGTGACAAAGAT (SEQIDNO: N 4)

(d) TAGAGGAGAAGTAATA (SEQIDNO: N 5)

где N = A, G, C или T, и предназначенной для использования в способе получения растения с мужской стерильностью.

Настоящее изобретение относится также к способу получения оплодотворенных самоопылением семян растений с мужской стерильностью, содержащих введенный в них рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения; при этом, указанный способ включает в себя следующие стадии:

(а) контактирование пестика растения, имеющего мужскую стерильность, с пыльцой от того же самого стерильного растения в присутствии соответствующего флавоноидного соединения;

(b) прорастание пыльцы на указанном пестике и оплодотворение растения с мужской стерильностью и

(с) получение семян от этого растения.

В указанном способе, особенно предпочтительным флавоноидным соединением является соединение, выбранное из группы, содержащей мирицетин, кверцетин и кемпферол, предпочтительно в концентрации порядка от 100 нм до 3 мкМ.

В еще одном предпочтительном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к высокоэффективному в коммерческом отношении продуцированию гибридных семян путем использования больших количеств гетерозиготных растений с мужской стерильностью, которые были получены путем скрещивания гомозиготных растений нужного сорта, имеющих мужскую стерильность, с растениями того же сорта, имеющими мужскую фертильность.

Кроме того, настоящее изобретение относится к гибридным семенам, полученным в результате скрещивания или самоопыления любых растений настоящего изобретения.

Другие предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к плазмидам pTS20, pTS21 и pTS22.

Преимущества и область применения настоящего изобретения будут легко оценены исходя из представленного ниже подробного описания изобретения.

На фиг. 1 показана последовательность пыльникового блока CHS-A, который был вставлен в промотор 35S (CaMV). Ниже представлены другие пыльниковые блоки, происходящие от различных генов биосинтеза флавоноида. Цифры в скобках обозначают относительное положение пыльникового блока по отношению к сайту инициации транскрипции гена инициации репликации.

На фиг. 2 показана диаграмма различных стадий клонирования, используемых для получения химерных GUS-конструкций или химерных антисмысловых CHS-конструкций.

На фиг. 3 схематически показан способ получения гибридных семян с мужской стерильностью; причем, эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания сельскохозяйственных культур, от которых не требуется получение семян или плодов; X - материнская особь; Y - мужская родительская линия; CaMV - промотор вируса мозаики цветной капусты, 35S; AB - пыльниковый блок, вставленный в промотор 35S; CHSas - антисмысловой ген халконсинтазы.

На фиг. 4 схематически показан способ получения гибридных семян с мужской фертильностью; причем, эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания сельскохозяйственных культур, от которых необходимо получить семена или плоды; CHSs-смысловой (нормальный) ген халконсинтазы; все остальные обозначения определены выше (см. фиг. 3).

На фиг. 5 схематически показан способ получения гибридных семян с мужской фертильностью; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культурных растений, от которых необходимо получить семена или плоды; GUSs-ген - глюкуронидазы Е. coli; GUSs и ген CHSas были физически объединены в виде гибридного гена; все остальные обозначения определены выше (см. фиг. 3).

На фиг. 6 схематически показан способ получения гибридных семян, которые индуцируют мужскую фертильность; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культурных растений, от которых необходимо получить семена или плоды; все обозначения определены выше.

На фиг. 7 схематически показан способ получения гибридных семян, которые индуцируют мужскую фертильность; причем эти гибридные семена могут быть использованы для выращивания культурных растений, от которых необходимо получить семена или плоды; NSP-неспецифическая часть восстановительного гена, предназначенная для устранения косуппрессивного действия CHSs-части восстановительного гена; все остальные обозначения определены выше.

Неожиданно было обнаружено, что экспрессия гена-"репортера" бактериальной - глюкуpoнидaзы (GUS) в трансгенных растениях Petunia hybrida, осуществляемая под контролем гибридного промотора, содержащего пыльниковый блок, происходящий от промотора из Petunia hybrida, сшитого с промотором 35S CaMV (далее этот гибридный промотор будет обозначаться промотором AB/CaMV 35S), протекает на значительно более высоком уровне в пыльниках по сравнению с тканями венчика, чем GUS-экспрессия, осуществляемая CaMV- промотором. Кроме того, было отмечено изменение клеточной специфичности, поскольку экспрессия также наблюдалась в клеточном слое тапетума. При использовании промотора 35S, не содержащего пыльниковый блок, указанное изменение не наблюдалось.

Очевидно, пыльниковый блок обладает способностью стимулировать пыльник-специфическую экспрессию, не требуя присутствия дополнительных цис-образующих элементов, которые имеются в гене CHS-A, как ранее предполагалось. Гибридный промотор не является пыльник-специфичным, поскольку экспрессия также наблюдается и в других тканях. Пыльниковый блок обладает способностью к стимулированию экспрессии также в клеточном слое тапетума.

В аналогичном эксперименте, описанном для GUS-гена-репортера, антисмысловой ген CHS (кДНК), происходящий от Petunia, помещали под контроль промотора AB/CaMV 35S, и полученную конструкцию использовали для трансформации гибрида Petunia VR, цветущей пурпурными цветками. После отбора трансформированных растений, в которых была экспрессирована указанная конструкция, и после цветения этих растений, было обнаружено, что пыльники некоторых их этих растений были белыми вместо пурпурных. Такие белые пыльники ни разу не были получены в более ранних экспериментах, в которых антисмысловой ген CHS-A был присоединен к нормальному промотору 35S, контролирующему экспрессию антисмыслового CHS-гена, хотя антисмысловой ген фактически экспрессировался в пыльниках.

Отсюда можно сделать вывод, что блок пыльника, определенный выше, обладает способностью стимулировать экспрессию в клеточном слое тапетума гена (или антисмыслового гена) в тканях пыльника, если этот блок вставлен в сильный промотор, происхождение которого не имеет решающего значения. Более того, было даже установлено, что уровень экспрессии ингибиторного гена в тканях пыльника является достаточно высоким для ингибирования экспрессии гена-мишени в тканях пыльника.

Затем, после попытки осуществления самоопыления трансгенных растений Petunia hybrida, имеющих белые пыльники, было неожиданно установлено, что эти растения обладают абсолютной мужской стерильностью. Существуют природные мутантные линии Petunia, в которых отсутствует функциональная халконизомераза. Халконизомераза участвует в превращении халконов в флавононы, т.е., в одной из стадий пути биосинтеза флавоноида. Известно, что эти растения имеют мужскую фертильность. Отсюда можно сделать вывод, что для того, чтобы получить растения с мужской стерильностью в соответствии с предлагаемым методом, ингибиторный ген должен быть выбран из группы генов, кодирующих ферменты, которые участвуют в пути биосинтеза, приводящего к образованию халкона, поскольку ингибирование этих генов не является летальным для растения в целом.

В других экспериментах, в которых антисмысловой ген CHS-A Petunia помещали под контроль нормального промотора 35S CaMV, было установлено, что антисмысловая CHS-конструкция может быть использована в качестве ингибиторного гена в целях ингибирования экспрессии генов-мишеней также в венчиках табака и картофеля. Это свидетельствует о том, что метод с использованием антисмысловой конструкции также работает в гетерологичных системах, и имеются серьезные основания предполагать, что посредством трансформирования антисмысловым CHS-геном от петунии под контролем AB/35S/промотора могут быть получены растения различных видов, обладающие мужской стерильностью.

Поэтому, новые способы настоящего изобретения предусматривают получение растений с нуклеарно кодированной мужской стерильностью, которые могут быть затем использованы для получения гибридных семян. Для этих целей, растения выбранного сорта генетически трансформируют путем введения в клетки указанных растений одного или нескольких рекомбинантных полинуклеотидов, содержащих один или несколько ингибиторных генов, которые при надлежащей экспрессии в тканях пыльников растения, способны ингибировать экспрессию одного или нескольких ферментов, участвующих в биосинтезе халкона.

В основном, растения с мужской стерильностью получают путем ингибирования экспрессии соответствующего гена-мишени, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез халкона; причем указанное ингибирование осуществляют путем правильной экспрессии ингибированного гена, направленного против указанного гена-мишени. Такими генами-мишенями могут быть любые гены, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе халконов, или их промежуточных предшественников, поскольку ингибирование генов указанной группы не оказывает неблагоприятного воздействия на другие желательные характеристики растений данного сорта. В основном, гены-мишени могут быть выбраны из генов, кодирующих ферменты, которые участвуют в конверсии предшественников халкона, например, такие, как циннамат 4-гидроксилаза (C4H; E.C. 1.14.13.11), предпочтительно 4-кумароил-CoA-лигаза (4CL; E.C. 6.2.1.12), а наиболее предпочтительно халконсинтаза (E. C. 2.3.1.74), которая способствует непосредственному превращению своего субстрата в халкон.

Ингибиторные гены могут быть выбраны из ряда альтернативных генов, включая смысловые и антисмысловые гены, которые более подробно описаны ниже. Подходящие смысловые ингибиторные гены могут, например, кодировать рибозимы, направленные против РНК-продукта гена-мишени; либо моноклональные антитела, направленные против продукта гена- мишени; либо селективные белковые ингибиторы фермента-мишени, если он присутствует. Альтернативно, ингибиторным геном может быть смысловой ген, который, в основном, идентичен гену-мишени и который при надлежащей экспрессии способен ингибировать ген-мишень в соответствии с еще неизвестным механизмом, называемым sense- sense-ингибированием или косуппрессией (Международная патентная заявка WO 90/11682, DNA Plant Technology Inc.).

Предпочтительным ингибиторным геном является антисмысловой ген, направленный против гена-мишени. Антисмысловой ген необязательно должен быть полностью комплементарным гену-мишени, поскольку его длина и гомология являются достаточными для осуществления довольно высокой степени ингибирования. Так, например, антисмысловой ген может быть (частично) комплементарным 5"-концу соответствующего гена-мишени, его 3-концу или срединной части, либо он может быть (частично) комплементарным целому гену-мишени. Понятие "частично комплементарный" означает, что данный антисмысловой ген является не полностью гомологичным гену-мишени, что может быть обусловлено, например, тем, что данный антисмысловой ген является гетерологичным (т.е., полученным из другого источника) по отношению к гену-мишени и т.п. Антисмысловой ген может быть также целиком синтетическим. Выбор антисмыслового гена не является решающим для настоящего изобретения, поскольку уровень гомологии и/или степень комплементарности этого гена являются достаточными для ингибирования экспрессии гена-мишени.

Надлежащая экспрессия ингибиторного гена настоящего изобретения может быть осуществлена путем помещения ингибиторного гена под контроль гибридного промотора, который состоит, по крайней мере, из промотора, являющегося функциональным в растениях и предпочтительно происходящего от промотора высокого уровня, например, РНК 35S CaMV (или его производных), и пыльникового блока, происходящего от гена, экспрессированного в незрелых тканях пыльников растений. Подходящие представители пыльниковых блоков могут быть получены, inter alia, из CHS-A-гена, CHS-J-гена, CHI-В-гена или DFR-A-гена и т.п.

Предпочтительно, если указанный пыльниковый блок вводят в область промотора между -2000 и +1, более предпочтительно между -1000 и +1, а наиболее предпочтительно между -150 и -50. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, пыльниковый блок вводят в промотор CaMV 35S в положение -90.

Выбор растения-источника, из которого получают пыльниковый блок, не является решающим фактором, поскольку этот пыльниковый блок будет нормально функционировать в конечном трансгенном хозяине. При этом, предпочтительно, чтобы используемый пыльниковый блок имел как можно более высокую гомологию с блоками, которые, как известно, в более высокой степени экспрессируются в пыльниках растения-хозяина. Такой пыльниковый блок может быть соответствующим образом синтезирован из известной последовательности пыльникового блока, присутствующего в конечном хозяйском растении, или любом другом растении, происходящем от другого растительного источника, либо полученном другими путями.

Обычно, но необязательно, генетический материал, на котором располагается ингибиторный ген, присоединенный к гибридному промотору согласно настоящему изобретению, в виде либо рекомбинантной ДНК, либо РНК, вводят в растение после рекомбинантного полинуклеотида, либо ДНК, либо РНК, непосредственно связанного с селектируемым или скринируемым признаком, таким, как резистентность к гербициду или антибиотику, в целях возможности осуществления ранней селекции или распознавания трансформированных клеток. Использование такого маркера, однако, является необязательным, поскольку присутствие и экспрессия ингибиторного гена настоящего изобретения могут быть зафиксированы непосредственно при цветении трансгенных растений. Рекомбинантные полинуклеотиды поддерживают или амплифицируют в бактериях в виде плазмид или других репликонов (например, инсертированных в вирусную ДНК или РНК). Альтернативно, рекомбинантные полинуклеотиды могут быть амплифицированы in vitro, например, с помощью полимеразной-цепной реакции (PCR), хорошо известной специалистам в данной области. Однако, конкретный способ, используемый для этих целей, не играет решающего значения в настоящем изобретении.

Введение рекомбинантных полинуклеотидов в растительный материал может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистам в области биотехнологии растений. Способ введения генетического материала в клетки растения-хозяина не имеет большого значения, если только этот способ дает основание ожидать хорошего и предсказуемого результата. При этом необязательно, чтобы этот способ полностью исключал некоторую селекцию при получении конечного результата. Такая селекция неизменно имеет место в практике генной инженерии растений, однако, имеющиеся в распоряжении специалистов конкретные методы избавляют их от ненужного экспериментирования. В качестве иллюстрации может служить, например, трансформация протопластов методами с использованием кальция/полиэтиленгликоля (Krens и др., 1982; Negrutiu и др., 1987), электропорации (Shillito и др., 1985), микроинъекций (Crossway и др., 1986), бомбардировки частицами (покрытыми ДНК или РНК) (Klein и др., 1987), инфицирование вирусами и т. п. Предпочтительной системой для переноса ДНК является бактериальная система типа Agrobacterium. При осуществлении Agrobacterium-технологии, предпочтительно использовать систему так называемых бинарных векторов (Bevan и др., 1984).

Использование подходящего бактериального фона для переноса ДНК в растительные клетки и выбор векторов, соответствующих селективных маркеров, условий инкубирования, культуральных сред и необходимой техники клонирования ДНК могут быть с успехом осуществлены любым специалистом. После селекции и/или скрининга трансформированного растительного материала, из этого трансформированного материала генерируют целые растения, используя методы, широко описанные в литературе (см., например, Horsch и др., 1985). В этих целях могут быть использованы любые растения, которые подвержены трансформации и регенерации.

Сам по себе метод трансформации и/или регенерации растений не имеет решающего значения для настоящего изобретения, если только он обеспечивает введение генетического материала в клетку растения и стабильную интеграцию генетического материала в геноме клетки растения, а также регенерацию растительного материала с образованием побегов и последующим ускорением (или прививкой) и получением целого нового растения. Выбор способа регенерации зависит от типа используемого растительного материала и/или конкретных целей исследователя.

После получения трансформированных растений, они могут быть оценены на наличие нужных свойств и/или на степень выраженности нужных свойств. Сначала может быть проведена оценка уровня экспрессии ингибиторного гена и степени мужской стерильности трансгенных растений. Затем может быть проведена селекция трансгенных растений на стабильное и/или предсказуемое наследование признака мужской стерильности и т.п. После этого, (гетерозиготные) растения с мужской стерильностью могут быть непосредственно использованы для продуцирования гибридных семян, или альтернативно, они могут быть подвергнуты самоопылению сохраненной пыльцой в целях получения гомозиготных растений с мужской стерильностью. Альтернативно, гомозиготные растения с мужской стерильностью могут быть получены путем самоопыления растений с мужской стерильностью жизнеспособной, но стерильной пыльцой (а) путем осуществления контактирования пестика растения, имеющего мужскую стерильность, с пыльцой того же самого стерильного растения в присутствии соответствующего флавоноидного соединения; (b) проращивания пыльцы на пестике и оплодотворения растения с мужской стерильностью; и (c) получения семян растения.

Перед самоопылением материнского растения с мужской стерильностью, незрелая пыльца может быть доведена до созревания в присутствии халконов.

Особенно предпочтительными флавоноидными соединениями являются керсетин, кемпферол и мирицетин. Флавоноидное соединение может быть добавлено в соответствующую среду для пыльцы, такую как "ВК-среда", в конечной концентрации от около 10 нм до 10 мкМ, а предпочтительно от около 100 нМ до 3 мкМ. Оптимальная концентрация может варьироваться в зависимости от соединения и вида и, вероятно, даже от степени ингибирования продуцирования эндогенных флавоноидных соединений в растении с мужской стерильностью. Однако, исходя из указаний, приведенных в данном описании, подходящие концентрации флавоноидов могут быть определены для разных ситуаций без излишнего экспериментирования. Очевидно, что преимущество получения нескольких гомозиготных растений с мужской стерильностью заключается в том, что это дает возможность быстро получать большие количества гетерозиготных семян с мужской стерильностью, которые могут быть непосредственно использованы для крупномасштабного продуцирования гибридных семян.

Настоящее изобретение может быть применено к любому растению, способному к самоопылению и представляющему интерес в отношении продуцирования гибридных семян.

Второй вариант настоящего изобретения относится к способу получения гомозиготных растений с мужской стерильностью путем самоопыления гетерозиготных растений настоящего изобретения пыльцой, развитие которой было "спасено" благодаря временному присутствию халкона в незрелых пыльниках растения, в результате чего было предотвращено ингибирование in vivo синтеза халкона. В одном из осуществлений рассматриваемого варианта настоящего изобретения, предусматривается введение халконов для компенсации их нехватки в результате ингибирования экспрессии гена. Эта компенсация может быть осуществлена несколько иначе, а именно, путем временного стимулирования in vivo продуцирования халконов. Это может быть достигнуто путем введения в дополнение к ингибиторному гену восстановительного гена под контролем индуцибельного промотора для осуществления контроля экспрессии восстановительного гена извне посредством добавления соответствующего индуктора. Предпочтительно, чтобы этим восстановительным геном был, например, гибридный ген, содержащий, по крайней мере, часть гена-мишени и способный, после его экспрессии, ингибировать действие экспрессии антисмыслового гена путем комплементарного связывания с антисмысловым транскриптом (см., напр., Robert и др., 1990).

Как было вкратце показано выше, индуцибельное восстановление фертильности является также необходимым в гибридных культурных растениях, в которых коммерческую ценность представляют семена или плоды. Очевидно, что их мужская стерильность должна быть возвращена для осуществления опыления на полях в целях получения семян и плодов. Такое восстановление может быть, например, стимулировано путем введения индуктора в растение, возделываемое на полях, что приведет к достаточно высокой экспрессии восстановительного гена и тем самым к нейтрализации антисмыслового транскрипта.

В противоположность многим ранее разработанным способам получения растений с нуклеарно кодированной мужской стерильностью, способ настоящего изобретения не предусматривает экспрессию генов, кодирующих продукты, которые являются токсичными по отношению к соматическим клеткам, например, ДНКазы, РНКазы или протеазы. Поэтому, в данном способе нет необходимости в строго эволюционной или тканеспецифической экспрессии, если эта экспрессия происходит в пыльниках.

Растения с мужской стерильностью в соответствии с настоящим изобретением являются в высокой степени стерильными и обладают полной женской фертильностью.

Кроме того, при крупномасштабном производстве гибридных семян на полях или в оранжереях, растения с мужской фертильностью, т.е., предполагаемые самоопылители, могут быть идентифицированы от растений с мужской стерильностью, которые продуцируют гибридные семена, на основании измененной пигментации их пыльников. После этого, самоопылители могут быть отделены или уничтожены, если это необходимо, а их негибридные семена могут быть собраны отдельно.

Другое преимущество способа настоящего изобретения заключается в том, что он позволяет получать гомозиготные растения, имеющие мужскую стерильность, что открывает большие возможности в сохранении и размножении гетерозиготной материнской линии, имеющей мужскую стерильность. Поскольку для целей настоящего изобретения необходимо получить лишь несколько гомозиготных растений, то это ограниченное количество культивировано in vitro с использованием стандартной техники. Гомозиготную линию с мужской стерильностью подвергают перекрестному опылению с использованием родительской линии, обладающей мужской фертильностью, после чего полученные гетерозиготные семена с мужской стерильностью используют для крупномасштабного продуцирования на полях гибридных культурных растений. Из полученных гибридных семян 50% будут иметь мужскую стерильность, а 50% - мужскую фертильность. В случае, если это отношение окажется недостаточным для получения высоких урожаев коммерческих культур (например, семян или плодов) путем самоопыления, то это соотношение может быть улучшено путем частичного восстановления мужской стерильности путем введения индуктора для активации экспрессии восстановительного гена.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ДНК-методология

Выделение, субклонирование, рестрикционный анализ и секвентирование осуществляли с использованием стандартных процедур, хорошо известных специалистам (см., например, Маниатис и др., 1982). Выделение ДНК из отдельных трансформантов петунии и анализ ДНК методом блоттинга в геле осуществляли в соответствии с описанием Koes и др., 1987.

Экстракция GUS и флуорометрический и гистохимический анализы GUS

От трансгенных растений собирали свежий материал и использовали для GUS-анализа. Экстракции GUS осуществляли в соответствии с описанием Jefferson и др. , (1987), при этом, ткань измельчали с жидким N₂ и Dowex-1 (Sigma). Флуорометрические измерения активности GUS проводили согласно описанию Jefferson и др., (1987). В величины, полученные в результате измерения, вносили поправку за гашение флуоресценции экстракта путем измерения увеличения флуоресценции после добавления известного количества 4- метилумбеллиферила. Концентрацию белков определяли с помощью анализа белка Bio-Rad, используя в качестве стандарта альбумин бычьей сыворотки.

Гистохимическую локализацию GUS-активности определяли в соответствии с описанием Koes и др., (1990). Перед окрашиванием, пыльники разрезали надвое острием бритвы. Для устранения фоновой GUS-активности в пыльниках использовали окрашивающий раствор X-gluc (pH 8,0).

Для исключения артефактов, которые могут возникнуть вследствие разницы размеров клеток, проникновения субстрата в ткань и фоновой активности фермента, гистохимический анализ осуществляли повторно на пыльниках трансгенных и нетрансформированных растений. Для анализа на уровнях одиночных клеток, X-gluc-окрашенные ткани фиксировали и заливали в парафин в соответствии с описанием Koes и др. (1990). Используя микротом, получали срезы с толщиной 7 мкм, и фотографировали эти срезы с помощью автоматического оптического микроскопа.

Обнаружение флавоноидов

Пыльники от десяти бутонов инкубировали в 1 мл 2М HCl в течение 16 часов, и после гидролиза (20 минут при 100^oC), флавоноиды экстрагировали в малом объеме изоамилового спирта и отделяли на TCL-чашках с целлюлозой, используя в качестве элюента смесь уксусной кислоты, соляной кислоты и воды (30:3:10).

Выделение РНК и защита РНКазы

Пыльники от 5-7 бутонов (размером 40-50 мм) использовали для выделения РНК в соответствии с описанием Koes и др., (1989). Эндогенную мРНК CHS обнаруживали с помощью анализа на защиту РНКазы, который проводили в соответствии с описанием van Tunen и др, (1988), используя полную кДНК CHS (А), клонированную в pTZ18U в качестве зонда (Koes и др., 1989).

Прорастание пыльцы in vitro

Растения выращивали при 18-22^oC в стандартных условиях теплицы. Пыльцу собирали с цветков и проращивали на отвержденной среде, содержащей 3 мМ H₃BO₃ 1,7 мМ Ca(NO₃)₂, 10% сахарозу, 0,7% агар, pH 5,8. После этого пыльцу инкубировали 2 часа при 24^oC в темном помещении и окрашивали 1% ацетокармином в соответствии с описанием Bino и др., (1987).

ПРИМЕРЫ.

I. Конструирование химерных GUS-генов

Химерные GUS-конструкции получали путем клонирования GUS-кодирующей области pRAJ 275 (Jefferson и др., 1987) в качестве EcoR/Hind III-фрагмента, затупленного полимеразой Кленова, в SmaI-сайте VIP122, который содержит CHS (A)-конец (van der Meer и др., 1990), с получением в результате pTS18. Клон pTS18 лигировали в плазмиду pTZ18R (Promega) в качестве Sall/Hind III-фрагмента, в результате чего получали pTS19. CaMV 35S промотор от VIP102 (van der Krol и др., 1988), переваренный EcoRI и BamHI, вставляли в pTS19, разрезанную EcoRI и BamHI, и получали в результате pTS23 (см., также фиг. 2). Олигонуклеотиды 5"-GAGCTCTAGAGGTGACAGAAATCTGCAG-3" (SEQIDNO N 6) и 5"-CTGCAGATTTCTGTCACCTCTAGAGCTC-3" (SEQIDNO N 7) гибридизировали друг с другом, 5"-фосфорилировали с использованием киназы Т4, клонировали в pTS23, переваренную EcoRV, и получали pTS24. Ориентацию инсертированного пыльникового блока определяли путем частичного переваривания одного из двух рестрикционных сайтов, фланкирующих пыльниковый блох, с последующим исследованием меченных по концам фрагментов на секвенирующем геле. Все химерные GUS-конструкции были инсертированы в качестве EcoRI/Hind III в бинарный вектор Вin 19 (Bevan, 1984).

II. Конструирование химерных антисмысловых генов CHS

Аналогичный синтетический пыльниковый блок также клонировали в EcoRV-сайт в промоторе CaMV VIP102, содержащем конструкцию CaMV- antisense-CHS(A)-nos; van der Krol и др., 1988. Ориентацию и число клонированных пыльниковых блоков определяли в соответствии с описанием, проведенным в примере 1. В растения петуньи были введены следующие конструкции anti-sense-CHS(A): pTS20 (с одним пыльниковым блоком в нормальной ориентации), pTS21 (с двумя копиями пыльникового блока в обратной ориентации) и pTS22 (с восемью копиями пыльникового блока в нормальной ориентации). Все химерные antisense-CHS(A)-конструкции были инсертированы в качестве EcoRI/HindIII-фрагментов в бинарный вектор Bin 19 (Bevan, 1984).

III. Трансформация растений Petunia

Бинарные векторы, содержащие GUS-конструкции (pTS23, содержащую нормальный промотор CaMV 35S); (pTS24, содержащую гибридный AB/CaMV 35S-промотор) или antisense-CHS (A)-конструкции (pTS20, pTS21, pTS22) переносили из JM83 E. coli (Messing, 1978) в штамм LBA 4404 agrobacterium tumefaciens (Hoekema, и др., 1983) путем скрещивания трех родителей (Rogers и др., 1986), используя штамм, содержащий плазмиду pRK2013 (Ditta и др., 1980). Для трансформации дисков листьев Petunia hybrida использовали эксконьюганты в соответствии с описанием Horsch и др. (1985). Диски листьев получали из верхних листьев молодых нецветущих растений. В экспериментах по трансформации с GUS-конструкциями использовали Petunia hybrida, сорт W115, antisense-CHS (A)-конструкциями использовали сорт VR Petunia hybrida. После индукции стебля и корней на канамицин- содержащей среде, растения высаживали в почву и переносили в теплицу. Растения, регенерированные (на среде, не содержащей канамицин) из дисков листьев, обработанных штаммом LBA4404, не содержащим бинарного вектора, использовали в качестве контрольных.

IV. Анализ трансгенных растений, экспрессирующих GUS-конструкции

Для изучения влияния пыльникового блока на регуляцию экспрессии гена, трансгенные растения, несущие GUS-конструкции, анализировали на характер экспрессии в соответствии с методом, описанным в Экспериментальной части.

Было проанализировано около 25 независимых трансгенных растений петунии, содержащих AB/CaMV 35S-GUS-конструкцию. Поскольку уровень экспрессии введенного гена может быть разным у независимых трансформантов благодаря так называемому эффекту положения (Weising и др., 1988), то при измерении активности, обнаруживаемой в пыльниках, для каждого отдельного трансформанта, использовали в качестве внутреннего стандарта GUS-активность экзогенного гена в венчиках. Среднее отношение (т.е., от всех растений, вместе взятых) для растений, содержащих конструкцию гибридного промотора, было выше, чем среднее отношение для контрольной промоторной конструкции. Для проверки значимости полученного результата, все отдельные измерения были проанализированы с помощью рангового критерия Wilcoxon. При < 0,05, активность GUS в пыльниках по сравнению с венчиками была значительно выше в трансформантах, содержащих конструкцию AB/CaMV 35S-промотор GUS, чем в трансформантах, содержащих контрольную CaMV-конструкцию. Присутствие пыльникового блока способствует 3-кратному усилению CaMV-GUS-активности в пыльниках по сравнению с активностью в венчиках.

Для того чтобы определить, изменяется ли количественно экспрессия в пыльниках в результате инсерции последовательности пыльникового блока, клеточно-специфическую GUS-экспрессию контролировали с помощью гистохимического анализа (см. Экспериментальную часть). В поперечных срезах пыльники петунии (от внутренней части к внешней) содержали сосудистый цилиндр, окруженный паренхиматозными клетками связника, четыре гнезда, содержащих спорогенную ткань (пыльцу), и эндотеций. Каждое гнездо окружено слоем специфических клеток (тапетум), которые осуществляют питание спорогенных клеток. В конечной стадии развития пыльника, гнезда у стенок микроспорангий разрушаются и пыльцевые зерна высвобождаются.

Поперечные срезы пыльников различных независимых CaMV-GUS трансформантов инкубировали с GUS-субстратом X-gluc, в результате чего почти у всех типов клеток пыльника наблюдалась ярко-синяя окраска, свидетельствующая о GUS-активности. GUS-активность, управляемая CaMV-промотором, наблюдалась в сосудистом цилиндре, связнике и эндотеции, но не наблюдалась в клетках тапетума. Окрашивания не наблюдалось в пыльниках нетрансформированных контрольных растений при pH 8,0. Если pH окрашивающего буфера снижали до 7, то фоновое окрашивание можно было наблюдать в нетрансформированных тканях пыльника, а поэтому, все эксперименты по окрашиванию осуществляли при pH 8,0. Анилиз CaMV-GUS-трансформированных пыльников на уровне одиночных клеток показал, что CaMV-GUS-трансформированные пыльники обнаруживали осаждение в виде голубого осадка для всех типов клеток за исключением клеток тапетума. Гистохимический анализ множества независимых трансформантов, экспрессирующих гены GUS под контролем AB/CaMV 35S-промотора, показал небольшое различие характера GUS- окрашивания по сравнению с нормальным CaMV-GUS-экспрессорами. Помимо характера окрашивания для нормальных CaMV-GUS наблюдалось явное синее окрашивание клеток тапетума. Этот синий осадок клеток тапетума был даже больше заметен при уровне одиночных клеток. Как флуорометрический, так и гистохимический анализ GUS подтвердили явное влияние инсерции пыльникового блока в CaMV-промотор не только на уровень GUS-экспрессии, но также и на клеточную типоспецифичность GUS-экспрессии, управляемой указанным гибридным промотором.

V. Анализ трансгенных растений, экспрессирующих CHS(A)-конструкции

В целом, получали 35 независимых трансформантов петунии (гибрид VR), из которых у 5 растений были получены цветки с пониженной пигментацией пыльника. Какой-либо корреляции между ингибированием пигментации венчика и ингибированием пигментации пыльника обнаружено не было. Наблюдались любые комбинации пигментированных или непигментированных пыльников с нормально пигментированными венчиками или с венчиками, имеющими пониженную пигментацию. Со всеми тремя конструкциями, использованными для трансформации (т.е., pTS 20, pTS21; pTS22), были получены белые пыльники. Поэтому, ингибирование пыльников, по-видимому, не зависит от числа и ориентации инсертированных блоков. В результате трансформации гибридной петунии VR с помощью pTS20-конструкции (одна копия пыльникового блока в нормальной ориентации) получали 11 независимых трансгенных растений, из которых 5 растений имели нормальный фенотип, 5 растений имели пониженную пигментацию венчика, а одно растение имело цветки с окрашенными венчиками и белыми пыльниками. В результате трансформации с помощью pTS21 (две копии пыльникового блока в обратной ориентации) получали 15 независимых трансформантов, из которых 9 растений не обнаруживали изменений, 5 растений имели цветки с пониженной пигментацией венчика, из которых 2 растения имели также белые пыльники; и один трансформант имел нормально окрашенные цветки с белыми пыльниками. Из 9 независимых трансформантов, содержащих pTS22 (с 8 копиями пыльникового блока в нормальной ориентации), 7 растений имели фенотип дикого типа; одно растение имело цветки с пониженной пигментацией венчика, и одно растение имело цветки с белыми пыльниками и нормально окрашенными венчиками.

Для того чтобы определить, происходит ли снижение пигментации пыльников в результате снижения уровня мРНК CHS в пыльниках, полную ДНК выделяли из белых пыльников и пыльников, окрашенных в пурпурный цвет, и анализировали методом защиты РНКазы. В этом анализе, где в качестве зонда использовали ³²P-меченную антисмысловую РНК V30-CHS, эндогенные транскрипты VR CHS разрезали на 4 субфрагмента. При этом было обнаружено, что ингибирование пигментации пыльника сопровождается специфическим снижением устойчивого уровня мРНК CHS в пыльниках.

В процессе аутоскрещивания трансгенных растений для анализа групп сцепления стало очевидно, что белая пыльца является стерильной. После самоопыления трансформантов с непигментированными пыльниками, получить зрелые и полноценные на вид семена не удавалось. А те немногие случайно сформировавшиеся семена, которые были получены в результате этого самоопыления, не прорастали.

Для того чтобы определить, на какой стадии развития пыльника (или пыльцы) белые пыльцевые зерна начинают дегенерировать, поперечные срезы белых пыльников и пыльцы на различных стадиях развития анализировали под микроскопом. Этот анализ показал, что развитие белых пыльников не слишком сильно отклоняется от нормального развития пыльника петунии. Однако, пыльцевые зерна прекращают свое развитие после тетрады, т.е., на ранней стадии микроспоры. Анализ in vitro- прорастания пыльцы, происходящей от белых пыльников, показал, что при этом пыльцевые трубки не образуются.

Эта ранняя стадия прорастания пыльцы совпадает с началом экспрессии гена флавоноида. Полученные данные позволяют предположить, что флавоноиды участвуют в развитии пыльцы на ранней стадии образования двойного ядра. Отсюда можно сделать вывод, что "спасение" развития пыльцы, т.е., индуцирование синтеза восстановительного гена, должно начинаться на этой стадии.

Для того чтобы в этом убедиться, трансформанты с мужской стерильностью от материала F1, имеющие белые пыльники, опыляли пыльцой петунии сорта V30. Растения с мужской стерильностью имели абсолютную женскую фертильность.

Анализ потомства первичных трансформантов показал, что веденные признаки являются стабильными и могут наследоваться потомством предсказуемым образом. Стерильный трансформант с белой пыльцой скрещивали с Petunia hybrida (V30) и F1-потомством, анализировали на фенотип "с белой пыльцой" и на наличие вставки методом Саузерн-блоттинга. ДНК, экстрагированная из листьев нескольких растений потомства, и Саузерн-блот-анализ показали полную косогрегацию антисмыслового фенотипа со вставкой.

Пример

Самоопыление растений, имеющих мужскую стерильность

Пыльцу стерильной петунии брали от растений, умеренно экспрессирующих антисмысловую chs, и использовали для самоопыления в сочетании с флавонолами керцетином, кемпферолом или мирицетином. Эти растения отбирали исходя из наличия в них небольшого количества (менее 1%) жизнеспособной незрелой пыльцы. Эту пыльцу доводили до зрелости in vitro. Стерильную пыльцу помещали в нормальную среду для пыльцы (ВК-среда: 100 мг/л H₃BO₃, 300 мг/л CaNO₃, 200 мг/л MgSO₄, 100 мг/л KNO₃, 12,5% сахарозы в стерильной воде), дополненную керцетином, мирицетином или кемпферолом до конечной концентрации от около 100 нМ до 3 мкМ, после чего ее наносили пипеткой на пестики материнских растений с мужской стерильностью.

Концентрации флавоноидных соединений в указанных выше пределах были эффективными, однако, оптимальной концентрации не приводится из тех соображений, что она в значительной степени зависит от отдельного конкретного используемого растения с мужской стерильностью. Этот факт, вероятно, может быть объяснен тем, что некоторые анти-chs-растения все же продуцируют небольшое количество халконсинтазы, которое, очевидно, зависит от концентрации флавоноидных соединений, присутствующих в репродуктивных органах.

После опыления, растения наблюдали, а семена собирали. Из нормально проросших семян были получены взрослые растения.

После попытки самоопыления этих растений было обнаружено, что они еще имеют мужскую стерильность. Эти растения могут быть использованы в качестве гомозиготных материнских растений для скрещивания с донором, имеющим мужскую фертильность, в целях быстрого получения больших количеств гетерозиготных растений, обладающих мужской фертильностью, для продуцирования гибридных семян.

Предполагается, что поскольку соединениями, используемыми для преодоления стерильности пыльцы, являются флавонолы, присутствующие во многих растениях, то экстракты, например, пестиков, тканей венчиков и вероятно пыльцы, стерилизованной посредством облучения, которые были получены от нормальных растений, также могут быть использованы в качестве дополнительной пыльцы, происходящей от растения с мужской стерильностью согласно настоящему изобретению.