оральная химическая вакцина против холеры

Формула изобретения

Оральная химическая вакцина против холеры, содержащая анатоксин холерогена и О-антиген из штамма Vibrio cholerae 569B Инаба, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигенный иммуногенный комплекс, полученный при культивировании штамма Vibrio holerae 0139 серовара, состоящий из основного соматического О-антигена липополисахаридной природы 0139 серовара с молекулярной массой 1000 кД, гликопротеидов капсулы 0139 серовара с молекулярной массой 600 кД, белковых экзоферментов 0139 серовара с молекулярной массой 100 - 200 кД, и, при необходимости - наполнитель для таблеток или капсул.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству бакпрепаратов для специфической профилактики холеры, вызванной эпидемически значимыми штаммами НАГ вибрионов 0139 серовара.

В 1992-93 г. впервые в истории пандемии холеры в Индии и Бангладеш, а затем и в других странах Южной Азии возникла крупная эпидемия холеры, охватившая десятки тысяч случаев заболеваний со значительной смертностью, возбудителем которой был новый штамм Vibrio cholerae не 01 серовара, а обозначенный как 0139. Этот штамм продуцировал in vivo токсин, аналогичный Vibrio cholerae 01 серовара, и вызывал клинически, патогенетически и эпидемиологически типичную холеру (Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Мишанькин Б.Н. и др. Случай завоза на территорию России холеры, вызванной новым сероваром // ЖМЭИ. -1995.-N2 (Приложение). -С. 97-101).

Штаммы V. cholerae 0139 серовара продуцируют также полисахаридную капсулу, которая вносит вклад в случаи септицемии, описанные с этой серогруппой. Известно, что капсульный полисахарид помогает адгезии к эпителиальным клеткам, играет роль в иммуногенезе (Hisatsune К., Kondo S., Issuki Y., lguchi Т. , Kavamota Y., Shimada T. / Biochem.-Biophys.-Res.-Commun. 1993, N 196(3). P. 1309-15; Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.G. / Eur. J. Biochem., 1995, N 233(2). P. 391-6).

В то же время перекрестного иммунитета с типичными возбудителями холеры 01 серовара не создается, в связи с этим ВОЗ дала заключение о непригодности существующих коммерческих холерных вакцин, изготовленных из штаммов V. cholerae 01 серовара для защиты от заражения штаммами V. cholerae 0139 серовара и важности создания оральной вакцины против штаммов данного серовара (Weekly epidemiological record, N 24, 1998).

Имеются сообщения о конструировании потенциально вакцинных штаммов для создания живой вакцины против штаммов 0139 серовара: парентеральная иммунизация кроликов рекомбинантным штаммом индуцировала высокие титры антител против ЛПС и капсульного полисахарида (Infection and Immunity, 1996. Vol. 64, N 9).

Наиболее близким аналогом к заявляемой вакцине является химическая вакцина, состоящая из анатоксина холерогена вместе с О-антигеном серовара Инаба. Способ ее производства заключается в последовательном фракционировании сульфатом аммония из культуральной жидкости штамма Инаба соматического О-антигена Инаба между 0,2 и 0,35 насыщения и анатоксина холерогена между 0,35-0,8 насыщения с последующей диализацией, лиофилизацией и конструированием таблетированного препарата с нанесением кислотоустойчивого покрытия в таблетки, содержащие 100000 ЕС анатоксина и 1000 усл. ед. О-антигена Инаба (обратный титр РПГА) (патент России N 2076734, A 61 K 39/00).

Данная вакцина создает специфическую защиту от заражения холерными вибрионами 01 серовара, однако не оказывает защитного действия против штаммов 0139 серовара, как и все другие известные противохолерные вакцины.

Задачей изобретения является создание оральной химической вакцины, защищающей от эпидемически опасного штамма холерного вибриона 0139 серовара.

Сущность изобретения заключается в том, что в состав оральной химической вакцины против холеры, содержащей анатоксин холерогена и О-антиген из штамма V. cholerae 569В Инаба, дополнительно введен антигенный иммуногенный комплекс, полученный из культуральной жидкости штамма V. cholerae 0139 серовара, состоящий из основного соматического О-антигена липополисахаридной природы 0139 серовара с мол. массой 1000 кД, гликопротеидной капсулы 0139 серовара с мол. массой 600 кД, белковых экзоферментов 0139 серовара (нейраминидазы, фосфолипазы, липазы, протеазы) с мол. массой 100-200 кД. При необходимости заявляемая вакцина содержит наполнитель для таблеток или капсул.

Заявляемая вакцина представляет собой бивалентную вакцину, состоящую из анатоксина холерогена, являющегося общим антигеном для сероваров 01 и 0139 и О-антигена штамма 0139 серовара, специфического для представителей 0139 серовара. Кроме того, заявляемая вакцина имеет в своем составе О-антиген Инаба, который повышает иммунологическую активность вакцины, сорбируется на анатоксине холерогена и удаление его снижает выход и активность препарата.

Заявляемое изобретение будет представлено с помощью чертежа с графиком, иллюстрирующим инфракрасный спектр О-антигена, входящего в заявляемую вакцину, и таблиц 1-3, где в табл. 1 представлены сравнительные данные состава культуральной жидкости штаммов холерного вибриона 01 и 0139 сероваров путем ультрафильтрации через мембраны амикон; в табл. 2 представлены результаты выделения О-антигенов штаммов-продуцентов 01 и 0139 сероваров из культуральной жидкости; в табл. 3 представлен химический состав и серологические свойства фракции, выделенной из штамма 0139 серовара.

Признаки, отличающие заявляемую вакцину, заключаются в особенности строения О-антигена штамма 0139 серовара, его меньшей молекулярной массе и наличии гликопротеидной капсулы. В табл. 1 для сравнения представлен состав культуральной жидкости штаммов холерного вибриона 01 серовара (наиболее близкого аналога) и 0139 серовара. Как видно, 100% О-антигена у штамма 01 серовара было задержано на высокомолекулярных мембранах (300ХМ и 100ХМ), т.е. имел мол. массу более 100 кД, тогда как у штамма 0139 серовара основная масса О-антигена была задержана на мембране 50РМ, т.е. мол. масса ниже. Для получения О-антигена 0139 штамма был использован иной путь осаждения, интервал фракционирования составил 20-80%, а не 50-80%, как для 01 серовара (табл. 2).

В результате медико-биологические свойства заявляемой вакцины отличаются от свойств наиболее близкого аналога.

1. Для получения заявляемой вакцины фракционирование О-антигена ведут в интервале 0,2-0,8 насыщения, так как учитывается молекулярная масса препарата.

2. Полученный компонент вакцины содержит значительное количество 3,6-дидезоксигексозы, что свидетельствует о наличии капсулы и не характерно для штаммов 01 серовара холерного вибриона.

Способ получения заявляемой вакцины.

В качестве продуцента оральной холерной химической вакцины используют штаммы холерного вибриона 0139 серовара (например, М045, Р16064 и подобные им). Для второго компонента вакцины, содержащего анатоксин холерогена и О-антиген Инаба в качестве продуцента применяют токсигенный штамм холерного вибриона 01 серовара (например, 569В и др.) и получают данный компонент вакцины в соответствии со способом, изложенным в патенте России N 2076734, A 61 K 39/00.

Холерный вибрион 0139 серовара выращивают при температуре 37^oC в реакторе на среде из ферментативного гидролизата казеина (pH 8,0, 200 мг% аминного азота, Na₂HPO₄ - 0,05%, NaCl - 0,5%) в условиях глубинного культивирования с подкормкой глюкозой и аммиаком. В стационарной фазе роста (10-11 ч выращивания), когда концентрация микробных тел, достигнув 70-80 млрд. в мл, оставалась постоянной в течение 3 часов, выращивание прекращают добавлением 0,6% - 0,2% формалина. Содержание растворенного в культуральной жидкости О-антигена в это время по реакции диффузионной преципитации с О-сывороткой составляет 4-8 усл. ед. (обратный титр реакции диффузионной преципитации в геле). Убитые микробные тела через 12 ч отделяют центрифугированием при 15000 об/мин, а надосадочную жидкость выдерживают 30 сут при температуре (10-12)^oC для снижения токсичности О-антигена. После этого приступают к выделению О-антигена из культуральной жидкости. В реактор-осадитель на первом этапе добавляют сульфат аммония до 0,2 насыщения (152 г соли на 1 л), перемешивают, оставляют на 18-20 ч при 18-22^oC и центрифугируют на СГО-100 при 8000 об/мин. Образовавшийся осадок балластной фракции отбрасывают и вновь добавляют сульфат аммония до 0,8 насыщения (456 г соли на 1 л). После центрифугирования осадок диализуют против воды. Раствор О-антигена разводят дистиллированной водой (в среднем до объема 4-5 л), разливают в стерильные емкости по 250 мл и проводят стерилизацию текучим паром в течение 30 мин или добавлением мертиолята натрия в концентрации 1:10000 - 1:20000. В дальнейшем жидкий препарат лиофильно высушивают и используют для конструирования таблетированной вакцины.

Химический состав и серологические свойства фракции, выделенной из штамма 0139 представлены в табл. 3.

Анализ инфракрасного спектра препарата 0139, регистрацию которого проводили в границах 400-4000 см^-1 (фиг.1), позволил выявить в препаратах полосы поглощения, характерные для полисахаридов (область спектра от 700 до 1450 см^-1). Имеется также полоса поглощения 1540 см^-1, принадлежащая деформационным колебаниям связей NH в белках. У препарата выражена полоса поглощения 1740 см^-1, находящаяся на плече интенсивной полосы 1670 см^-1, связанная с наличием липидов. В области 2800-3000 см^-1 четко выделяются полосы валентных колебаний CH₂ групп жирных кислот. Таким образом, данные ИК-спектроскопии препаратов коррелировали с результатами химического анализа и подтверждают липополисахаридную природу полученного препарата.

Моносахаридный состав данного препарата, изученный методом тонкослойной хроматографии, был представлен галактозой, глюкозой, маннозой, рибозой и 3,6-дидезоксигексозой, предположительно являющимся компонентом капсульного полисахарида.

Содержание экзоферментов во фракции составляло: 32 ед./мг протеиназы и 410 ед. /мг фосфолипазы. Токсичность препарата по LD₅₀ для белых мышей, составлявшая в среднем при подкожном введении 1,2 мг, была вдвое ниже, чем у коммерческой оральной вакцины из штамма 01 серовара. Иммуногенность этого препарата, его ED₅₀ для белых мышей при заражении 100 dсl штамма 0139 составляла 3-5 мкг, что соответствовало защитной способности коммерческой вакцины против заражения штаммами холерного вибриона 01 серовара.

Вакцина содержит в 1 таблетке 100000 ЕС холерного анатоксина, 1000 усл. ед. О-антигена 139 серовара, 1000 усл. ед. Инаба (обратные титры РПГА и РИД), наполнитель (крахмал, сахар, стеарат кальция, тальк), покрыта кислоторезистентной оболочкой (возможно использование капсул).