способ получения бифилакта и способ лечения бифилактом дисбактериоза

Формула изобретения

1. Способ получения Бифилакта, включающий выращивание бифидо- и лактобактерий на питательной среде и последующее составление бактериальной композиции для ферментации молока при термостатировании, отличающийся тем, что бактериальную композицию "Энтерогс" для ферментации молока при термостатировании вводят в обезжиренное молоко, термостатируют в течение 5 - 6 ч до кислотности 45 - 47^oТ, причем адекватной скоростью созревания продукта считают достижение кислотности 29 - 32^oТ за первые 4 - 4,5 ч, после чего продукт выдерживают до кислотности 55 - 69^oТ.

2. Способ лечения дисбактериоза Бифилактом, включающий использование бифидо- и лактобактерий, отличающийся тем, что больному назначают Бифилакт курсом 25 - 45 дней ежедневно по 400 - 600 мл и в середине курса дополнительно назначают лечебные клизмы из композиции "Энтерогс" по схеме: однократно 1,5 л среды с лактобактериями, затем по 0,1 - 0,15 л среды с бифидумбактериями в течение 10 дней и вновь 1,5 л среды с лактобактериями однократно.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к пищевой промышленности и медицине и может быть использовано как эубиотическое и профилактическое средство при дисбактериозе, желудочно-кишечных заболеваниях, заболеваниях нервной системы, онкологических заболеваниях, иммунодепрессивных состояниях, пищевой аллергии, а также диетическом питании взрослых и детей для восстановления нормальной микрофлоры, иммунокоррекции организма.

В современных условиях в результате широкого использования антибиотиков в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, а также из-за других неблагоприятных факторов (загрязнения биосферы промышленными отходами, включая радиоактивные вещества) наметился сдвиг в микробной экологии человека. Мы едим, пьем и дышим в экологически далеко не благополучном мире. Сильный эмоциональный стресс также оказывает отрицательное воздействие на микрофлору желудочно-кишечного тракта.

Первостепенное защитное значение в организме человека имеет нормальная кишечная микрофлора, и, главным образом, преобладающие в ней молочно-кислые бактерии: бифидобактерии и лактобациллы, которые оказывают сдерживающее влияние на размножение условно-патогенных микробов, защищая нас от кишечных инфекций, принимают участие в пищеварительных и метаболических процессах, в синтезе витаминов и жизненно необходимых аминокислот, усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, способствуют усвоению жиров, клетчатки, стимулируют перестальтику кишечника, помогают нормальной эвакуации его содержимого, играют важную роль в профилактике анемии, рахита, аллергии. Благодаря им повышается иммунный статус организма, вырабатываются биологически активные вещества, регулирующие работу желудочно-кишечного тракта, печени, сердечно-сосудистой системы, обменные процессы, кроветворение. В случае уменьшения концентрации бифидобактерий и лактобацилл в желудочно-кишечном тракте человека развивается дисбактериоз и начинается мощная интервенция токсинов: продуктов жизнедеятельности патогенной микрофлоры, которые, обладая большой биологической активностью, наносят серьезный вред организму. При этом мы испытываем ощущение хронического недомогания. Следствием дисбактериоза являются пищевые аллергии с кожными проявлениями, тяжело протекающие ОРВИ, появление избыточного веса, вследствие нарушения обменных процессов. При устранении дисбактериоза успешнее идет терапия острых и хронических артритов, заболеваний желудочно-кишечного тракта, желчевыводящих путей и мочевыделительной системы, гепатита, заболеваний дыхательных путей, гнойных инфекций, гинекологических заболеваний, постстрессовых заболеваний, анемии, нарушений обменных процессов, половых расстройств.

В качестве аналога можно привести способ получения продукта диетического питания - ацидофильно-дрожжевого молока и ацидофильно-дрожжевого напитка ("Инструкция по приготовлению и применению заквасок для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности", утвержденная Министерством мясной и молочной промышленности СССР 08.10.76, М., 1978 г.). Для приготовления лабораторной закваски в 0,5 л стерилизованного обезжиренного молока, подогретого до 37-40^oC, вносят 10 мл свежеприготовленной чистой культуры ацидофильной палочки - Lbm.acidophilum и 10-15 мл смыва дрожжей с поверхности агара.

Заквашенное молоко ставят в термостат при 30-32^oC до образования сгустка, который появляется через 10-12 часов. После свертывания закваску дополнительно выдерживают при комнатной температуре /18-20^oC/ в течение 12-24 часов. Для лучшего роста дрожжей в процессе выдержки закваску следует периодически перемешивать. Готовую закваску охлаждают до 3-10^oC и при этой температуре хранят до употребления.

Производственную закваску готовят на обезжиренном пастеризованном молоке, охлажденном до 37-40^oC, добавляя 2-3% лабораторной закваски, тщательно перемешивают и оставляют до образования сгустка, который появляется через 10-12 часов. Далее в стерилизованное обезжиренное молоко добавляют 2-3% производственной закваски и культивируют 10-12 часов до получения конечного продукта.

Недостатки аналога:

- получаемый конечный продукт является продуктом диетического питания, но не является эубиотическим средством;

- трудоемкость осуществления способа в связи с большим количеством технологических операций;

- большая длительность процесса, что увеличивает энергоемкость и себестоимость продукта.

За прототип нами принят способ получения бифилакта в соответствии с "Инструкцией по изготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях", утвержденной МЗ СССР 27.03.87 г., N 11-14/6-33, М., 1987 г., ТУ 9222-001-34960875-97.

Для приготовления кисломолочного Бифилакта по прототипу применяют молоко цельное коровье, сухой бифидумбактерин или жидкую закваску из одного из штаммов бифидобактерий, сухой лактобактерин или жидкую закваску, гидролизатно-молочную среду, молочно-дрожжевую среду.

Бифилакт получают следующим образом. Вначале получают закваски бифидобактерий и лактобактерий. Для этого флакон с лиофилизированным штаммом бифидобактерий культивируют в 75 мл гидролизатно-молочной среде или печеночной среде Блаурокка в течение 24 часов.

Закваску из лактобактерий получают из сухого лактобактерина, который засевают в молочно-дрожжевую среду, инкубируют 20-22 часа.

Питательную среду Блаурокка для выращивания бифидобактерий готовят путем совмещения печеночного отвара, пептона сухого, хлорида натрия, L-цистеина, агара микробиологического, последующего кипячения, автоклавирования.

Питательную гидролизатно-молочную среду готовят на основе гидролизата обезжиренного молока. Для этого обезжиренное молоко доводят до кипения, кипятят в течение 2 минут, остужают до 45^oC, устанавливают pH 8,0-10,0 20%-ным раствором NaOH, добавляют панкреатин, в течение 4 часов помешивают в термостате, постоянно корректируют pH. Добавляют хлороформ и оставляют в термостате до утра. Через сутки доводят pH 30%-ным раствором уксусной кислоты до 4,5; кипятят, отфильтровывают, определяют содержание аминного азота и хлоридов. Остывший гидролизат разводят водой в соотношении 1:1, отливают и добавляют агар-агар, а к оставшейся части - NaCl и пептон. Нагревают, соединяют с расплавленным агаром. Доводят до определенной pH, кипятят, фильтруют, добавляют лактозу и цистеин солянокислый, стерилизуют автоклавированием.

Среду для лактобактерий готовят на основе гидролизата молока способом, описанным выше, к нему добавляют дрожжевой автолизат и глюкозу.

В молоко, простерилизованное при 0,5 атм (110-112^oC) в течение 30 мин или прокипяченное в течение 1 часа и охлажденное до 37-38^oC, вносят закваску из B.bifidum 791 в количестве 1-1,5% одновременно с закваской из лактобацилл в объеме 2-5% к объему продукта.

Заквашенное молоко тщательно перемешивают, разливают в стерильные емкости, укупоривают и помещают в термостат при 37-38^oC. Выдерживают от 10-16 часов до появления сгустка, получая Бифилакт.

Недостатки прототипа:

- трудоемкость осуществления способа в связи с большим количеством технологических операций;

- несоблюдение экологической чистоты в связи с применением синтетических добавок при выращивании бактерий;

- высокая себестоимость получаемой композиции в связи со сложностью технологии и большим количеством используемых ингредиентов;

- ненадежность качественных показателей получаемого продукта в связи с отсутствием контроля за созреванием биомассы;

- низкая активность получаемой биомассы;

- длительное созревание конечного продукта (10-16 часов);

- высокая кислотность бифилакта (80-100^oT);

- низкий терапевтический эффект, связанный с низкой концентрацией жизнеспособных бактерий, низкая колонизирующая способность;

- невозможность применения при гиперацидных состояниях и у детей раннего возраста.

Известен способ лечения дисбактериоза, предусматривающий введение адсорбентов, антибиотиков, ферментов, сухих бактериальных препаратов, витаминов на фоне щадящей диеты (Кн. М.В. Панчишина, С.Ф. Олейник "Дисбактериоз кишечника", Киев, "Здоровье", 1983 г.).

Недостатки: курс лечения занимает от 3 месяцев до двух лет и включает очень большое количество дорогостоящих препаратов. Однако терапевтический эффект составляет 20-30%, срок ремиссии - до 3-6 месяцев. Полное извлечение наблюдается в редких случаях. Кроме того, в связи с использованием антибиотиков часто наблюдается побочный эффект. Способ трудоемок и для медперсонала, и для больного.

За прототип нами принят способ лечения дисбактериоза (Методические рекомендации МЗ СССР, "Лечебное питание детей в комплексной терапии и профилактике гастроэнтерологических заболеваний", Горький, 1985 г.), включающий комплексную терапию и применение Бифилакта по 200 мл в день в один-два приема в течение месяца. Комплексная терапия предусматривает типичное лечение, описанное в аналоге за исключением сухих бактериальных препаратов.

Недостатки, общие с аналогом. Кроме этого, использование Бифилакта, полученного с использованием синтетических ингредиентов, усиливает побочный эффект. Количество бактерий, вводимых в организм не контролируется, что также снижает терапевтический эффект.

Целью изобретения является повышение терапевтической активности Бифилакта и расширение показаний к применению, устранение побочного эффекта.

Задачи:

- получение морфологически зрелой биомассы;

- исключение из технологии производства синтетических добавок и консервантов и получение экологически чистого продукта;

- снижение себестоимости и трудоемкости способа получения Бифилакта.

- Сущностью изобретения при получении Бифилакта является введение бактериальной композиции "Энтерогс" для ферментации молока в обезжиренное молоко, термостатирование в течение 5-6 часов до кислотности 45-47^oT и последующее выдерживание до кислотности конечного продукта - Бифилакта 55-60^oT.

- Бактериальную композицию для ферментации молока получают преимущественно по способу, защищаемому в заявке на патент N 98115927, приоритет от 24.08.98 г.

Сущностью способа лечения дисбактериоза является введение в организм больного лакто- и бифидумбактерий путем приема Бифилакта в качестве напитка курсом 25-45 дней ежедневно по 400-600 мл и на этом фоне с 10-го дня приема Бифилакта назначают курс лечебных клизм из композиции "Энтерогс" в среде по схеме:

однократно - 1,5 л лактобактерий в среде, затем в течение 10 дней по 0,1-0,15 л бифидумбактерий в среде и вновь однократно 1,5 л лактобактерий в среде.

Способ получения Бифилакта.

В обезжиренное молоко, пастеризованное при 0,5 атм (110-112^oC) в течение 30 мин и охлажденное до 37-38^oC, вносят композицию "Энтерогс" (концентрация бифидобактерий - 1,0-1,2%), выдерживают заквашенное молоко при 37-38^oC в течение 5-6 часов. При этом периодически осуществляют контроль кислотности созревающего продукта в зависимости от времени созревания. При достижении кислотности 29-32^oT за 4,0-4,5 часа считают процесс созревания продукта адекватным. При отклонении от указанной закономерности созревания, усиливают контроль за качеством и микробной обсеменностью, который осуществляют путем морфологического контроля созревающей биомассы в продукте, микробиологического контроля бактериальной обсеменности и бактериологического контроля концентрации бифидо- и лактобактерий. В случае отклонения от указанных требований (концентрация лакто- и бифидобактерий ниже 10⁸ КОЕ соответственно, высокая кислотность продукта - выше 60^oT или бактериальная обсеменность) продукт бракуют.

При завершении процесса выдерживания Бифилакта проводят органолептическую оценку: Бифилакт должен быть белого или кремоватого цвета, кисломолочного приятного вкуса, без посторонних вкуса и запаха. Сгусток должен быть равномерным, количество сыворотки не превышать 1/10 объема.

Способ опробирован в промышленных условиях на 300 партиях по 600 л каждая. В конце описания приводится табл. 1 обоснования адекватных режимов культивирования продукта Бифилакт.

Способ лечения дисбактериоза осуществляют следующим образом. Определяют содержание микрофлоры в кишечнике и при подтверждении диагноза дисбактериоза утром, после очищения кишечника (естественная дефекация или очистительная клизма), вводят 1,5 л лактобактерий в среде из композиции "Энтерогс".

После этого ежедневно на ночь в течение 10 дней делают микроклизмы 0,1-0,15 мл теплой среды с бифидумбактериями из композиции "Энтерогс". В заключение курса клизм вновь однокртно делают клизму из лактобактерий в среде из композиции "Энтерогс" объемом 1,5 л. Через 1 месяц делают контрольное определение микрофлоры кишечника. По показаниям курс лечения может быть повторен.

Нами опробирован способ лечения на свыше 200 больных.

Выявлено, что у 37% больных наступило полное извлечение.

Остальной группе больных потребовался второй курс лечения, закончившийся восстановлением нормальной эубиотической микрофлоры.

Лечение не включало других препаратов кроме Бифилакта и бактерий в среде из композиции "Энтерогс". Больным рекомендовалось находиться на щадящем режиме питания с условием исключения из рациона трудноперевариваемых углеводов и включением в рацион диетического мяса (см. табл. 2).

На 5-ти группах больных дисбактериозом, в каждой из которых было по 20 человек, нами проведено обоснование длительности курса лечения в зависимости от концентрации бактерий в средах, вводимых в клизмах, и объема клизм (см. табл. 3).

Из табл. 3 видно, что оптимальный объем клизмы, содержащей лактобактерии в среде композиции "Энтерогс" (концентрация лактобактерий не менее 10⁸), составляет 1,5 л и оптимальный объем клизмы, содержащей бифидумбактерии в среде композиции "Энтерогс" (концентрация бактерий не менее 10⁸), составляет 0,1-0,15 л. При такой дозировке нормализация микрофлоры в кишечнике наступает на 20-й день лечения. Результаты лечения можно закрепить, продлив курс на 5-10 дней.

Пример 1. Предварительно получили композицию лакто- и бифидобактерий для ферментации молока "Энтерогс" в соответствии со способом по заявке N 98115927 от 24.08.98. Сущностью этого способа является получение композиции для производства препарата лечебного и диетического питания путем использования Бифилакта ТУ 9222-001-34960875-97 для получения сред выращивания бактерий в качестве осадителя белков молока при условии введения его в обезжиренное молоко, фильтрации, раздельного выращивания в фильтрате с глюкозой лакто- и бифидобактерий, смешивания их в соотношении 1:2 (до концентрации 1,0-1,2% и 0,5-0,6% соответственно в обезжиренном молоке при получении продукта - Бифилакт - ТУ 9222-001-34960875-97) для получения микробной композиции.

Полученной композиции авторы присваивают название "Энтерогс".

Для приготовления кисломолочного Бифилакта взяли:

А) Молоко коровье, соответствующее ГОСТ 13277-79 1 сорта, выдерживающее алкогольную пробу с этиловым спиртом 72% концентрации;

Б) сухой бифидумбактерин;

В) сухой лактобактерин;

Г) гидролизатно-молочную среду;

В) молочно-дрожжевую среду.

Флакон или ампулу с лиофилизированным штаммом бифидумбактерина стерильно вскрывали и наливали 5 мл гидролизатно-молочной среды или печеночной среды Блаурокка.

Содержимое ампулы или флакона энергично встряхнули до получения равномерной суспензии и налили во флакон, содержащий 70 мл гидролизатно-молочной среды, и выдерживали в термостате при 37-38^oC в течение 24 часов.

Для приготовления закваски из лактобактерий использовали ампулу с лактобактерином, (3 дозы), растворили стерильным физиологическим раствором из расчета 1 мл на 1 дозу препарата, засеяли в молочно-дрожжевую среду (гидролизат молока +5% дрожжевого автолизата +0,2% глюкозы) из расчета 10¹¹ лактобацилл на 10 л среды при температуре 37-38^oC.

В молоко, простерилизованное при 0,5 атм (110-112^oC) в течение 30 мин и охлажденное до 37^oC, внесли закваску из B. Bifidum 791 в количестве 1,5% одновременно с закваской из лактобацилл в объеме 3% к объему продукта. Заквашенное молоко тщательно перемешивали, разлили в стерильные бутылочки, укупорили и поместили в термостат при 37-38^oC. Выдерживали от 10-16 часов до появления сгустка. Полученный Бифилакт использовали однократно для получения сред культивирования лакто- и бифидобактерий при производстве композиции "Энтерогс". Для этого Бифилакт внесли в доведенное до 95^oC обезжиренное молоко в количестве 750 мл на 2 л молока. Створоженные белки молока удалили фильтрацией, а оставшийся фильтрат повторно пастеризовали, внесли раствор глюкозы до конечной концентрации 0,2%. Полученную среду остудили до температуры 37^oC. В 250 мл полученной среды внесли ампулу бифидумбактерина для выращивания B.Bifidum 791. Для выращивания L.plantarum 8 раз в 250 мл полученной среды внесли ампулу лактобактерина. Поместили среды с бактериями на культивирование при 37^oC. Через 18 часов культивирования проконтролировали рост культур микроскопически. Для этого 0,2 мл бактериальной суспензии поместили на стекло, сделали мазок, мазок окрасили по Граму. Через 18 часов культивирования в культуре B.bifidum 791 наблюдали кокковые формы B.bifidum 791, а в культуре L.plantarum 8 раз - наблюдали палочковые и кокковые формы L. plantarum 791 в равном соотношении. Культуру L.plantarum 8 раз оставили дозревать еще 6 часов, а культуру B.bifidum 791 - 22 часа. За это время при очередном морфологическом контроле в культуре L.plantarum 8 раз все лактобактерии культуры преимущественно палочковидной формы, бактерии в культуре B. bifidum 791, также имеют, в основном, полярно окрашенных полиморфных палочек. Культуры считали морфологически зрелыми и использовали для приготовления композиции "Энтерогс" путем их смешивания (в соотношении: 1 часть культуры бифидумбактерий и 2 части культуры лактобактерий; конечная концентрация в молоке культуры бифидумбактерий 0,5%, а культуры лактобактерий - 1,2%) для получения Бифилакт - ТУ-9222-001-34960875-97.

Таким образом, для получения Бифилакта в обезжиренное пастеризованное молоко при 0,5 атм (110-112^oC), охлажденное до 37^oC, внесли 0,5% культуры бифидобактерий и 1,0% лактобактерий и запустили процесс ферментации молока. Через каждый час осуществляли контроль зависимости кислотности созревающего продукта от времени созревания. Через 4 часа кислотность составила 32^oT. Процесс ферментации продолжили до 6 часов до кислотности 47^oT и оставили на дозревание при температуре 12^oC до кислотности 60^oT, количество жизнеспособных лактобактерий и бифидобактерий составило 10¹² КОЕ. Физико-химический, микробиологический и органолептический контроль показал через 18 часов соответствие продукта ТУ-9222-001-34960875-97.

Пример 2.

Указанным способом получили композицию "Энтерогс".

В обезжиренное пастеризованное молоко внесли композицию "Энтерогс" 0,6% культуры бифидумбактерий и 1,2% лактобактерий и оставили продукт для ферментации при 38^oC.

Контроль за процессом осуществляли через каждый час. Через 4,5 часа кислотность составила 29^oT. Процесс ферментации завершили после 5 часов. Кислотность составила 45^oT. После охлаждения до температуры 12^oC и выдерживания продукта в течение 16 часов кислотность составила 55^oT. Количество жизнеспособных лакто- и бифидобактерий составило 10¹⁰ КОЕ соответственно. Контроль подтвердил соответствие продукта требованиям ТУ.

Пример 3. Больной Ф., 30 лет, поступил в клинику с язвенным колитом после длительного лечения антибактериальными препаратами. В копрограмме больного была обнаружена гемолизирующая кишечная палочка в высоком титре, снижено содержание бифидобактерий. Основными симптомами был жидкий стул-3-4 раза в сутки, слабость, кратковременное повышение температуры до 37,8^oC, низкий вес тела.

Больному назначено лечение: Бифилакт курсом 25 дней ежедневно по 400 мл и в середине курса (с 10-го дня приема Бифилакта) дополнительно назначили лечебные клизмы из композиции "Энтерогс" по схеме: однократно 1,5 л среды с лактобактериями, затем по 0,1 л среды с бифидумбактериями в течение 10 дней и вновь 1,5 л среды с лактобактериями однократно.

Через неделю после начала приема Бифилакта у больного нормализовался стул, отмечалось улучшение общего состояния, восстановился аппетит.

После курса клизм больной чувствовал себя здоровым, полным сил.

Стул и аппетит в норме, температура тела больше не повышалась.

Были взяты анализы кала на исследование. Гемолизирующая кишечная палочка отсутствовала, титр бифидумбактерий - в норме.

Через месяц после проведенного курса Бифилактотерапии повторно исследовали кал больного. Все показатели были в норме.

Самочувствие хорошее. Восстановился вес тела.

Пример 4. Больная Р., 28 лет, поступила в стационар с симптоматикой острого желудочно-кишечного заболевания.

Заболевание началось остро с высокой температуры, отмечалась вялость, заторможенность, головная боль, озноб, пот, часто тошнота, рвота, частый жидкий стул, сухой обложенный язык.

В крови высокий лейкоцитоз с резким нейтрофильным палочкоядерным сдвигом, высокие цифры СОЭ, нарастающая анемия. В анализах мочи протеинурия, гематурия. В бактериологическом исследовании кала выявлены синегнойная палочка и клибсиелла.

Больной назначен курс лечения Бифилактом в течение 45 дней ежедневно по 600 мл и в середине курса дополнительно назначили лечебные клизмы из композиции "Энтерогс" по схеме: однократно 1,5 л среды с лактобактериями, затем по 0,15 л среды с бифидумбактериями в течение 10 дней и вновь 1,5 л среды с лактобактериями однократно.

Через неделю после начала курса лечения исчезла вялость, заторможенность, озноб, пот, тошнота рвота, нормализовался стул.

После окончания курса лечебных клизм общее состояние полностью нормализовалось, температура тела больше не поднималась, стул полностью восстановился, появился хороший аппетит. Еще через неделю полностью нормализовались показатели крови и мочи. По окончании курса лечения Бифилактом исследовали бактериологически кал. Состав микрофлоры нормализовался. Через месяц после проведенного лечения исследовали кровь, мочу и кал повторно. Все показатели соответствовали норме. Общее самочувствие было хорошее.

Предложенный способ получения Бифилакта позволяет получить диетический и лечебный продукт Бифлакт с оптимальным соотношением жизнеспособных лакто- и бифидобактерий. Это обеспечивает получение высокого терапевтического эффекта, возможность использования для детей раннего возраста, снизить себестоимость производства Бифилакта относительно прототипа на 40-45%, повысить эффект лечения - в 10 раз. Использование обезжиренного молока делает продукт высококачественным диетическим продуктом и позволяет предотвратить процесс омыления жиров, как результат жизнедеятельности бактерий в средах с содержанием жира. Лечение дисбактериоза путем применения Бифилакта и лечебных клизм обеспечивает полное выздоровление в большинстве случаев, устраняет побочные эффекты, расширяет объем использования, в том числе для детей раннего возраста. Лечение является экологически чистым и общедоступным.