способ получения рецепторов лактогенных гормонов

Формула изобретения

Способ получения рецепторов лактогенных гормонов, включающий выделение жировых глобул молока центрифугированием, отличающийся тем, что жировые глобулы молока обрабатывают детергентом Тритоном Х-100, полученный солюбилизат мембран жировых глобул молока очищают, рецепторы выделяют с помощью аффинной хроматографии на активированном сорбенте, в качестве которого используют пролактин, иммобилизованный на эпоксиактивированном TSK-геле, полученный в результате инкубации при рН буфера от 7,4 до 9,0.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биологии, к исследованию материалов путем разделения на компоненты с использованием хроматографии, в частности к способам выделения рецепторов гормонов с помощью обычной жидкостной и аффинной хроматографии высокого давления из компонентов молочных продуктов.

Известны способы выделения рецепторов лактогенных гормонов из органов животных, основанные на экстракции белковых фракций, в частности, из амниотической жидкости и из гипофиза животных. Однако эти способы требуют большого количества исходного материала, трудоемкой препаративной очистки, сложного процесса экстрагирования.

Наиболее близким к заявленному решению является способ определения концентрации рецепторов лактогенных гормонов (авторское свидетельство N 1751665 от 30.07.92 г. авторов Лариной М.М. и Федосимова В.А.).

Суть способа - прототипа заключается в следующем: мембраны жировых шариков, содержащие рецепторы лактогенных гормонов, выделяют из молока коров и подвергают рецепторному анализу путем инкубации этих мембран с меченым I¹²⁵ пролактином и нативным пролактином в инкубационном буфере.

Затем мембраны отделяют от буфера путем центрифугирования и определяют количество связанного с рецепторами меченого пролактина по радиоактивности проб.

Константу диссоциации и концентрацию рецепторов лактогенных гормонов определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы "Дельта", разработанной в МГУ для двухцентровой модели связывания).

Недостатком прототипа является то, что выделенные рецепторы лактогенных гормонов связаны с мембранами жировых глобул молока, что не обеспечивает чистоту полученных рецепторов гормонов. Это обстоятельство, в свою очередь, позволяет проводить с рецепторами только количественный анализ и не позволяет исследовать их физико-химические и биологические свойства.

Кроме того, известный способ включает применение рецепторного анализа - трудоемкого, дорогостоящего и связанного с радиоактивными препаратами.

Целью заявленного решения является повышение эффективности способа.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе для иммобилизации пролактина используют активированный сорбент - эпоксиактивированный TSK-гель, а инкубацию проводят в течение 2-х часов при температуре 25^oC и pH буфера от 7.4 до 9.0.

Заявленный способ позволяет получать рецепторы лактогенных гормонов в чистом виде и использовать их в научных и медико-биологических исследованиях физиологии и биохимии лактогенной функции организма.

Сущность заявленного способа заключается в следующем: из молока различных видов животных выделяют жировые глобулы и тщательно их промывают. Мембраны жировых глобул солюбилизируют с помощью детергента Тритона X-100. Из полученного солюбилизата с помощью аффинной хроматографии выделяют лактогенные рецепторы в чистом виде. Раствор рецепторов концентрируется, затем проводится исследование физико-химических и биологических свойств рецепторов для данного вида и данной особи с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХВД) (фиг. 1).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение и обработка жировых глобул молока.

Свежее молоко фильтруют через ватные фильтры. Из фильтрованного молока выделяют жировые глобулы путем центрифугирования в течение 40 мин при 10^oC при 3000 об/мин. Выделенные жировые глобулы промывают теплой водой, дозируют по порциям и помещают на хранение в холодильник при -40^oC.

2. Солюбилизация мембран жировых глобул молока (МЖГМ).

Солюбилизацию МЖГМ выполняют с помощью детергента Тритона X-100: в замороженные жировые глобулы добавляют необходимое количество 1%-ного Тритона X-100 в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4.

Эмульсионную смесь жировых глобул инкубируют в растворе детергента при постоянном помешивании в течение 3 часов при 30^oC.

После инкубации солюбилизат, содержащий остатки мембран и выделившийся жир, центрифугируют 1 час при 0^oC при 3000 об/мин. Затем плотный слой жира удаляют из центрифужных стаканов, а солюбилизат фильтруют через обычные фильтры для удаления оставшихся кусочков жира, далее - через микрофильтры - для очистки от крупных мицелл казеина и остатков мембран жировых глобул.

3. Освобождение солюбилизата от Тритона X-100.

Известно, что детергент Тритон X-100 вызывает комплексообразование основного лактогенного гормона - пролактина.

Для очистки солюбилизата от Тритона X-100 авторы предлагают использовать очень простую ячейку, заполненную сорбентом TSK HW-40 (фиг. 2). Ячейка предварительно промывается буфером (0.04 М фосфатный буфер с pH 7.4, содержащим 0.1% альбумина). Буфер удаляется полностью из ячеек центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин.

После удаления буфера в ячейки вносят порции солюбилизата и снова центрифугируют при тех же условиях. Каждая ячейка способна полностью очистить от 1%-ного Тритона X-100 30 мл солюбилизата. Одновременно применение 4 ячеек в центрифуге K-70 позволяет очистить от детергента 120 мл солюбилизата.

Исследование адсорбции Тритона X-100 показало, что при соотношении солюбилизата, содержащего 1% Тритона X-100, и геля TSK HW-40 1:3 по объему прохождения Тритона X-100 через ячейки ничтожно мало и составляет 1.4% и менее от исходного количества.

Очищенный солюбилизат из МЖГМ помещают на хранение в морозильник при -20^oC.

4. Очистка рецепторов лактогенных гормонов.

Очистку рецепторов лактогенных гормонов, выделенных из МЖГМ, от различных компонентов мембран белковой и небелковой природы проводят с помощью аффинной хроматографии. Для ее осуществления авторы предлагают использовать реакционноспособный сорбент, содержащий в качестве активных групп эпоксидные циклы и полученный путем привитой сополимеризации TSK HW-65 геля с глицидилметакрилатом.

Привитая сополимеризация геля осуществляется в окислительно-восстановительной среде в присутствии солей церийаммонийнитрата - Ce(NH₄)₂(NO₃)₆, которые инициируют привитую сополимеризацию.

5. Иммобилизация пролактина на активированном сорбенте - эпоксиактивированном TSK-геле.

Известно, что во время присоединения лигандов к активированному сорбенту эпоксидные группы реагируют с аминогруппами лигандов, образуя ковалентные связи. Степень присоединения определяется первичными аминогруппами лиганда и зависит от pH, состава буфера, температуры и времени инкубации.

Кроме того, присоединение определенного белка зависит в какой-то степени и от свойств этого белка.

В процессе исследований авторами установлены оптимальные значения этих параметров: pH, состава буфера, температуры и времени инкубации для адсорбции пролактина с активированным сорбентом.

В заявленном способе авторы предлагают использовать говяжий пролактин (производство фирмы "Гормон", Москва) с активностью 20 МЕ. В качестве инкубационного буфера предлагается 0.5 М Na₂CO₃. Инкубацию сорбента с пролактином проводят при перемешивании при 25^oC. Оптимальные условия связывания пролактина обеспечиваются в буфере с pH 9.0 при 25^oC в течение 2-х часов инкубации. Данные опытов приведены на фиг. 3.

При этих условиях связывается с гелем 51% содержащегося в инкубационном буфере пролактина.

При увеличении времени инкубации до 4 часов при 25^oC количество связанного пролактина увеличивается до 58%.

Поскольку некоторое количество активированных групп в сорбенте остаются свободными и после присоединения лигандов, эти группы обычно блокируют избытком первичного амина - этоколамина, глицина, глюкозамина и др. Авторы предлагают использовать для этой цели 10%-ный раствор трис-OH в 0.5 М Na₂CO₃, pH 9.00. Инкубацию трис-OH буфера с сорбентом проводят при 25^oC в течение 3 часов при постоянном помешивании. Затем сорбент промывают.

Промытый сорбент с иммобилизированным пролактином используют для опытов или помещают на хранение в холодильник при 4^oC в 0.5 М растворе NaCl.

Для связывания рецепторов ЛГ с иммобилизированным на эпоксиактивированном TSK-геле пролактином сорбент инкубируют с солюбилизатом из МЖГМ в течение 18 часов при 25^oC в 0.04 М фосфатном буфере с pH 7.4. Затем сорбент переносят в стеклянные фильтры Шотта и тщательно промывают водой, буфером и окончательно еще раз водой.

Десорбцию рецепторов с комплексом ПРЛ-рецептор выполняют с помощью 0.05 М раствора ацетата аммония (NH₄CH₃COO), pH 4.2, содержащего 0.1% Тритона X-100.

Сорбент с иммобилизированным на его поверхности комплексом ПРЛ-рецептор инкубируют в растворе ацетата аммония в течение 1 часа при 25^oC. Затем смесь сорбента с раствором переносят в специальные ячейки (фиг. 2) с TSK HW-40 гелем и центрифугируют. При этой операции раствор с десорбированными с комплекса рецепторами ЛГ освобождается от Тритона X-100.

Очищенные с помощью аффинной хроматографии рецепторы ЛГ имеют в растворе очень низкую концентрацию, которая находится за пределами чувствительности УФ-детектора. Авторы предлагают концентрировать растворы, в содержащие рецепторы ЛГ, с помощью эмирсионных фильтров CX-10 (Millipore). Один фильтр CX-10 способен отфильтровать 20 мл жидкости за 6-7 часов. Авторами выполнено концентрирование раствора рецепторов в 20 раз.

На фиг. 4 представлена хроматограмма очищенных и сконцентрированных рецепторов ЛГ из МЖГМ. На хроматограмме четко видны три пика. Первый пик проходит в свободном объеме гельфильтрующей колонки (TSK SW 4000) и имеет молекулярный вес не менее 2000 КД. Очевидно, этот пик представляет собой рецепторные кластеры, солюбилизированные с МЖГМ.

Второй пик на хроматограмме имеет кажущейся молекулярный вес 56 КД и представляет собой мономерную форму рецептора ЛГ.

Третий пик на хроматограмме представляет собой продукты распада рецепторов ЛГ с молекулярным весом менее 10 КД.

Таким образом, осуществляется контроль качества полученных рецепторов.

Список использованной литературы

1. Описание изобретения к А.С. N 1751665 авторов: Лариной М.М. и Федосимова В.А. на "Способ определения концентрации лактогенных рецепторов".

2. Biol Chem. Hoppe - Seyler, vol. 374, pp. 271-279, 1993. Johrke, B. Kruger, T.Viengutz, The Celycolylation as Source of the Variability in prolactin Patterns of Jnolividl al Human Amniotic Fluids.