способ качественно-количественного определения содержания белка в биологических растворах

Формула изобретения

Способ качественно-количественного определения содержания белка в биологических растворах, включающий связывание белка с красящим реагентом с последующим учетом содержания белка по изменению окраски исследуемого раствора в сравнении со стандартным раствором белка, отличающийся тем, что исследуемый раствор и стандартный раствор белка раститровывают параллельно на микробиологическом планшете, а учет содержания белка осуществляют визуально в течение 4 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в лабораторной практике для проведения массовых анализов на содержание белка в различных биологических растворах (сыворотка крови, моча, лимфа, иммуноглобулины, бактериальная взвесь).

Качественные и количественные пробы на белок основаны на коагуляции его химическими реактивами или физическими методами.

К наиболее массовым исследованиям относится определение белка в моче. Принцип качественного и количественного определения белка в моче основан на помутнении или выпадении хлопьевидного осадка при воздействии сульфосалициловой кислотой [Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/Под ред. Е.А. Коста.- М.: Медицина, 1975, с. 221-222].

Количественное определение содержания белка проводят по интенсивности коагуляции через 5 мин после реакции исследуемого раствора с кислотой на ФЭК против контроля с помощью калибровочной кривой по стандартному раствору альбумина. В этом анализе жестким требованием является прозрачность мочи, что удлиняет исследования. Необходимость проведения контроля через 5 мин после реакции затрудняет проведение массовых исследований. Способ неприменим к другим биологическим растворам.

Известен способ определения белка в плазме крови с учетом примеси гемоглобина в массовых исследованиях путем последовательной обработки пробы крови водными растворами красной кровяной соли с цианидом калия и бикарбонатом натрия, а затем - биуретовым раствором. Показатели экстинции учитывают последовательно через 15 мин фотометрированием при 545 нм, а белок определяют как разницу между показателями экстинции [Биохимические методы исследования в клинике/Под ред. А.А. Покровского.- М.: Медицина, 1969, с. 61].

Этот способ применим только для плазмы крови.

Известен способ определения белка в биологических растворах путем проведения иммуноферментного анализа [Дзантнев Б.В., Егоров А.М. Ж. ВХО им. Д.И. Менделеева, 1982, т. 27, N 4, с. 82-89].

Сложность способа для организации массовых исследований заключается в необходимости подготовки конъюгата для каждого типа исследуемого раствора, создания оптимальных условий образования комплекса антиген-антитело.

Известен достаточно простой способ качественного определения белка в биологических растворах [a.с. СССР N 1193181, C 01 N 33/43, 23.11.85. Бюл. N 43].

Способ осуществляют путем воздействия на исследуемый раствор реагентом, состоящим из трихлоруксусной кислоты и формалина с последующим учетом помутнения с помощью экрана при освещенности 400-450 лк сверху и 145-155 лк снизу.

Способ неприменим для количественного определения содержания белка.

Наиболее близким по назначению и сущности к заявляемому является способ количественного определения белка в биологических растворах, основанный на изменении окраски при воздействии на него красящего реагента [Bradford М.М., Analitical Biochemistry, v. 72, 1976, p. 248-254]. В качестве красящего реагента используется спиртовой раствор Кумасси C-250 при следующем содержании компонентов на 1 л воды: Кумасси C-250 - 100 мг, этиловый спирт 95% - 50 мл, фосфорная кислота 85%-ная - 100 мл, в соотношении исследуемой биологический раствор к реагенту 1: 8. Краситель в кислоте переходит в лейкооснование, образовывая коллоидный раствор, который при связи с белком изменяет окраску.

Изменение окраски учитывают на спектрофотометре при 595 нм через 2-3 мин после реакции, содержание белка определяют по кривой, построенной заранее по раститрованному альбумину.

Недостатком прототипа является то, что изменение окраски на спектрофотометре необходимо фиксировать в течениe 30 мин, в противном случае из-за выпадения осадка белка с Кумасси показания, снятые прибором, будут недостоверны.

Кроме того, использование данного способа для определения белка в мутных биологических растворах не представляется возможным.

Целью изобретения является разработка универсального, достаточно точного и экспрессного метода определения содержания белка в различных биологических растворах, обеспечивающего организацию массовых анализов и при отсутствии соответствующих приборов.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый раствор и стандартный раствор белка раститровывают параллельно на микробиологическом планшете, белок связывают с красителем и учитывают содержание белка по изменению окраски исследуемого раствора в сравнении со стандартным раствором белка визуально в течениe 4 ч. Учет результатов можно проводить с первых секунд внесения реагента.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Раститровка исследуемого биологического раствора и стандартного раствора белка на микробиологическом планшете обеспечивает возможность единообразного связывания белка с красящим реагентом и достаточную точность учета визуально изменения окраски, исключая необходимость построения стандартной кривой.

Визуальный учет позволяет определить содержание белка в дисперсных растворах, содержащих липиды, клеточные элементы, а также в случае выпадения в осадок белка с красителем, что фотометрически не фиксируется.

Возможность практического использования заявляемого способа иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. В лунках микробиологического планшета на двух рядах последовательно проводят двукратное разведение мочи и раствора альбумина в концентрации 1 мг/мл. Затем в каждую лунку, содержащую 0,1 мл раствора, вносят по 0,1 мл красящего реагента, содержащего в расчете на 1 л 100 мг красителя Кумасси C-250, 50 мл 95%-ного этилового спирта и 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты. После внесения реагента планшет встряхивают с целью лучшего перемешивания проб с реагентом и проводят учет результатов.

Визуальный учет определения концентрации белка в исследуемой моче проводится сопоставлением интенсивности окраски разведений мочи с окраской раститрованного альбумина. Количество белка в моче соответствует количеству белка в разведенной пробе альбумина, наиболее сходной по окраске. Визуальные показатели: при содержании белка более 12 мкг/мл - окраска синяя, до 8 мкг/мл - слабо-синяя, до 3 мкг/мл - следы синей, до 0,5 мкг/мл под увеличением в 20 раз - синий осадок через 4 ч. Отсутствие белка - желто-зеленая окраска. Окраска белка в растворах стабильна и сохраняется в течение нескольких суток (3-4) до высыхания пробы.

Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве исследуемого раствора применяют сыворотку крови. При этом визуально синяя окраска регистрируется при содержании белка более 12 мкг/мл, слабо-синяя - от 12 до 8 мкг/мл, следы синей - от 8 до 3 мкг/мл, синий осадок - от 3 до 0,5 мкг/мл определяется через 4 ч под увеличением в 20 раз. Полученные результаты соответствуют результатам определения белка в моче.

Пример 3. Осуществляется аналогично примерам 1 и 2, за исключением того, что в качестве исследуемого раствора применяют бактериальную взвесь. Учет результатов ведется исключительно визуально, так как изначальная мутность раствора не предполагает использования приборов. После внесения красящего реагента в пробу сразу появляется окрашивание: при содержании белка более 12 мкг/мл - синяя, от 12 до 8 мкг/мл - слабо-синяя, от 8 до 3 мкг/мл - следы синей, от 3 до 0,5 мкг/мл под увеличением в 20 раз через 4 ч - синий хлопьевидный осадок. Полученные результаты при определении концентрации белка в бактериальных взвесях соответствуют результатам, полученным при определении концентраций белка в других биологических растворах, представленных в примерах 1 и 2.

Таким образом, преимуществом заявляемого способа по сравнению с известными аналогами является достаточно точное и простое определение содержания белка в биологических растворах, в том числе дисперсных, содержащих липиды и клеточные элементы. Представляется перспективным его использование в лабораторной практике, особенно при массовых исследованиях.