концентрат фактора ix системы свертывания крови и способ его получения

Формула изобретения

1. Концентрат фактора IX системы свертывания крови, представляющий собой протромбиновый комплекс, полученный фракционированием продуктов донорской плазмы, отличающийся тем, что он является 0,35 - 0,50%-ным раствором белка рН 7,1 - 7,5 с активностью фактора IX 13 - 20 МЕ/мл, удельной активностью 3,1 - 4,5 МЕ/мг, концентрацией ионов Na⁺ 240 - 270 ммоль/л и содержанием глицина 0,05 - 0,07 М.

2. Концентрат фактора IX системы свертывания крови по п.1, отличающийся тем, что он представлен в лиофилизированной форме.

3. Способ получения концентрата фактора IX системы свертывания крови, включающий сорбцию фактора IX из продуктов донорской плазмы на анионообменнике ДЕАЕ-Тоуореаrl, промывание анионообменника, элюцию целевого продукта с последующей стерилизующей фильтрацией, отличающийся тем, что предварительно после размораживания продукта донорской плазмы его рН доводят до рН стартового буферного раствора 7,2 - 7,8, центрифугируют, надосадочную жидкость фильтруют, а сорбцию проводят на колонке с анионообменником с последующей элюцией в ступенчатом градиенте ионной силы 200 - 360 ммоль Na⁺/л 0,01 - 0,02 М Трис-HCl буферным раствором с рН 7,0 - 7,5, содержащим 0,05 - 0,07 М глицин и 0,05 - 0,06 М трехзамещенный цитрат натрия, объединяют фракции с активностью не менее 2 МЕ/мл, суммарный элюат разводят стартовым буфером до концентрации белка 0,35 - 0,50% и проводят стерилизующую фильтрацию.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что центрифугирование размороженных продуктов донорской плазмы после доведения рН до 7,2 - 7,8 проводят при 5000 - 6000 g в течение 15 - 20 мин.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве стартового буферного раствора используют 0,01 - 0,02 М Трис-HCl, содержащий 0,03 - 0,06 трехзамещенный цитрат натрия и 0,01 - 0,05 М глицын.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве продукта донорской плазмы используют свежезамороженную плазму.

7. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве продукта донорской плазмы используют криосупернатант донорской плазмы.

8. Способ по любому из пп.3 - 6, отличающийся тем, что после стерилизующей фильтрации проводят лиофилизацию целевого продукта.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к получению антигемофильных препаратов, предназначенных для лечения больных гемофилией различного генеза.

Известен способ получения концентрата протромбинового комплекса из плазмы донорской крови человека путем фракционирования его с помощью сорбентов, таких как фосфат кальция, гидроокись алюминия, сульфат бария (1).

Недостатком указанного способа является получение целевого продукта, характеризующегося низким качеством (невысокой степенью очистки, низкой биологической активностью), трудоемкость процесса, что обусловлено низкой специфичностью указанных сорбентов по отношению к целевому продукту.

Известен также способ выделения протромбинового комплекса с последующим отделением фактора IX системы свертывания крови двустадийным методом: 1. ионообменная хроматография на ДЕАЕ-Сефадексе A-50 с выделением протромбинового комплекса; 2. ионообменная хроматография на сульфированном декстране с выделением целевого продукта - фактора IX (2).

Недостатком указанного метода является низкий выход целевого продукта, не превышающий 18%, и низкая воспроизводимость, что приводит к необходимости повышения затрат на получение целевого продукта.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения концентрата фактора IX системы свертывания крови, основанный на сорбции фактора IX из криопреципитата донорской плазмы на анионообменнике ДЕАЕ-Toyopearl при перемешивании в реакторе, промывании анионообменника, элюции фактора IX, диализе и концентрировании целевого продукта на полупроницаемых полых волокнах (3).

Недостатком указанного способа является низкий выход целевого продукта, не превышающий 50%.

Еще одним недостатком является высокая ионная сила получаемого элюата, что влечет за собой необходимость проведения его последующего диализа и концентрирования для получения целевого продукта.

Следующим недостатком данного способа является низкая степень его воспроизводимости в связи с невозможностью автоматизации, что затрудняет технологический процесс и повышает стоимость целевого продукта.

Продукт, полученный по указанному способу, характеризуется недостаточной степенью очистки и невысокой активностью.

Задачей данного изобретения является получение концентрата фактора IX системы свертывания крови с высокой степенью очистки, повышенной удельной активностью и характеристиками, удовлетворяющими требованиям нормативно-технической документации на препарат ВФС 42-2740-96, а также разработка способа, характеризующегося повышением выхода целевого продукта.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в получении концентрата фактора IX свертывания крови, представляющего собой протромбиновый комплекс, содержащий 0,35-0,5% белка с активностью фактора IX 13-20 МЕ/мл, удельной активностью 3,1-4,5 МЕ/мг, концентрацией ионов Na⁺ 240-270 ммоль/л, а также в способе его получения, включающем доведение pH размороженных продуктов плазмы до 7,2-7,8, центрифугирование, фильтрацию надосадочной жидкости, сорбцию ее на колонке с ДЕАЕ-Toyopearl, последующую элюцию в ступенчатом градиенте ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л 0,01-0,02 М Трис-HCl буферным раствором pH 7,0-7,5, содержащим 0,05-0,06 М трехзамещенный цитрат натрия и 0,05-0,07 М глицин, сбор фракций объемом 200-900 мл с активностью не ниже 2 МЕ/мл, последующую стерилизующую фильтрацию объединенного элюата и его лиофилизацию. (Измерение активности фактора IX проводят в ME - международных единицах, которые соответствуют стандарту активности концентрата фактора IX, разработанному ВОЗ (4).

Техническим результатом использования изобретения является получение очищенного концентрата фактора IX свертывания крови, обладающего высокой удельной специфической активностью, который может быть использован для лечения больных гемофилией различного генеза и соответствует нормативно-технической документации на препарат ВФС 42-2740-96, а также разработка способа получения такого препарата.

Способ осуществляют следующим образом. pH исходных продуктов донорской плазмы (криосупернатанта или свежезамороженной плазмы) доводят с помощью 0,5 N раствора NaOH до pH 7,2-7,8 и разводят 0,01-0,02 М Трис-HCl стартовым буферным раствором, содержащим 0,03-0,06 М трехзамещенный цитрат натрия и 0,01-0,05 М глицин, до концентрации белка 5-6%. Полученный раствор центрифугируют в течение 15-20 мин при 5000-6000 g, фильтруют и подают с линейной скоростью 50-90 см/ч на колонку с анионообменником ДЕАЕ-Toyopearl, уравновешенную 5-6 объемами стартового буферного раствора. Контроль процесса осуществляют с помощью хроматографической системы "Bioprocess". Несвязанные белки удаляют промыванием колонки 3-5 объемами стартового буферного раствора. Элюцию протромбинового комплекса проводят в ступенчатом градиенте ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л 0,01-0,02 М Трис HCl элюирующим буферным раствором, содержащим 0,05-0,07 М глицин и 0,05-0,06 М трехзамещенный цитрат натрия. Затем отбирают фракции объемом 200-900 мл со специфической активностью не ниже 2 МЕ/мл. Полученный суммарный элюат разводят стартовым буфером до концентрации белка 0,3-0,5%. Специфическая активность фактора IX, полученного данным способом, составляет 13-20 МЕ/мл, выход достигает 74-81%. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через пористые фильтры, розливу в стерильные флаконы по 20 мл и лиофилизации.

Пример 1. 88 л криосупернатанта плазмы разводят стартовым буферным раствором до содержания белка 5-6%, доводят pH с помощью 0,5 N NaOH до 7,2-7,8, центрифугируют в течение 15-20 мин при 5000-6000 g и фильтруют надосадочную жидкость. Очищенный раствор наносят на колонну Vantage S2 диаметром 250 мм с линейной скоростью 50 см/ч. Несорбированные белки отмывают 3 объемами стартового буфера. Элюцию протромбинового комплекса проводят 2 объемами элюирующего буфера ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л. Линейная скорость элюции составляет 14 см/час. Отбирают фракции объемом 600 мл с активностью не менее 2 МЕ/мл. Полученный суммарный элюат разводят на 20% стартовым буферным раствором до концентрации белка 0,41%. Специфическая активность фактора IX составляет 13 МЕ/мл, удельная специфическая активность 3,17 МЕ/мг. Концентрация ионов Na⁺ в объединенном элюате равна 253 ммоль/л, pH 7,2. Выход препарата 81%. Затем проводят стерилизующую фильтрацию через пористые фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, разливают в стерильные флаконы по 20 мл и подвергают лиофильной сушке.

Пример 2. 25 л свежезамороженной донорской плазмы после отделения криопреципитата и проведения обработки, как описано в примере 1, наносят на колонку Vantage S2 диаметром 130 мм с линейной скоростью 90 см/ч. Несорбированные белки отмывают 5 объемами стартового буфера. Элюцию протромбинового комплекса проводят 3 объемами элюирующего буферного раствора ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л. Линейная скорость элюции составляет 15 см/ч. Отбирают фракции объемом 200 мл и объединяют те, которые обладают специфической активностью не менее 2 МЕ/мл. Концентрация белка в суммарном элюате составляет 0,52%, специфическая активность фактора IX равна 20,0 МЕ/мл. Полученный суммарный элюат разводят стартовым буфером до концентрации белка 0,36% и специфической активности фактора IX 16 МЕ/мл. Удельная специфическая активность конечного продукта составляет 4,45 МЕ/мг, концентрация ионов Na⁺ равна 270 ммоль/л, pH 7,1, выход составляет 74%. Стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию проводят, как описано в примере 1.

Пример 3. 94 л криосупернатанта плазмы после разведения стартовым буфером до концентрации белка 4,9%, доведения pH, центрифугирования и фильтрации наносят на колонку Vantage S2 диаметром 250 мм с линейной скоростью 60 см/ч. Несорбированные белки отмывают 3 объемами стартового буфера. Элюцию протромбинового комплекса проводят 3 объемами элюирующего буфера ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л. Линейная скорость элюции составляет 14 см/ч. Собирают и объединяют фракции объемом 900 мл с активностью фактора IX не менее 2 МЕ/мл. Объединенный элюат разводят стартовым буфером до концентрации белка 0,49% и специфической активности фактора IX равной 20 МЕ/мл. Удельная специфическая активность конечного продукта составляет 4,08 МЕ/мг, pH 7,5, концентрация ионов Na⁺ равна 245 ммоль/л, выход - 77%. Стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию проводят, как описано в примере 1.

Пример 4. Больной Б. , 17 лет, обратился в связи с гемартрозом левого голеностопного сустава, возникшим в результате травмы. Страдает с детства гемофилией В. Уровень фактора IX менее 4%. Больной предъявлял жалобы на отечность, болезненность, ощущение давления в области пораженного сустава. Отмечалось уменьшение объема движения в травмированном суставе. Через 5 ч после поступления в отделение начата заместительная терапия концентратом фактора IX в дозе 540 ME, который вводился внутривенно капельно. Побочных реакций не отмечено. Через 10-15 мин от начала введения препарата боли в суставе уменьшились. При контрольном обследовании гемостаза выявлено повышение фактора IX до 34% (рост фактора IX составил 2,31% на 1 МЕ/кг веса тела). Через 20 ч в местном статусе не отмечалось патологических отклонений. Уровень фактора IX при исследовании гемостаза был равен 30%. Выписан с улучшением на 3 день без дополнительного лечения.

Препарат, полученный заявляемым способом, соответствует требованиям ВФС 42-2740-96 на препарат Агамфил B, разрешенный к применению Минздравом России (Приказ N 368 от 28.10.1996 г.).

Литература

1. Methods of plasma protein fractionation, 1980, с.117-128.

2. Патент США N 4447416, 1984.

3. Патент России N 2042358, 1995.

4. Европейская фармакопея (англ. изд), 1998, раздел 2.7.11, С.41.