конъюгат изониазид-декстран и его применение в качестве противотуберкулезного препарата

Формула изобретения

1. Конъюгат изониазид-декстран с мол.м. 65 - 75 кД формулы



где R₁ - H, остаток глюкозы или полиглюкозильный остаток указанного на рисунке вида;

R₂ - остаток изоникотиноилгидразида(изониазида) формулы или гидроксильная группа.

2. Противотуберкулезный препарат, представляющий собой конъюгат изониазид-декстран, отличающийся тем, что мол.м. конъюгата составляет 65 - 67 кД.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, фтизиатрии, химико-фармацевтической промышленности, ветеринарии и представляет собой средство для лечения туберкулеза.

Известны низкомолекулярные вещества для лечения туберкулеза, в первую очередь, это изониазид и рифампицин [1]. Наряду с очевидными позитивными, они обладают рядом негативных свойств. Малая молекулярная масса обусловливает очень быстрое их выведение из организма и, как следствие, необходимость применения очень больших доз бактериостатиков, что определяет высокий уровень токсических осложнений. Кроме того, этим препаратам свойственна малая бактериостатическая активность в отношении внутриклеточно персистирующих форм микобактерий, что определяет их низкую эффективность при лечении генерализованных хронических гранулематозных форм туберкулеза. Следует указать также на то, что при использовании данных препаратов для лечения туберкулеза наблюдается высокий профиброгенный эффект, что приводит к инвалидизации больных, особенно при излечении легочных форм туберкулеза.

Известны противотуберкулезные лекарственные средства пролонгированного действия, представляющие собой конъюгаты изониазида с высокомолекулярными носителями, в частности с производными карбоксиметилсефадекса (КМС) [2, 3]. Пролонгация действия КМС реализуется за счет депонирования на тканевом уровне. Происходит медленное высвобождение действующего начала из созданного (внутримышечно или подкожно) депо; дальнейший путь его поступления к возбудителю заболевания не отличается от такового при использовании свободного изониазида.

Недостатком этого средства является очень низкая гидролизуемость в организме высокомолекулярного носителя, возможность накопления внутри лизосом с провоцированием неблагоприятных последствий, а именно лабилизации мембраны и индуцирования процесса накопления (тезауресмоза), что может провоцировать образование гранулем, осложнить течение сопутствующих туберкулезу заболеваний печени.

Известен противотуберкулезный препарат - конъюгат изониазид-декстран, где в качестве пролонгирующей высокомолекулярной матрицы используют декстран с молекулярной массой 20-40 кД [4] и 40 кД [5] (прототип).

Данный препарат, в силу лизосомотропности использованной матрицы, накапливается в лизосомах макрофагов (в том числе и в инфицированных микобактериями туберкулеза макрофагах гранулем), т.е. на внутриклеточном уровне, в непосредственной близости от находящегося там возбудителя заболевания. В лизосомах происходит гидролиз пролонгированного препарата с высвобождением изониазида в активной форме и созданием вследствие этого на длительный период высоких концентраций изониазида на внутриклеточном уровне, т.е. в микроокружении микобактерий туберкулеза. Этим и объясняется увеличение терапевтической эффективности данного препарата. Снижение же токсичности обусловлено замедленным высвобождением продуктов метаболизма изониазида из внутриклеточного депо и, главным образом, снижением курсовой дозы бактериостатика.

Несмотря на целый ряд положительных свойств данного препарата, дальнейшие исследования показали, что возможно создание препарата, положительные свойства которого могут быть усилены по сравнению с прототипом.

Сущность изобретения.

Предложен препарат для лечения туберкулеза, представляющий собой также конъюгат изониазид-декстран (изоникотиноилгидразид-декстран) общей формулы



где R₁ - H, остаток глюкозы или полиглюкозильный остаток указанного на рисунке вида;

R₂ - остаток изоникотиноилгидразида (изониазида) или гидроксильная группа.

Предложенный препарат отличается от прототипа тем, что имеет молекулярную массу 65-75 кД.

Предложенный препарат, как и прототип, характеризуется пролонгированностью действия и клеточной адресацией. Но по сравнению с прототипом он обладает более высокой терапевтической эффективностью как в отношении микобактерий, циркулирующих в крови, так и в отношении микобактерий, персистирующих в гранулемах; большей пролонгированностью действия, существенно меньшей общей токсичностью.

Перечень фигур графических изображений.

Фиг. 1. Численные плотности туберкулезных гранулем в печени мышей (N_ai - численная плотность туберкулезных гранулем в 1 мкм²).

Фиг. 2. Диаметры туберкулезных гранулем в печени.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения с реализацией назначения.

1. Получение препарата.

Синтез конъюгата изониазид-декстран может быть осуществлен различными способами, в частности по методике К.П. Хомякова и др. [6, 7] в модификации А.Б. Пупышева, Ю.Н. Курунова и В.А. Шкурупия [5], приводимой ниже.

1.1. Получение диальдегиддекстрана (промежуточного продукта).

К раствору 537 мг декстрана с молекулярной массой 65-75 кД, например 70 кД (декстран-70), в 27 мл дистиллированной воды прибавляли 250 мг NaIO₄ в 5,9 мл H₂О, перемешивали на магнитной мешалке 45 мин при комнатной температуре. Приливали 7,4 мл чистого этиленгликоля, перемешивали 20 мин. Раствор подвергали диализу в течение 24 часов против 50 объемов дистиллированной воды, осаждали продукт добавлением 228 мл охлажденного (+ 4-6^oC) этанола в течение 24 часов. Взвесь центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход - 296 мг (54% от теоретического).

1.2. Получение конъюгата.

К раствору 296 мг диальдегиддекстрана (pH 4,6) в 5,2 мл дистиллированной воды прибавляли 0,5 мл 5% CH₃COOH (pH 2,9), 265 мг твердого изониазида и перемешивали 20 мин при комнатной температуре. Прибавляли каплю спиртового раствора фенолфталеина и затем 0,5 н. NaOH до розовой окраски (pH 8,0). После этого вводили 125 мкл буфера 1 М трис-HCl (pH 7,5) и перемешивали 5 мин (окраска исчезала). Прибавляли 2,96 мл водного раствора NaBH₄ (4 мг/мл), перемешивали 30 мин. Раствор конъюгата диализовали 24 часа против 50 объемов дистиллированной воды. Продукт осаждали охлажденным этанолом (189 мл, 5 ч) и центрифугировали. Осадок 3 раза промывали ацетоном и высушивали на воздухе. Выход - 60% от теоретического (расчет на диальдегиддекстран).

Конечный продукт представляет собой растворимый в воде порошок желтовато-белого цвета.

Общий выход конъюгата - 32,4% от теоретического, расчет на декстран. Весовое содержание изониазида в конъюгате составляет 6,79% - 9,16% (молярное соотношение изониазид/декстран 34,1 - 47,3). Концентрацию изониазида определяли спектрофотометрически.

Конъюгат изониазид-декстран устойчив при 4-6^oC при хранении в сухом виде по крайней мере в течение 1,5 лет. Снижения общего содержания изониазида в продукте или его отщепления не обнаружено.

С помощью спектроскопии протонного магнитного резонанса было установлено, что изониазид присоединен к декстрану одинарной C-N связью. Двойная связь C=N, группы СНО и СООН отсутствуют. Спектр протонного магнитного резонанса был записан в ИХКиГ СО РАН на ЯМР-спектрометре JEOL FX 90 Q. В инфракрасном спектре (записан ИНХ СО РАН на спектрофотометре SPECORD - IR) имеются полосы поглощения карбонильной группы и пиридинового кольца изониазида. Таким образом, спектральные данные вполне согласуются с химическим строением конъюгата.

2. Сведения, подтверждающие противотуберкулезную активность препарата.

Противотуберкулезная активность предлагаемого препарата была исследована как в прямых опытах in vitro, так и в экспериментах на животных. Исследование комплексной формы изониазида (КФИ), т.е. препарата изониазид-декстран, проводилось параллельно с исследованием свободной формы изониазида (СФИ).

2.1. Сведения об антимикобактериальной активности препарата, полученные в опытах in vitro.

Антимикобактериальный эффект комплексной формы изониазида оценивали по минимальной ингибирующей концентрации и интенсивности роста микобактерий Bov-8 на среде Школьниковой, содержащей СФИ и КФИ в диапазоне концентраций от 0,004 до 2 мкг/мл.

Полученные результаты показали, что задержка роста микобактерий отмечена при концентрации действующего начала 0,1 мкг/мл (по изониазиду) - как в образцах со СФИ, так и в образцах с КФИ.

Таким образом, синтезированная КФИ в условиях in vitro обладает выраженной антимикобактериальной активностью, не уступающей активности препарата свободного изониазида (СФИ).

2.2. Сведения о противотуберкулезной активности КФИ, полученные в опытах на животных.

Работа выполнена на мышах-самцах линии BALB/c двухмесячного возраста, массой тела 20-22 г. В опытах использовано 90 животных. Их содержали на стандартной лабораторной диете, они имели свободный доступ к воде и пище. Перед проведением экспериментов животных в течение двух недель адаптировали к условиям содержания. Все экспериментальные воздействия и взятие образцов органов осуществляли в утренние часы (с 9 до 10 часов).

Диссеминированный туберкулезный процесс моделировали однократным интраперитонеальным введением животным вакцины БЦЖ (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва). Каждому животному вводили 0,5 мл вакцины на физиологическом растворе. У мышей подопытной серии через 1 месяц после заражения развивалось диссеминированное гранулематозное туберкулезное воспаление с поражением всех паренхиматозных органов, что указывало на генерализованность процесса. Животные были разделены на три группы. Первая группа - нелеченые - служила контролем. Мышей второй группы через 1 месяц после заражения начинали лечить в интермиттирующем режиме (2 раза в неделю) внутрибрюшинными инъекциями свободного изониазида (СФИ) в дозе 14 мг на 1 кг массы тела [1]. Мышей третьей группы в те же сроки и в том же режиме лечили комплексной формой изониазида (КФИ) на декстрановой матрице с молекулярной массой 65-75 тысяч дальтон. Лечение продолжали в течение 5 месяцев. Для исследования органы у животных второй и третьей групп получали через 1, 2, 3 и 5 месяцев от начала лечения, контрольной группы - через 1 и 5 месяцев с момента введения вакцины БЦЖ.

Объектом исследования служила печень. Известно, что специфические гранулемы в печени при туберкулезе различных локализаций обнаруживают в 60-93% биоптатов, причем гранулематозный гепатит иногда возникает как осложнение вакцинации БЦЖ. Кроме того, в печени сосредоточен наибольший компартмент клеток системы мононуклеарных фагоцитов, что дает возможность моделирования гранулематозного воспаления (т.к. гранулемы преимущественно состоят из этих клеток) и изучения влияния лекарственного препарата на гранулематозное воспаление.

Для морфологического исследования в каждой группе использовали по 8-10 мышей. Животных умервщляли путем дислокации позвонков в шейном от деле. Образцы печени для целей световой и электронной микроскопии брали из края левой латеральной доли и подвергали соответствующим стандартным обработкам согласно рекомендациям [8 - 10].

Морфометрическое исследование образцов проводили в соответствии с рекомендациями [11, 12].

Для оценки бактериостатического эффекта препарата использовали два показателя - количество гранулем на единицу площади среза печени (численная плотность гранулем) и диаметр гранулем.

Циркулирующие в крови микобактерии поглощаются макрофагами, в том числе макрофагами печени. Вокруг макрофагов, фагоцитировавших микобактерии, но оказавшихся не в состоянии подвергнуть их деградации, образуются туберкулезные гранулемы. Чем больше микобактерий циркулирует в крови, тем больше образуется гранулем. Противотуберкулезное лекарственное средство приводит к уменьшению пула циркулирующих микобактерий, что, в свою очередь, приводит к уменьшению плотности гранулем.

Наибольшую трудность в лечении туберкулеза представляет, однако, уничтожение микобактерий, персистирующих в гранулемах. Размножение микобактерий в гранулеме приводит к ее росту, что на тканевых препаратах проявляется увеличением диаметра гранулем. Противотуберкулезный препарат, эффективный в отношении персистирующих в гранулемах микобактерий, приводит к уменьшению диаметра гранулем.

Проведенные исследования по определению количества и диаметра гранулем в группах животных, получавших лечение КФИ и СФИ, показали следующее. Количество гранулем на единицу площади печени и диаметр гранулем уменьшались в течение эксперимента в обеих группах леченых животных, но темпы снижения были выше у животных, получавших в качестве лечения КФИ (фиг. 1 и 2). За весь период лечения КФИ количество гранулем уменьшилось в 3,2 раза, диаметр гранулем - в 2,2 раза; при лечении СФИ количество гранулем снизилось в 2 раза, диаметр - в 1,7 раза. После 5 месяцев лечения КФИ диаметр гранулем и их количество оказались соответственно на 25% и на 38% меньшими, чем у животных, получавших СФИ. В обеих группах леченых животных эти показатели были значительно ниже, чем в группе контроля.

Проведенные исследования показали, что КФИ обладает большей по сравнению со СФИ антимикобактериальной активностью, которая проявляется в уменьшении размеров и количества гранулем (что свидетельствует о ее большей эффективности в отношении и персистирующего, и циркулирующего пула микобактерий).

3. Сведения, подтверждающие возможность получения технического результата.

Эксперименты, позволяющие провести прямое сравнение предлагаемого препарата с прототипом, не проводили. Поэтому было проведено их косвенное сравнение на основе изучения изоиазид-декстрана-40 [13] и предлагаемого препарата, которое в том и в другом случае осуществлялось параллельно с изучением свободной формы изониазида. Имеющиеся данные позволяют провести сравнение терапевтической эффективности, пролонгированности препаратов и их общей токсичности.

3.1. Терапевтическая эффективность.

В исследованиях изониазид-декстрана-40 через 3 месяца лечения данным препаратом по сравнению с лечением СФИ достоверных различий по количеству и диаметру гранулем не обнаружено. При исследовании предлагаемого препарата в этот период количество гранулем было на 31% меньшим, диаметр - на 20 % меньшим, чем у животных, леченных СФИ. Через 5 месяцев лечения изониазид-декстраном-40 количество гранулем оказалось на 37% меньшим в сравнении с леченными СФИ животными, по диаметру гранулем достоверных различий не обнаружено. При лечении предлагаемым препаратом в этот период наблюдения количество гранулем было на 38% меньшим, диаметр - на 25%, чем у леченных СФИ животных.

Таким образом, терапевтическая эффективность в отношении персистирующих в гранулемах микобактерий, о чем судили по изменению диаметра гранулем в ранние (3 мес) и более поздние (5 мес) сроки лечения, более выражена у предлагаемого препарата.

Терапевтическая эффективность в отношении циркулирующего в крови пула микобактерий, о чем судили по изменению количества гранулем в печени, в ранние сроки лечения также более выражена у предлагаемого препарата.

3.2. Пролонгированность.

Предлагаемый препарат характеризуется большей пролонгированностью действия по сравнению с прототипом. Период полувыведения изониазид-декстрана-40 составляет 3,5 суток, а у предлагаемого препарата период полувыведения составляет 7 суток.

3.3. Общая токсичность.

Изониазид-декстран-40 в 5,5 раза менее токсичен, чем свободный изониазид; предлагаемый же препарат - в 20-22 раза менее токсичен по сравнению со СФИ.

Таким образом, предлагаемый препарат выгодно отличается от изониазид-декстрана-40 по ряду параметров - терапевтической эффективности, по пролонгированности действия и по уровню общей токсичности.

Источники информации

1. Машковский М. Д. Лекарственные средства. В 2-х томах. - Вильнюс. - 1993. - Т. 2. - С. 283-284.

2. Вавилин Г.И., Ильина Т.Е., Рабинович И.М. и др. // О возможности использования полимеров для пролонгированного действия тубазида в эксперименте. - Пробл. туберкулеза. - 1968. - N 4. - С. 74-77.

3. Туркебаева К.А., Шипунова О.В., Кривцова А.Б. и др. // О возможности лечения туберкулеза полимерным изониазидом пролонгированного действия. - Пробл. туберкулеза. - 1990. - N 6. -С. 32-36.

4. Патент N 2087146 на изобретение Шкурупия В.А., Курунова Ю.Н., Черновой Т.Г. "Способ лечения генерализованного туберкулезного процесса в эксперименте".

5. Заявка N 94041109/14 на изобретение Панасенко С.Г., Пупышева А.Б., Курунова Ю. Н. , Шкурупия В.А. "Способ получения конъюгата изониазид-декстран".

6. Хомяков К.П., Вирник А.Д., Ушаков С.Н., Роговин З.А. //Синтез полимерных лекарственных соединений на основе производных декстрана. - Высокомолекулярные соединения. - 1965. - Т. 7. - N 6. - С. 1035-1040.

7. Хомяков К.П., Пененжик М.А., Вирник А.Д. и др. //Синтез диальдегид- и дикарбоксилдекстрана. - Высокомолекулярные соединения. - 1965. - Т. 7. - N 6. - С. 1035-1040.

8. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 645 с.

9. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии и гистологической техники. - М.: Медицина. - 1971. - С. 243-254.

10. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. - Спб.: Наука, 1994. - 400 с.

11. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.

12. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. - М.: Мир, 1975. -326 с.

13. Филимонов П.Н. Морфологические особенности развития хронического диссеминированного воспаления в печени и легких при лечении лизосомотропной пролонгированной формой изониазида /Дис. канд. мед. наук. -Новосибирск. - 1996. - 158 с.