плазмида pcdt, способ ее получения и применение

Формула изобретения

1. Плазмида pcDT, направляющая синтез А - субъединицы токсина дифтерии, в зараженных вирусом гепатита С (HCV) клетках млекопитающего и содержащая ДНК-последовательности, представленные на чертеже, кодирующие псевдо HCV <<->> РНК.

2. Способ конструирования плазмиды pcDT по п.1, включающий введение в исходную плазмиду pSV3-neo ДНК-последовательности между сайтами Hind III и Eco R1, составленной из трех фрагментов: Nco 1-Hind III, Xma 1 - Eco R1 и Xma1 - Nco1, представленных на рис.1.

3. Способ получения псевдо HCV <<->> РНК, заключающийся в том, что фрагмент плазмиды pcDT Hind III - Eco R1 амплифицируют в полимеразной цепной реакции с термополимеразой Pwo II и олигонуклеотидными праймерами: прямым (F_cDT) 5"-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGACAGCTGGGCGG-A-3" и обратным (R_cDT) 5"TTCACGCAGAAAGCGTCTA-3", а затем продукт ПЦР транскрибируют in vitro с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для селективного уничтожения клеток, зараженных вирусом гепатита С (HCV) или его инфекционной РНК.

Известно, что геномная РНК вируса гепатита С размножается при помощи комплементарной HCV-специфической <<->> РНК (A.A. Khromykh, М.Т. Kenney, E. G. Westaway. Trans-Complementation of Flavivirus RNA Polymerase Gene NS5 by Using Kunjin Virus Replicon-Expressing BHK Cells. J. Virology, 1998, v. 72, N 9, p. p. 7270-7279). Оба типа реакции репликации ведет HCV-специфическая РНК-полимераза, которая узнает консервативные 5"- и 3"- последовательности в геномной и комплементарной РНК (Kolykhalov А.А., Feinstone S.M., Rice С.М. Identification of a hingly conserved sequence element at the 3 terminus of hepatitis С virus genome RNA. J. Virol. 1996, v. 70, p.p. 3363-3371).

Все усилия по созданию ДНК-вакцин направлены на решение двух задач: экспрессирующих либо HCV-специфические антигены, либо образование анти-HCV рибозимов. Однако, изменчивость геномной РНК в процессе ее репликации ограничивает возможности этих двух решений.

Задачей настоящего изобретения является создание плазмиды, с помощью которой можно селективно уничтожить клетки, зараженные геномной РНК вируса гепатита С (HCV).

Поставленная задача решается путем создания плазмиды, названной нами pcDT, которая отличается от исходной плазмиды pSV3-nео встроенной в ее полилинкер последовательностью. При транскрипции встроенной последовательности не транслируемая РНК (псевдо HCV <<->> РНК). Однако, в случае зараженной HCV клетки, псевдо HCV <<->> РНК, из-за 5"- и 3"-концевых HCV-специфических последовательностей, способна служить матрицей для синтеза комплементарной РНК (псевдо HCV <<+>> РНК). Псевдо HCV <<+>> РНК транслируется также эффективно, как геномная РНК <<+>> HCV, но в результате ее трансляции, образуется фермент АДФ-рибозил трансфераза. Активности единственной молекулы этого фермента достаточно, чтобы убить зараженную вирусом гепатита С клетку.

Способ конструирования плазмиды pcDT заключается в том, что в исходную плазмиду pSV3-neo между сайтами рестрикции HindIII и EcoRI была встроена последовательность ДНК, составленная из трех фрагментов: HindIII - Ncol и Xmal - EcoRI, а также Ncol - Xmal. Фрагменты представляли собой соответственно 5"- и 3"- концевые HCV- специфические последовательности и структурный ген А-субъединицы дифтерийного токсина. Полная нуклеотидная последовательность HindIII - EcoRI фрагмента показана на чертеже.

Для получения псевдо HCV <<->> РНК in vitro последовательность ДНК, встроенную в pSV3-neo, амплифицировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью "безошибочной" термополимеразы Pwo II и праймеров, позволяющих в последствии транскрибировать продукт ПЦР (ампликон) РНК - полимеразой бактериофага Т7.

Полученную in vitro псевдо HCV <<->> РНК смешивали с инфекционной РНК <<->> HCV и вводили методом электропорации в клетки линий Нер-2 или переживающие гепатоциты человека. Эффективность анти- HCV действия ДНК конструкции определяли после ее введения в состав ретровирусного вектора и последующей трансформации полученным вектором клеток линии Нер-2. После селекции клонов стабильно наследующих ретровирусный вектор pSV3-neo с ДНК- конструкцией, в клетки методом электропорации вводили инфекционную РНК HCV.

Во всех случаях в течение 7 дней контролировали образование РНК HCV специфического антигена и амплификацию РНК в клетках и в среде. Ни в клетках, ни в среде инкубации не обнаружили инфекционных РНК HCV.

Таким образом, предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества: во-первых, обеспечивается селективное уничтожение клеток, зараженных геномной РНК вируса гепатита С (HCV); во-вторых, псевдо HCV <<->> РНК находится в составе ретровирусного вектора, что обеспечивает интеграцию конструкции в геном клеток и ее эксперссию; в-третьих, псевдо HCV <<->> РНК не способна к трансляции.

Сущность изобретения поясняется на следующем примере.

Пример, использования плазмиды p-cDT, кодирующей псевдо HCV <<->> РНК.

1. В ПЦР с термополимеразой Pwo II, двумя олигонуклеотидными праймерами (5"-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGACAGCTGGGCGG-A - 3" и 5"-TTCACGCAGAAAGCGTCTA - 3") и матрицей ДНК плазмиды p-cDT.

2. Выделенный ампликон использовали для его транскрипции РНК-полимеразой бактериофага Т7.

3. Полученную РНК методом электропорации вводили в клетки линии Нер-2.

4. Через 24 ч после электропорации в клетках начинали определять дифтерийный токсин. Токсин определяли в течение 120 часов после электропорации.

5. Полученную РНК смешивали с инфекционной РНК HCV и методом электропорации вводили в клетки линии Нер-2.

6. Через 6 ч после электропорации в клетках начинали определять HCV-специфические антигены и РНК, а также дифтерийный токсин.

7. Контроли показали, что за 10 ч до первых морфологических признаков гибели клеток от действия дифтерийного токсина, методом твердофазного ИФА определяется сам токсин.

8. Четкие морфологические признаки гибели клеток наблюдали через 18 ч после электропорации.

Предлагаемая генно-инженерная конструкция позволяет селективно уничтожить клетки, зараженные вирусом гепатита С.