способ получения иммуноглобулинового препарата

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем солевой экстракции спиртового осадка сыворотки крови, очистки его от липопротеидов с последующим выделением целевого продукта, добавлением стабилизатора, содержащего глюкозу, стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулинов проводят спиртовым осаждением, в качестве стабилизатора используют смесь глицина и глюкозы в соотношении (1 - 1,5) : 1, обрабатывают раствор иммуноглобулинов сорбентами из стекла, на стадии выделения целевого продукта проводят проточно-зональное центрифугирование, а перед стерилизующей фильтрацией пропускают раствор иммуноглобулина через пористый стеклянный фильтр.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата, защищенный патентом SU 1767742, кл. А 61 K 37/04, опубликованного 11.06.90.

Способ заключается в получении препарата путем обработки осадка Б буферным раствором, отделения образовавшегося осадка и очистки иммуноглобулинов растворением осадка в 0,05 М ацетатном буфере, pH 4,3 и обработкой каприлатом натрия до конечной концентрации 0,5%, pH 4,8, осаждении иммуноглобулинов спиртом, добавлении 0,15 М глицина и 2% сахарозы, проведении стерилизующей фильтрации и добавлении пектина в концентрации 0,3-0,5 г на 1 г иммуноглобулина.

Недостатком известного способа является наличие примесей каприлата натрия в конечном продукте и нестабильность получаемого раствора иммуноглобулина, способного храниться после стерильной фильтрации до розлива не более 10 ч.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ получения иммуноглобулинового препарата (КИП) из осадка Б (III фракция Кона) (патент RU 2060034, кл. А 61 K 39/395, опубликован 06.09.91)

Способ предусматривает солевую экстракцию спиртового осадка Б сыворотки крови (III фракция Кона) в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Очистку от липопротеидов экстракта осадка Б ведут хлороформом (10% по объему) с последующим осаждением иммуноглобулиновой фракции в присутствии 12% полиэтиленгликоля. Полученный осадок иммуноглобулинов разводят в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, центрифугируют для удаления нерастворимых примесей. К раствору после центрифугирования добавляют глюкозу до конечной концентрации 2% и подвергают стерилизующей фильтрации.

Недостатком способа является то, что он предусматривает получение препарата, содержащего нежелательные примеси остаточного полиэтиленгликоля. Кроме того, полученный раствор иммуноглобулинов содержит значительные количества фибриногена и фибрина, соосаждающихся с иммуноглобулинами. Данные примеси существенно затрудняют стерилизующую фильтрацию и обуславливают нестабильность препарата при хранении в жидком виде. Следствием этого является необходимость немедленного розлива и лиофильного высушивания после фильтрации. Потери в конечном выходе препарата из-за затрудненной фильтрации и необходимости повторного проведения этой процедуры достигают 30%.

Задача, решаемая предлагаемым изобретением - получение иммуноглобулинового препарата, свободного от примесей нестабильных компонентов, затрудняющих фильтрацию.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении выхода целевого продукта и снижении его себестоимости.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения иммуноглобулинового препарата из крови человека путем солевой экстракции спиртового осадка сыворотки крови, очистки его от липопротеидов с последующим выделением целевого продукта, добавлением стабилизатора, содержащего глюкозу, стерилизующей фильтрации выделение иммуноглобулинов проводят спиртовым осаждением, в качестве стабилизатора используют смесь глицина и глюкозы в соотношении (1-1,5):1, раствор иммуноглобулинов обрабатывают сорбентами из стекла, на стадии выделения целевого продукта проводят проточно-зональное центрифугирование, а перед стерилизующей фильтрацией пропускают раствор через пористый стеклянный фильтр.

Способ осуществляют следующим образом. Осаждение иммуноглобулиновой фракции из хлороформного экстракта осадка Б проводят с использованием этилового спирта. Это позволяет избежать присутствия в конечном продукте полиэтиленгликоля, который по методике прототипа приходится удалять многократной промывкой. Спиртовый осадок растворяют в 0,55 - 0,65% растворе хлорида натрия с добавлением глицина и глюкозы в соотношении (1-1,5):1 (т.е. 20,5% глюкозы и 2-3% глицина), pH 6,5-7,5. Данные значения pH и соли являются оптимальными, поскольку обеспечивают наиболее полное формирование осадка нерастворимого фибрина, и не требуют дальнейшей коррекции. Снижение концентрации соли ниже 0,55% затрудняет растворение осадка, а повышение более 0,65% затрудняет проводимую впоследствии лиофилизацию. Увеличение соотношения концентраций глицина и глюкозы не приводит к увеличению выхода конечного продукта, а его уменьшение не обеспечивает достаточного растворения иммуноглобулинов. Для ускорения формирования фибринового осадка проводят обработку раствора с использованием стеклянных бус. Раствор инкубируют около 30 минут до формирования фибрина, затем подвергают проточно-зональному центрифугированию при 15000 об. /мин. Надосадочную жидкость пропускают через фильтр из мелкопористого стекла (фильтр Шота) с целью удаления остаточных количеств фибриногена и фибрина, сорбирующихся на пористом стекле. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации. Данный раствор стабилен и может храниться до розлива в течение 1 месяца без изменения физико-химических свойств (прозрачности, отсутствия осаждающихся компонентов).

Пример 1. К 1кг осадка Б добавляют 10 л 0,9%-ный раствор хлорида натрия при перемешивании. Объем экстракта 10 л содержание белка 2,00,2%. К экстракту осадка Б добавляют 10% хлороформа по объему. Смесь медленно перемешивают в течение 2 ч. Осадок удаляют центрифугированием. Устанавливают pH раствора равным 6,90,5. Добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 26%. Осадок отделяют центрифугированием при 15000 об./мин. Полученный осадок иммуноглобулинов разводят в 0,60,05% растворе хлорида натрия с добавлением 20,5% глюкозы и 3,0% глицина. В раствор добавляют стеклянные бусы и инкубируют около 30 минут до формирования фибрина. После обработки проводят отделение фибрина путем проточно-зонального центрифугирования при 15000 об./мин на центрифуге ОТР-101. Надосадочную жидкость пропускают через фильтр Шота. Затем раствор иммуноглобулинов подвергают стерилизующей фильтрации с использованием глубинных целлюлозных фильтров "Cuno-60" и "Cuno-90", и лиофильной сушке с использованием аппарата ТГС -15.

Специфическая активность (титр антител) полученного препарата не отличается от прототипа (к шигеллам - 1:320, к сальмонеллам 1:320 - 1:640). Содержание иммунологически неактивных фракций, определяемое методом электрофореза на мембранах из ацетатцеллюлозы, также не отличается от прототипа и составляет 0-1%. Выход иммуноглобулинового препарата составляет 170-185 доз из 1 кг исходного сырья.

Пример 2. Проведен аналогично примеру 1, но при добавлении глицина до 2%. Конечный выход препарата - 170-185 доз из 1 кг сырья, специфическая активность - титр антител к шигеллам - 1:320, к сальмонеллам - 1:1320, содержание иммунологически неактивных фракций, определяемое методом электрофореза на мембранах из ацетатцеллюлозы, - 1%.

Использование в качестве осаждающего реагента вместо полиэтиленгликоля этилового спирта позволяет повысить выход иммуноглобулиновой фракции на 15%, повышение скорости центрифугирования также дает увеличение выхода иммуноглобулинов на 15%. Удаление примесей фибрина ведет к снижению потерь при фильтрации на 40-55%, что, в свою очередь, также позволяет улучшить экономические показатели. Выход препарата составляет 170-185 доз из 1 кг исходного сырья, в то время как методика прототипа позволяет получить не более 100 доз из 1 кг сырья. Суммарное повышение выхода препарата составляет 70-85%. Себестоимость препарата по сравнению с прототипом снижена на 50%.