способ подготовки нейроаллотрансплантата, используемого в нейропластике

Формула изобретения

1. Способ подготовки нейроаллотрансплантата, используемого при нейропластике, предусматривающий предварительное помещение его в химически инертную среду и последующее очищение эндоневральных трубок от продуктов деградации миелина и нейролеммоцитов, отличающийся тем, что очищение эндоневральных трубок заключается в биологическом воздействии на аллотрансплантат путем помещения его в сальник реципиента на 3 - 7 суток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химически инертной среды используют среду - 199.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к хирургии, более конкретно к нейрохирургии, и может найти широкое применение при нейропластике для восстановления дефектов, повреждений периферических нервов.

Основными факторами, препятствующими регенерации поврежденных нервов через трансплантат, являются тканевая несовместимость с реципиентом, отторжение и рубцевание в области пересадки.

Свежие аллотрансплантаты не могут служить приемлемым решением из-за отторжения трансплантата и заболеваемости вследствии подавления иммунитета. Объектом отторжения в периферических нервах являются в основном клетки и миелиновые оболочки, поскольку клеточные мембраны содержат антигены основного комплекса гистосовместимости.

Исследователями предпринимались многочисленные попытки удалить клеточный компонент нервных аллотрансплантатов, чтобы уничтожить их иммуногенность.

Известен способ подготовки нейроаллотрансплантата, используемого в нейропластике, предусматривающий замораживание, а затем размораживание нервного трансплантата (см. статью Чарльза Е.Дюмонта и др. "Увеличение роста аксонов при использовании очищенного детергентом нервного трансплантата", журнал "Transplantation", Vol. 63, p. 1210-1215, N 9, May, 1997, Copyright 1997, by Williams, & Wilkins).

Однако данная методика с успехом применяется только там, где требуется пересадка нерва незначительной длины.

При этом, нейротрансплантаты, которые были заморожены, а затем разморожены, по всей видимости, не могут считаться подходящими для приготовления нервных аллотрансплантатов для людей, поскольку они требуют предегенерации "in vivo".

Кроме того, нейроаллотрансплантаты после замораживания и последующего размораживания обладают низкой проницаемостью для клеток Шванна, что ухудшает эффективность последующей нейропластики.

Известен способ подготовки нейроаллотрансплантата, используемого при нейропластике, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий помещение его в химически инертную среду и последующее очищение эндоневральных трубок от продуктов деградации миелина и нейролеммоцитов (см. статью Чарльза Е.Дюмона и др. "Увеличение роста аксонов при использовании очищенного детергентом нервного трансплантата", журнал "Transplantation", Vol. 63, p. 1210-1215, N 9, May 1997, Copyright, 1997, by Williams & Wilkins).

Данный способ предусматривает следующее.

Под действием наркоза с обеих сторон удаляют большеберцовый и смежный с ним седалищный нервы. Сегменты нерва вначале погружают в химически инертную среду - в свободную от кальция и магнезии фосфат-буферную соль (КМС-ФБС), содержащую 0,05% азида натрия, pH 7,3 в течение 5 дней при температуре 4^oC. Затем еще на 4 дня трансплантаты при комнатной температуре помещают в 0,7%-ный раствор лизофосфатидилколина (L-a-лизофосфатидилколин, тип I) в 0,1 М буферного раствора на основе фосфата натрия, pH 7,0, содержащего 0,05% азида натрия и смесь протеазиновых ингибиторов (0,1 мг/мл апротеин, 0,5 мг/мл леупептин, 0,6 мг/мл пепстатин A). Раствор меняется каждые 24 часа. В последние две ванны добавляется хлорид кальция так, чтобы окончательная концентрация CaCl₂ составила 10 мМ.

Извлеченные нервы промываются в течение 30 минут в КМС-ФБС, а затем погружают на 12 часов при температуре 37^oC в 25 Кунитцевских единиц ДНК в РВ, содержащих 10 мМ хлорида магнезии, 10 мМ хлорида кальция и 0,05% азида натрия. Неклеточные препараты промываются 3 раза по одному часу в КМС-ФБС, содержащей 100 U/мл пенициллина плюс 100 мг/мл стрептомицина, и хранятся в этом же растворе при 4^oC.

Концентрация использованного лизофосфатилдилколина приводит к образованию свободной от клеток внеклеточной матрицы с интактными поперечной и продольной структурами.

Как видно из описания, данная методика представляет собой довольно сложную процедуру с использованием дорогостоящих и труднодоступных химических реактивов.

Кроме того, данный способ достаточно длителен.

Таким образом, техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является создание простого, не длительного по времени и не дорогостоящего способа подготовки нейроаллотрансплантата.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе подготовки нейроаллотрансплантата, используемого при нейропластике, предусматривающем предварительное помещение его в химически инертную среду и последующее очищение эндоневральных трубок от продуктов деградации миелина и нейролеммоцитов, согласно изобретения, очищение эндоневральных трубок заключается в биологическом воздействии на аллотрансплантат, путем помещения его в сальник реципиента на 3-7 суток.

При этом в качестве химически инертной среды используют среду-199.

Осуществление очищения эндоневральных трубок биологическим воздействием на аллотрансплантат, заключающемся именно в помещении его в сальник реципиента, позволяет значительно упростить процедуру очищения эндоневральных трубок, сократить время этого очищения и при этом полностью исключить использование дорогостоящих и труднодоступных химических реактивов.

Это достигается благодаря тому, что именно в сальнике реципиента аллотрансплантат атакуется перитонеальными макрофагами, активно выделяющими литические ферменты, что и приводит в итоге к очищению эндоневральных трубок.

При этом экстрацеллюлярный матрикс нерва остается целостным.

Заявителем экспериментально установлено, что требуемый эффект достигается именно в период нахождения аллотрансплантата в сальнике реципиента в течение 3-7 суток.

Нахождение аллотрансплантата в сальнике реципиента в течение более чем 7 суток не обеспечивает лучшего результата, а нахождение его в сальнике в течение менее трех суток не обеспечивает требуемого эффекта очищения.

Сопоставительный анализ известного и предлагаемого решений показал, что предлагаемое решение имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его "новизне" и "изобретательском уровне".

Данное техническое решение может найти широкое применение в нейропластике, что свидетельствует о его "промышленной применимости".

Способ осуществляется следующим образом.

Для приготовления нейроаллотрансплантата используют биологические объекты весом 10-20 кг. Под действием наркоза удаляется трансплантат, например трансплантат седалищного нерва длиной, например 3 см. Нерв вшивается на подложку из инертного материала, чтобы не допустить укорачивания нерва во время экстракции (удаления продуктов деградации).

Нерв на подложке помещается в химически инертную среду-199 с добавлением антибиотиков. Температура среды 37^oC. Время выдержки в среде 5-7 суток.

После выдержки в химически инертной среде трансплантат извлекают, удаляют инертную подложку.

Одновременно с этим вскрывается брюшная полость биологического объекта-реципиента, осуществляется доступ к сальнику реципиента, после чего нейроаллотрансплантат помещается в данный сальник на 3-7 суток.

Другому биологическому объекту с моделированной травмой нерва (например седалищного) вшивают подготовленный описанным выше методом нейроаллотрансплантат.

Клинические наблюдения за биологическими объектами, прооперированными с помощью подготовленных описанным выше методом трансплантатами в динамике от 6 до 12 месяцев показали хорошие результаты как по функциональному состоянию нервных стволов, так и двигательной активности конечностей оперированных биологических объектов.

Способ подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. У биологического объекта-донора под наркозом извлекли отрезок большеберцового нерва длиной 3 см.

Трансплантат вшили на подложку из инертного материала и поместили в химически инертную среду-199 с добавлением антибиотиков. Температура среды +37^oC. Время выдержки в среде - 5 суток.

После выдержки в среде-199 трансплантат извлекают, подложку удаляют.

Одновременно был подготовлен доступ к сальнику биологического объекта-реципиента, куда и поместили нейротрансплантат на 7 суток.

После истечения 7 суток нейротрансплантат вшили биологическому объекту весом 12 кг с моделированной травмой периферического большеберцового нерва размером 3 см.

Клинические наблюдения за прооперированным биологическим объектом в динамике в течение 6 месяцев показали хорошие результаты как по функциональному состоянию нервных стволов, так и по двигательной активности конечности прооперированного биологического объекта.

Пример 2. У биологического объекта-донора весом 12 кг под наркозом извлекли отрезок периферического нерва - седалищного длиной 4 см.

Далее способ осуществляли по методике, описанной в примере 1, за исключением:

- время выдержки нейроаллотрансплантата в среде-199 - 7 суток;

- время выдержки нефроаллотрансплантата в сальнике биологического объекта-реципиента - 3 суток;

- время клинического наблюдения за биологическим объектом, прооперированным по описанной выше методике, - 12 месяцев.