способ получения биомассы энтомопатогенных нематод

Формула изобретения

Способ получения биомассы энтомопатогенных нематод, включающий нанесение искусственной питательной среды на инертный носитель, инокуляцию чистой культуры симбиотических бактерий и моноксенной культуры инвазионных личинок нематод в питательную среду, выращивание нематод и выделение биомассы инвазионных личинок из носителя, отличающийся тем, что инокуляцию нематод и бактерий в питательную среду проводят одновременно и с дополнительным внесением адаптогена, в качестве которого использован дибазол в концентрации 110^-9 г/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения биомассы энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.

Известен способ получения биомассы энтомопатогенных нематод, который заключается в том, что компоненты питательной среды - яичный порошок, дрожжи, кукурузное масло, соевую муку и воду смешивают, помещают в ферментер и стерилизуют. В охлажденную смесь инокулируют предварительно размноженную на питательном бульоне в другом ферментере жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часового выращивания бактерий в питательную среду инокулируют предварительно простерилизованную моноксенную культуру инвазионных личинок нематод. Зрелую биомассу нематод после завершения цикла развития отделяют от остатков питательной среды с помощью центрифугирования (1).

В качестве недостатков культивирования нематод в жидкой питательной среде в ферментерах следует отметить следующие: длительный срок развития нематод - до 60 дней; низкий выход биомассы, не превышающий 10⁶ инвазионных личинок с 1 мл питательной среды; большая энергоемкость процесса культивирования.

Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ, включающий получение биомассы нематод с использованием полужидких питательных сред, состоящих из следующих компонентных составов: а) куриные потроха, говяжий жир и вода; б) куриные яйца, кукурузная мука, растительное масло, дрожжевой экстракт и вода (2). Гомогенатом питательной среды пропитывают поролоновую крошку, в которую после стерилизации инокулируют симбиотических бактерий. Бактерии размножают при температуре 25-30^oC в течение 2-3 суток, затем в емкость со средой с бактериями инокулируют моноксенную культуру нематод.

Недостатки прототипа определяются наличием двух разновременных операций, проводимых с одними и теми же емкостями с питательной средой в стерильных условиях - сначала инокулируют в питательную среду бактерий, а затем нематод. И кроме того, при таком способе размножения нематод с 1 г питательной среды получают невысокий выход биомассы этих паразитов (не более 450 тысяч), что существенно отражается на эффективности всего процесса производства и себестоимости продукта.

Задача, решаемая изобретением, - повышение выхода биомассы энтомопатогенных нематод и снижение себестоимости конечного продукта.

Предлагаемый способ заключается в том, что микроорганизмы, в частности, энтомопатогенные нематоды и их симбиотические бактерии выращивают в емкостях с естественной аэрацией на твердом инертном носителе - поролоновой крошке (объем кусочков поролоновой крошки - 1-6 см), пропитанной гомогенатом искусственной питательной среды, состоящей из следующих компонентов: соевая мука - 16%, растительное масло (кукурузное, рапсовое, подсолнечное) - 5%, пивные дрожжи - 1%, вода - 50%, поролоновая крошка - 8% с дополнительным внесением адаптогена - дибазола (2-бензил-бензимидазол) в концентрации 1 10^-9 г/мл искусственной питательной среды при одновременной инокуляции в питательную среду симбиотических бактерий и моноксенной культуры инвазионных личинок нематод. Добавление дибазола в питательную среду способствует повышению резистентности организмов к неблагоприятным условиям культивирования, отличающимся от условий развития нематод в насекомых.

Первоначальный процесс культивирования начинают с приготовления чистой культуры симбиотических бактерий и моноксенной культуры (т.е. культуры инвазионных личинок нематод, с одним видом бактерий - симбиотических) нематод. Чистую культуру симбиотических бактерий получают путем заражения нематодами гусениц большой вощинной моли (Galleria mellonella L.), спустя 24 часа в стерильных условиях отбирают бактерии, содержащиеся в гемолимфе насекомых, и переносят их в чашки Петри с питательным агаром (дрожжевой экстракт - 10 г, декстроза - 5 г, CaCO₃ - 20 г, агар - 15 г, вода - 1 л). После суточной инкубации при температуре 25-30^oC отбирают колонии бактерий и инокулируют их в колбы с МПБ, которые помещают на качалку на 2 суток при температуре 25-30^oC. Моноксенную культуру нематод получают путем стерилизации инвазионных личинок нематод в 0,1% растворе мертиолата в течение 30 минут, затем их переносят в свежий 0,1% раствор мертиолата и держат 3 часа, после чего личинок трижды промывают в стерильной воде и переносят в чашки Петри на питательный агар с двухсуточной культурой симбиотических бактерий и инкубируют при 25-28^oC. Когда размножение нематод прекращается (обычно спустя 20- 30 суток), полученную моноксенную культуру нематод используют для размножения их на искусственной питательной среде. В производственных условиях чистые субкультуры симбиотических бактерий хранят на питательном агаре при температуре 12^oC и проверяют их на чистоту ежемесячно. Эти культуры используют затем в процессе производства, а моноксенную культуру нематод берут из емкостей, в которых нематоды завершили цикл развития из расчета 1 г поролоновой крошки с нематодами на 10 г поролоновой крошки с питательной средой. В процессе производства искусственную питательную среду смешивают в отдельной емкости (соевую муку, яичный порошок, растительное масло, пивные дрожжи, воду). Полученной гомогенной массой пропитывают поролоновую крошку, которую затем помещают в емкости и автоклавируют при температуре 121^oC и давлении 1 атм в течение 30 минут. В охлажденную питательную смесь в стерильных условиях инокулируют, в расчете на 1 г среды, жидкую двухсуточную культуру симбиотических бактерий (12,1 10⁷ бактериальных клеток) и моноксенную культуру нематод (50 тыс. инвазионных личинок). Емкости с питательной средой инкубируют в течение 20-30 дней при температуре 20-28^oC. Зрелую культуру нематод выделяют из инертного носителя в воде путем вымывания и последующей концентрации инвазионных личинок с помощью гидроциклона и центрифуги. Подсчетом нематод в определенном объеме осадка определяют численность нематод перед закладкой их на хранение.

Пример 1.

Получение биомассы нематод вида Steinernema carpocapsae штамм "agriotos" проводили в стеклянных колбах объемом 700 см³ на питательной среде, содержащей: соевая мука - 16%, яичный порошок - 20%, кукурузное масло - 5%, пивные дрожжи - 1%, поролоновая крошка - 8%, вода - 50% с добавлением дибазола в концентрациях 1 10^-7 г/мл, 1 10^-9 г/мл и 1 10^-11 г/мл. Общая масса среды в колбе составляла 70 г. После стерилизации и охлаждения в среду инокулировали микроорганизмы одновременно. В одном контрольном опыте микроорганизмы инокулировали в среду раздельно, сначала симбиотических бактерий вида Xenorhabdus nematophilus, а затем после 48-часовой инкубации среды с бактериями при температуре 25^oC дополнительно в среду инокулировали моноксенных личинок нематод. В другом контрольном опыте микроорганизмы инокулировали в среду одновременно. Колбы с питательной средой и микроорганизмами содержали в темноте при температуре 25^oC в течение 20 дней. Зрелую культуру нематод выделяли вымыванием из поролоновой крошки и подсчитывали количество нематод в полученной водной суспензии инвазионных личинок в опытных и контрольных вариантах с одновременным определением их инвазионной (энтомопатогенной) активности по показателю LD₅₀ для тест-насекомых (3).

Выход биомассы нематод при добавлении дибазола в концентрации 1 10^-9 г/мл составил 920,0 тыс. инвазионных личинок с 1 г питательной среды, в контрольном опыте при совместной инокуляции микроорганизмов, соответственно, 646,6 тыс. нематод и в другом контрольном опыте при раздельной инокуляции получено 720,0 тыс. нематод с 1 г среды. С увеличением и уменьшением концентрации дибазола от оптимальной (1 10^-9 г/мл) выход биомассы снижался (Таблица 1). При этом наилучший показатель инвазионной (энтомопатогенной) активности нематод (LD₅₀ = 22,0 2,7) - был в варианте с добавлением дибазола к питательной среде в концентрации 1 10^-9 г/мл (Таблица 2). С увеличением и уменьшением концентрации дибазола инвазионная активность нематод снижалась. В вариантах без дибазола при раздельном и совместном внесении микроорганизмов в питательную среду показатели LD₅₀ так же были значительно ниже, соответственно, 35,1 4,7 и 38,3 4,5.

Таким образом, наилучшие результаты по выходу биомассы нематод и их инвазионной (энтомопатогенной) активности получены при добавлении к питательной среде дибазола в концентрации 1 10^-9 г/мл. При этом выход биомассы с 1 г питательной среды за счет применения дибазола и одновременной инокуляции микроорганизмов в питательную среду повышается на 42,3%, что свидетельствует о возможности сокращения трудоемкой операции в процессе производства, связанной с инокуляцией двух микроорганизмов в питательную среду, и тем самым достигается существенное повышение производительности труда, а в целом за счет применения нового способа культивирования достигается увеличение выхода биомассы нематод и значительное снижение себестоимости биомассы нематодных препаратов.

Источники

1. Surrey M.R., R.J. Davies (1996). Pilot-scale liquid culture and harvesting of an entomopathogenic nematode, Heterorhabditis bacteriophora. J. Invertebrate Pathologi, Vol.67, N 1, pp. 92-99.

2. Bedding R. A. , M.S. Stanfield, G.W. Crompton (1991). Apparatus fad Method for Rearing Nematodes, Fungi, Tissue Cultures and The Like, and For Harvesting Nematodes. Internacional Patent Application N PCT/AU91/ 00136 48 pp.

3. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978, 7 стр.