способ получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого

Формула изобретения

Способ получения высокоактивного сырья из кадаверного головного мозга для изготовления тромбопластина растворимого, включающий водную экстракцию целевого продукта, отличающийся тем, что гомогенат серого вещества двукратно замораживают при минус 40^oC и оттаивают при +36^oC, экстракцию проводят равным объемом очищенной воды, центрифугируют при 600 g и температуре +5^oC в течение 30 мин, супернатант отделяют, к осадку добавляют такой же объем очищенной воды и центрифугируют в том же режиме, полученные надосадочные жидкости смешивают, получая супернатант с высокой тромбопластиновой активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина растворимого, используемого при определении активности протромбинового комплекса в одностадийном тесте Квика.

В настоящее время существуют многочисленные модификации метода, затрудняющие получение сравнимых результатов. Одной из основных причин этого является использование тромбопластинов разного качества. Зарубежные фирмы выпускают лиофилизированные полные тромбопластины (Международные, Национальные), однако технология их изготовления в большинстве своем запатентована (реагенты фирм Boehringer Mannheim, Dade, Sigma, Organon teknika, George king bio-medical, Hospitex diagnostics. Human, Grifols, Biomerieux).

В качестве прототипа нами использован патент 1775897 Кулене В.В, Стрейкувене И.К, Синкувене Д.С, Герасимене Г.Б. и соавторов на "Способ получения диагностического агента для определения протромбинового времени". Существенным недостатком прототипа является то, что в качестве сырья берут все ткани кадаверного головного мозга, многие из которых (белое вещество, кровеносные сосуды) отличаются низкой тромбопластиновой активностью. Обработка ацетоном, включенная в технологический процесс, может существенно влиять на специфичность конечного продукта, а дезинтегрирование и фильтрация сырья, проводимые с целью получения тромбопластиновых везикул оптимальной величины, являются длительными и трудоемкими, требующими специального оборудования.

Целью настоящего изобретения является получение высокоактивного сырья из серого вещества кадаверного головного мозга как ткани, обладающей наибольшей активностью, которое необходимо для изготовления тромбопластина полного растворимого, также обладающего высокой активностью.

Поставленная цель достигается тем, что используют смесь серого вещества головного мозга от 5-6 трупов и сокращают время хранения сырья. Температура хранения сырья до обработки не должна превышать минус 40^oC. Проводят двукратную заморозку при минус 40^oC и последующую оттайку при +36^oC. Серое вещество измельчают в миксере, получают грубую смесь и проводят экстракцию ее очищенной водой при +36 и центрифугирование при 600 g и температуре +5^oC в течение 30 мин. При этом удаляются нерастворимые частицы и получается сырье для растворимой формы тромбопластина, которая более удобна и проста в применении. Отделившийся супернатант, содержащий активные тромбопластиновые везикулы, переносят в стеклянный стакан, а оставшийся осадок разводят таким же объемом очищенной воды и повторно центрифугируют при том же режиме; супернатант также отделяют. Полученные надосадочные жидкости смешивают и тестируют, проводя контроль pH и активности (в секундах) в тесте Квика с контрольной плазмой (смеси свежей донорской плазмы не менее 10 человек). Если значения pH находятся в пределах 6,5-8,0, а активность не превышает 15 с, то супернатант подготавливают к сублимации.

Оптимальное время хранения сырья до сублимации, в течение которого сохраняется высокая активность, не должно превышать 3 недель.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА

Высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого получают следующим образом: отделяют серое вещество кадаверного головного мозга и измельчают в миксере в течение 10 мин до получения грубой гомогенной смеси. Ее разливают во флаконы вместимостью 250 мл по 50 мл в каждый, затем замораживают до минус 40^oC. После заморозки тотчас проводят оттайку при +36^oC и снова замораживают при той же температуре. Повторно размороженную смесь разводят равным объемом очищенной воды, тщательно перемешивают и центрифугируют при 600 g и температуре +5^oC в течение 30 мин. Супернатант отделяют, а к оставшемуся осадку снова добавляют такой же объем очищенной воды и повторно центрифугируют в том же режиме. Супернатант снимают, перемешивают с ранее полученным и проверяют pH и активность протромбинового комплекса с контрольной плазмой. Если полученные значения удовлетворяют требованиям, то смесь готовят к сублимации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

(проведены на базе лаборатории биохимии крови Кировского НИИ гематологии и переливания крови.)

Разработанный способ использован при изготовлении сырья для 7 серий реактива. Результаты приведены в таблице 1. Они свидетельствуют о том, что полученное сырье имеет высокую активность, равную 14,7-15,2 с.

Таким образом, разработанный способ позволяет получить высокоактивное сырье для изготовления тромбопластина растворимого, необходимого для включения в наборы реактивов, используемых при определении протромбинового комплекса в методе Квика. Разработанный способ найдет применение при создании производственной технологии изготовления тромбопластина растворимого, который наиболее удобен и прост при использовании в клинико-диагностических и специализированных лабораториях.