тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин и методы его использования

Формула изобретения

1. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза, заключающийся в назначении пациенту, страдающему заболеванием коронарных артерий, эффективного количества химерного иммуноглобулина или химерного фрагмента иммуноглобулина, обладающего специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa, причем указанный иммуноглобулин или фрагмент содержит область связывания антигена, не принадлежащую человеку и специфичную к гликопротеину IIb/IIIa, и константную область иммуноглобулина человека.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина ингибирует агрегацию тромбоцитов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что область связывания антигена получают из моноклонального антитела 7E3.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фрагментом иммуноглобулина является фрагмент Fab, Fab" или F(ab")₂.

5. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза, заключающийся в назначении пациенту, страдающему заболеванием коронарных артерий, эффективного количества соединения, которое селективно связывается с гликопротеином IIb/IIIa.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что соединение представляет собой иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, обладающий специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин или иммуноглобулиновый фрагмент ингибирует агрегацию тромбоцитов.

8. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза после проведения операции на коронарной артерии у человека, заключающийся в назначении указанному человеку эффективного количества химерного иммуноглобулина или химерного фрагмента иммуноглобулина, обладающего специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa, причем указанный иммуноглобулин или фрагмент содержит область связывания антигена, не принадлежащую человеку и специфичную к гликопротеину IIb/IIIa, и константную область иммуноглобулина человека.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что операция представляет собой пластическую операцию на сосуде.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин или иммуноглобулиновый фрагмент ингибирует агрегацию тромбоцитов.

11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что область связывания антигена получают из моноклонального антитела 7E3.

12. Способ по п.8, отличающийся тем, что фрагмент иммуноглобулина выбирают из группы, состоящей из Fab, Fab" или F(ab")₂.

13. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза после проведения операции на коронарной артерии у человека, заключающийся в назначении указанному человеку эффективного количества соединения, которое селективно связывается с GPIIb/IIIa.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что соединение представляет собой иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, обладающий специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина ингибирует агрегацию тромбоцитов.

16. Способ снижения вероятности возникновения или предотвращения неострых ишемических осложнений при ангиопластике у человека, заключающийся в назначении указанному человеку эффективного количества химерного иммуноглобулина или фрагмента химерного иммуноглобулина, обладающего специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa, причем указанный иммуноглобулин или фрагмент содержит область связывания антигена, не принадлежащую человеку, специфичную к гликопротеину IIb/IIIa, и константную область иммуноглобулина человека.

17. Способ снижения вероятности возникновения или предотвращения неострых ишемических осложнений при проведении пластических операций на сосудах у человека, заключающийся в назначении указанному человеку эффективного количества соединения, которое селективно связывается с гликопротеином IIb/IIIa.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что соединение представляет собой иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, обладающий специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанный иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина ингибирует агрегацию тромбоцитов.

20. Способ по п.8, отличающийся тем, что процедура представляет собой размещение стента.

21. Способ по п.13, отличающийся тем, что процедура представляет собой размещение стента.

22. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанное соединение селективно связывается с GPIIb/IIIa и рецептором витронектина.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что процедура является ангиопластикой.

24. Способ по п.22, отличающийся тем, что процедура представляет собой размещение стента.

25. Способ по п.22, отличающийся тем, что соединение представляет собой химерный иммуноглобулин или фрагмент химерного иммуноглобулина, обладающий специфичностью к гликопротеину IIb/IIIa-рецептору витронектина и включающий в себя область связывания антигена, не принадлежащую человеку, и по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина человека.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что область связывания антигена получают из моноклонального антитела 7E3.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что фрагмент химерного иммуноглобулина выбирают из группы, включающей в себя фрагменты Fab, Fab" или F(ab")₂.

28. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза, заключающийся в назначении пациенту, имеющему заболевание коронарных артерий, эффективного количества Fab-фрагмента химерного иммуноглобулина мышь-человек, содержащего вариабельные области мышиной легкой и тяжелой цепей многоклонального антитела 7E3.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пациенту назначают гепарин.

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что гепарин назначают в количестве, зависящем от веса пациента.

31. Способ ингибирования стеноза и/или рестеноза после проведения операции на коронарной артерии у человека, включающий в себя назначение человеку эффективного количества Fab-фрагмента химерного иммуноглобулина мышь-человек, содержащего вариабельные области мышиной легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела 7E3.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что пациенту дополнительно назначают гепарин.

33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что гепарин назначают в количестве, зависящем от веса пациента.

Описание изобретения к патенту

Агрегация тромбоцитов играет важную роль при образовании сгустков крови. При обычных обстоятельствах сгустки крови служат для предотвращения потери крови из сосудистой системы. Однако при определенных болезненных состояниях сгустки крови могут создавать препятствия потоку крови или полностью его перекрывать, что приводит к некрозу клеток.

Например, агрегация тромбоцитов и последующий тромбоз в месте атеросклеротической бляшки является важным причинным фактором в генезисе таких состояний, как стенокардия, острый инфаркт миокарда и повторная закупорка после успешно проведенного тромболиза и пластической операции на сосудах. Пациентов, подверженных стенокардии, обычно лечат с использованием тромболитических средств, таких как тканевый активатор плазминогена или стрептокиназа, которые растворяют фибриновый компонент сгустков. Основным осложнением, связанным с фибринолизом, является повторная закупорка вследствие агрегации тромбоцитов, которая приводит к дальнейшему поражению сердца. Поскольку, как известно, рецепторы гликопротеина (GP)IIb/IIIa отвечают за агрегацию тромбоцитов, то можно ожидать, что реагенты, которые блокируют указанные рецепторы, будут снижать или препятствовать повторной закупорке после применения тромболитической терапии и увеличивать скорость тромболиза. Можно ожидать, что подобные реагенты будут полезны при терапии других заболеваний, связанных с закупоркой сосудов, и терапии тромбоэмболических заболеваний.

В одном из подходов к блокированию агрегации тромбоцитов используют моноклональные антитела, специфичные для рецепторов GPIIb/IIIa. Муриновые моноклональные антитела, которые приводятся в Европейских патентных заявках с номерами 205207 и 206532, обозначенные как 7EЗ, подавляют агрегацию тромбоцитов и, вероятно, полезны при лечении тромботических заболеваний человека. Из области техники известно, что муриновые антитела обладают свойствами, которые могут в значительной степени ограничить их использование в терапии человека. Являясь инородными белками, муриновые антитела способны вызывать иммунные реакции, которые снижают или нивелируют их терапевтическую эффективность и/или приводят к возникновению аллергических ответных реакций или повышенной чувствительности у пациентов. Потребность в повторном назначении этих лечебных процедур при тромбоэмболических заболеваниях повышает вероятность возникновения иммунных реакций указанного типа.

Химерные антитела со связывающими областями, не принадлежащими человеку, которые соединены с константными областями, принадлежащими человеку, предложены в качестве средств, позволяющих обойти проблемы, вызываемые иммуноактивностью муриновых антител (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984) и Международную заявку N PCT/GB85 00392). Поскольку константная область в значительной степени ответственна за иммуноактивность молекулы антитела, то химерные антитела с константными областями человеческого происхождения должны в меньшей степени вызывать антимуриновую ответную реакцию у людей. Однако заранее нельзя определить, приведет ли присоединение константной области человека к муриновой связывающей области, обладающей требуемой специфичностью, к снижению иммуноактивности и/или изменению связывающей способности полученного химерного антитела.

Настоящее изобретение относится к тромбоцитспецифичным химерным иммуноглобулинам, содержащим вариабельную область или область связывания антигена, не принадлежащую человеку, и константную область, принадлежащую человеку. Химерные иммуноглобулины могут быть специфичными для рецептора GPIIb/IIIa или других компонентов тромбоцита. Указанные антитела связываются с тромбоцитами и могут блокировать агрегацию тромбоцитов и, таким образом, полезны в качестве антитромботических средств для предотвращения или уменьшения вероятности закупорки или повторной закупорки сосудов в различных клинических ситуациях (в частности, после тромболитической терапии, которая проводится одновременно с проведением пластической операции на сосудах) или для предотвращения стеноза или повторного стеноза. Антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению полезны также при получении изображения тромба.

На фиг. 1 приведен результат анализа по методу назерн-блоттинга тяжелой цепи и легкой цепи мРНК для моноклонального антитела 7E3 с использованием в качестве зондов клонированных вариабельных областей.

На фиг. 2A и 2B схематично представлены плазмиды p7E3V_KC_K (фиг.2A) и p7E3V_Hh C₄ (фиг. 2B), которые содержат химерные генно-инженерные конструкции, кодирующие, соответственно, легкие и тяжелые цепи химерного иммуноглобулина 7E3.

Фиг. 3 иллюстрирует связывание химерного иммуноглобулина 7E3, кодируемого векторами p7E3V_KhC_K и p7E3V_Hh C₄, c тромбоцитами.

На фиг. 4 показано подавление агрегации тромбоцитов химерным иммуноглобулином 7E3 (c7E3).

На фиг. 5 приведен график концентрации антитела в плазме (нг/мл) в зависимости от времени (в днях), который показывает быстрое первоначальное выведение c7E3 Fab (₁, K) из плазмы пациентов, страдающих от хронического заболевания коронарных сосудов, после введения дозы 0,20 мг/кг c7E3 Fab в виде внутривенного вливания в течение пяти минут.

Фиг. 6 (A-C) поясняет в обобщенном виде влияние на активность тромбоцитов дозы химерного 7E3 Fab в виде одного болюса (0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг или 0,25 мг/кг) через 2 час после назначения антитела (₁, K) Зависимая от дозы ответная реакция наблюдается при изучении активности тромбоцитов с точки зрения блокады рецептора (фиг. 6A, вверху), агрегации тромбоцитов (фиг. 6B, посредине) и времени кровотечения (фиг. C, внизу). Линии соответствуют средним значениям.

Фиг. 7 (A-C) иллюстрирует продолжительность антитромбоцитарного воздействия химерного 7E3 Fab (₁, K), назначаемого перед проведением пластической операции на сосудах в виде одного болюса с дозой 0,25 мг/кг. Линии соответствуют средним значениям от времени ноль (базовая линия) и до 24 часов для блокады рецептора (фиг. 7A, вверху), агрегации тромбоцитов (фиг. 7B, посредине) и времени кровотечения (фиг. 7C, внизу).

Фиг. 8 (A-C) иллюстрирует суммарную антитромбоцитарную активность одного болюса с дозой 0,25 мг/кг с последующим непрерывным вливанием в течение 12 час (10 мкг/мин) химерного 7E3 Fab (₁, K) у одиннадцати пациентов. Линии соответствуют средним значениям, определенным для выраженной в процентах блокады рецептора (фиг. 8A, вверху), выраженной в процентах степени агрегации тромбоцитов для предварительной дозы (базовая линия во время ноль) (фиг. 8B, посредине) и времени кровотечения (фиг. 8C, внизу).

Фиг. 9 иллюстрирует абсолютное изменение в гематокритном числе от базового значения в течение 24 час после окончания вливания для 47 пациентов, описанное в Примере 4.

Фиг. 10 представляет собой график Каплана-Мейера, который иллюстрирует зависимость вероятности не вызванного необходимостью повторного чрескожного восстановления сосудов от времени рандомизации для трех испытуемых групп.

На фиг. 11 в виде диаграммы приведены вероятностные коэффициенты для 95%-ных доверительных интервалов для ключевых подгрупп (перечислены справа), которых подвергают испытаниям. Данные приведены для основных случаев прекращения проведения испытаний (смерть, нефатальный инфаркт миокарда, экстренная пластическая операция на сосудах или размещение коронарного стента или внутриаортального баллонного насоса при стойкой ишемии). Кроме того, слева в виде таблицы приведены абсолютные значения по частоте наблюдения основных случаев прекращения испытаний в каждой подгруппе (Частота случая (%)).

На фиг. 12 приведен график, показывающий долю всех пациентов, у которых отмеченные случаи не выявлены в течение шестимесячного периода наблюдения.

На фиг. 13 приведен график, показывающий долю тех пациентов, у которых отмеченные случаи не выявлены в течение шестимесячного периода наблюдения и у которых проведено успешное хирургическое вмешательство, не имевшее последствий по прошествии 30 дней.

На фиг. 14 приведен график, показывающий долю тех пациентов, у которых отмеченные случаи не отмечены в течение шестимесячного периода наблюдения, и учитывающий тех пациентов, у которых отмеченные случаи выявляются через 48 часов после первоначально успешного хирургического вмешательства.

На фиг. 15 приведен график, показывающий долю всех пациентов, у которых не отмечены попытки восстановления кровеносных сосудов в подвергнутой операции артерии в течение шестимесячного периода наблюдения.

Химерные иммуноглобулины по настоящему изобретению состоят из индивидуальной химерной тяжелой и легкой цепочек иммуноглобулина. Химерная тяжелая цепочка включает антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку антигена, специфичного для тромбоцитов (в частности, специфичного для рецептора GPIIb/IIIa), которая привязана к константной области тяжелой цепочки человека. Химерная легкая цепочка включает антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку антигена, которая привязана к константной области легкой цепочки человека.

Иммуноглобулины по настоящему изобретению могут быть одновалентными, бивалентными или поливалентными. Одновалентные иммуноглобулины (HL) представляют собой димеры, образованные химерной тяжелой цепочкой, которая связана посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепочкой. Бивалентные иммуноглобулины представляют собой тетрамеры (H₂L₂), образованные двумя димерами, связанными по крайней мере с помощью одного дисульфидного мостика. Могут быть также получены поливалентные иммуноглобулины, например, за счет агрегации константной области тяжелой цепочки (в частности, константных областей тяжелой цепочки). Могут быть также получены фрагменты химерных иммуноглобулинов, такие как Fab, Fab" или F(ab")₂.

Не принадлежащие человеку антигенсвязывающие области химерного иммуноглобулина получают из иммуноглобулинов, специфичных для тромбоцитов. Предпочтительными иммуноглобулинами являются иммуноглобулины, специфичные для рецепторов GPIIb/IIIa тромбоцитов, которые способны блокировать связывание лиганда с рецепторным комплексом гликопротеина IIb/IIIa.

Тромбоз начинается с прилипания тромбоцитов в местах поражения стенок сосуда. Процесс прикрепления тромбоцитов протекает под контролем поверхностных рецепторов тромбоцитов, которые связываются белками внеклеточной матрицы обнажившейся поверхности субэндотелиального слоя, такими как фактор фон Виллебранда, коллаген, фибронектин, витронектин и ламинин. Прилипание тромбоцитов приводит к образованию составленного ими монослоя. Далее, в ответ на действие агониста, такого как эпинефрин, АДФ, коллаген и тромбин, происходит активация тромбоцитов. Активация приводит к воздействию рецептора гликопротеина IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) на поверхность тромбоцитов. После этого GPIIb/IIIa на активированных тромбоцитах становится доступен для связывания с фибриногеном, который стимулирует агрегацию тромбоцитов. Связывание GPIIb/IIIa с другими адгезивными белками, такими как фактор фон Виллебранда, также вызывает сшивку и агрегацию тромбоцитов. Таким образом, связывание адгезивных молекул, таких как фибриноген или фактор фон Виллебранда, к GPIIb/IIIa, вызывающее агрегацию тромбоцитов, представляет собой обычную стадию в процессе образования тромба, что делает рецептор GPIIb/IIIa привлекательной мишенью для терапевтических средств, которые могут помешать взаимодействию GPIIb/IIIa с указанными молекулами. Более того, можно ожидать, что при использовании анти-GPIIb/IIIa химерного антитела будет подавляться агрегация активированных тромбоцитов, при этом процесс первичного прилипания тромбоцитов не нарушается. Селективное ингибирование агрегации тромбоцитов может оказаться желательным, поскольку прилипание тромбоцитов, не сопровождающееся агрегацией, может способствовать остановке кровотечения.

Примерами подходящих антител, специфичных для тромбоцитов, являются 7E3 и 10E5. См. Европейские патентные заявки с номерами 205207 и 206532, описания которых приводятся здесь для справок. Антитело 7E3 (или взаимодействующее с ним антитело или функционально эквивалентный эпитоп) является наиболее предпочтительным постольку, поскольку оно является специфичным для комплексной формы рецептора GPIIb/IIIa. Могут также использоваться другие антитела, специфичные для рецептора GPIIb/IIIa (антигена, который распознает 7E3), такие как антитела, специфичные для любого из компонентов IIb или IIIa. Могут использоваться антитела, специфичные для других антигенов тромбоцитов. Например, могут применяться антитела, способные взаимодействовать с протеиновым зерном альфа-мембраны тромбоцита GMP-140, такие как антитело S12 (J. Biol. Chem., 259: 9799-9804 (1984); Патент США 4783330).

Антигенсвязывающая область химерного антитела может быть получена из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Антигенсвязывающая область имеет предпочтительно муриновое происхождение, поскольку муриновые антитела против тромбоцитов и, в частности, рецепторов GPIIb/IIIa, доступны или могут быть получены в муриновых системах. Альтернативными источниками антигенсвязывающих областей являются другие виды животных или грызунов (см., например, Newman et al. , Bio/Technology, 10: 1455-1460 (1992). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая область химерного иммуноглобулина содержит по крайней мере часть тромбоцитспецифичного иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, достаточную для специфического или селективного связывания гена, такую как один или несколько гипервариабельных участков или их частей, выделенных из не принадлежащего человеку иммуноглобулина (см., в частности, Winter, Патент США 5225539, Европейская патентная заявка 0239400, Патент Великобритании 2188638; Adair et al., Международная патентная заявка WO 91/09967; Jolliffe et al., Международная патентная заявка WO 91/09966). В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный иммуноглобулин включает по крайней мере одну химерную тяжелую цепочку, содержащую вариабельный участок, выделенный из тяжелой цепочки не принадлежащего человеку иммуноглобулина, которая соединена с по крайней мере частью константной области тяжелой цепочки человека, и по крайней мере одну химерную легкую цепочку, содержащую вариабельный участок, выделенный из легкой цепочки не принадлежащего человеку иммуноглобулина, которая соединена с по крайней мере частью константной области легкой цепочки человека. Возможны также и другие комбинации вариабельных и константных областей (см., частности, Патент США 5169939).

Константные области химерных антител получают из иммуноглобулинов человека. Константную область тяжелой цепочки можно выбрать из одного из пяти изотипов альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Более того, тяжелые цепочки различных подклассов (таких как подклассы IgG тяжелых цепочек) отвечают за различные функции эффектора и, таким образом, выбирая константную область нужной тяжелой цепочки, можно получить химерные антитела с требуемой эффекторной функцией. Предпочтительными константными областями являются гамма 1 (IgG1), гамма 3 (IgG3) и гамма 4 (IgG4). Константная область легкой цепочки может быть типа каппа или лямбда.

В общем случае химерные антитела получают, подготавливая для каждого из компонентов легкой или тяжелой цепи химерного иммуноглобулина ген слияния, включающий первый сегмент ДНК, который кодирует по крайней мере функциональную часть тромбоцитспецифичной вариабельной области, не принадлежащей человеку (например, функционально перестроенный вариабельный участок вместе с соседними сегментами) и связанной со вторым сегментом ДНК, который кодирует по крайней мере часть константной области иммуноглобулина человека. Каждый ген слияния собирают или вводят в вектор экспрессии, получая вектор экспрессии, который содержит ген слияния в способной экспрессироваться форме. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ДНК, включающая область связывания антигена, ковалентно соединяется с константной областью посредством интрона. В другом варианте осуществления настоящего изобретения могут быть созданы или получены генно-инженерные конструкции, у которых отсутствует один или несколько интронов. Затем подвергают трансфекции генами клетки реципиента, способные экспрессировать генные продукты. Подвергнутые трансфекции клетки реципиента выращивают в условиях, позволяющих провести экспрессию введенных генов, а затем экспрессированные иммуноглобулины или цепочки иммуноглобулина выделяют.

Гены, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, могут быть получены из лимфоидных клеток, которые продуцируют тромбоцитспецифичные антитела. Например, гибридомные клеточные линии являются источником вариабельной области иммуноглобулина для химерных антител по настоящему изобретению. Доступны также и другие клеточные линии грызунов. Клеточные линии можно получить, вводя грызуну провокационную пробу тромбоцитов человека, или компонент, содержащий рецептор GPIIb/IIIa, или фракции тромбоцитов, формируя слитые гибридные клетки между клетками, продуцирующими антитела, и клеточной линией миеломы, подвергая гибрид клонированию и отбирая клоны, которые продуцируют антитела против тромбоцитов или рецептора гликопротеина IIb/IIIa.

Константные области можно получить из продуцирующих антитела клеток человека, используя стандартные методики клонирования. Иначе, поскольку клонированию подвергают гены, представляющие два класса легких цепочек и пять классов тяжелых цепочек, из этих клонов легко получают константные области, принадлежащие человеку, связывающие фрагменты химерного антитела, такие как фрагменты F(ab")₂ или Fab, могут быть получены путем конструирования химерного гена тяжелой цепочки в усеченной форме. Например, химерный ген, кодирующий часть F(ab")₂ тяжелой цепочки будет включать ДНК последовательности, кодирующие область CH и область "талии" тяжелой цепочки. В качестве альтернативы подобные фрагменты можно получить ферментативным расщеплением химерного иммуноглобулина. Например, расщеплением с использованием папаина или пепсина можно генерировать, соответственно, фрагменты Fab или F(ab")₂.

Гены слияния, кодирующие легкие и тяжелые химерные цепочки (или их порции) преимущественно собирают в двух различных векторах экспрессии, которые можно использовать для котрансгенного переноса в клетки реципиента. Каждый вектор содержит два селектируемых гена - один для селекции в бактериальной системе, а второй в селекции в эукариотной системе, - при этом каждый вектор имеет разную пару генов. Указанные векторы позволяют осуществить продуцирование и амплификацию гена слияния в бактериальной системе и последующий котрансгенный перенос в эукариотные клетки и селекцию клеток, подвергнутых котрансгенному переносу. Примерами селектируемых генов для использования в бактериальной системе являются гены, которые придают устойчивость к действию ампицилина, и гены, которые придают устойчивость по отношению к действию хлорамфеникола. Предпочтительны два селектируемых гена: (i) ген ксантан-гуанинфосфорибозилтрансферазы (gpt) и (ii) ген фосфотрансферазы из Tn5 (обозначают как neo). Селекция с помощь gtp основана на способности фермента, кодируемого указанным геном, использовать ксантин в качестве субстрата при синтезе пуриновых нуклеотидов; аналогичные эндогенные ферменты такой способностью не обладают. В среде, содержащей ксантин и микофенольную кислоту, которая блокирует превращение монофосфата инозина в монофосфат ксантина, могут выжить лишь клетки, экспрессирующие ген gpt. Продукт гена neo блокирует ингибирование синтеза белка в эукариотных системах, вызванное антибиотиком G418 и другими антибиотиками этого класса. Две процедуры селекции могут использоваться одновременно или последовательно для отбора экспрессии генов иммуноглобулиновой цепочки, введенных в эукариотную клетку в двух различных ДНК векторах.

Предпочтительной клеточной линией реципиента является клетка миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, осуществлять сборку и секретировать иммуноглобулины, кодируемые подвергнутыми трансфекции генами иммуноглобулина. Более того, они владеют механизмом гликозилирования иммуноглобулина. Особенно предпочтительной клеткой реципиента является непродуцирующая линия клеток миеломы, такая как Sp2/0. Указанные клеточные линии продуцируют лишь иммуноглобулин, кодируемый подвергнутыми трансфекции генами иммуноглобулина. Клетки миеломы могут быть выращены в среде для выращивания культуры или в брюшине мыши, а секретируемый иммуноглобулин может быть выделен из асцитной жидкости. В качестве подходящих клеток реципиента могут служить другие лимфоидные клетки, такие как B-лимфоциты или клетки гибридомы.

Существует несколько способов трансфекции лимфоидных клеток векторами, содержащими гены, кодирующие иммуноглобулин. Предпочтительным способом введения ДНК в лимфоидные клетки является электропорация. При осуществлении этой методики клетки реципиента подвергают воздействию электрических импульсов в присутствии ДНК, которую необходимо ввести (см., например, Potter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984)). Другим способом введения ДНК является слияние протопластов. В этом методе для удаления стенок клетки бактерии, которая скрывает рекомбинантную плазмиду, содержащую химерный ген иммуноглобулина, используют лизоцим. Полученные сферопласты сливают с клетками миеломы в присутствии полиэтиленгликоля. После слияния протопластов трансфектанты отбирают и выделяют. Еще одним способом, который может использоваться для введения ДНК во многие типы клеток, является осаждение фосфатом кальция.

Гены химерного иммуноглобулина могут экспрессироваться также в нелимфоидных клетках, таких как бактерии или дрожжи. При экспрессии в бактерии тяжелые цепочки и легкие цепочки становятся частью телец включения. Таким образом, цепочки должны быть изолированы и очищены, а затем собраны в функциональные молекулы иммуноглобулина. Существуют и другие способы для экспрессии в E. coli (см., в частности, A. Pluckthun, Bio/Technology, 9: 545-551 (1991); A. Skerra et al., Bio/Technology, 9: 273-278 (1991)), в том числе секреция из E. coli в виде слитых белков, содержащих сигнальную последовательность.

Использование тромбоцитспецифичных химерных иммуноглобулинов

Химерные тромбоцитспецифичные антитела по настоящему изобретению полезны в качестве антитромботических терапевтических средств. Например, химерные антитела (или их фрагменты) могут использоваться для подавления агрегации тромбоцитов и образования тромба у пациентов, имеющих тромб или подверженных риску образования тромба. Антитела могут также использоваться для подавления отклонений в менструальном цикле, вызываемых агрегацией тромбоцитов, которая может предшествовать образованию или преобразованию тромбов. Антитела могут использоваться в различных ситуациях, когда следует предотвратить образование или преобразование (окклюзию) тромбов. Более того, антитела могут использоваться в различных ситуациях, когда следует подавить (снизить, отсрочить или предотвратить) стеноз или рестеноз.

Например, пациенты, подверженные риску или страдающие от заболеваний коронарных артерий, могут почувствовать облегчение при назначении эффективного количества фрагментов химерных антитромбоцитных антител по настоящему изобретению (в частности, химерное антитело GPIIb/IIIa или предпочтительно его фрагмент, такой как химерный 7E3 Fab или F(ab")₂), с целью подавления окклюзии, реокклюзии, стеноза и/или рестеноза сосудов.

Например, антитела могут назначаться индивидууму (в частности, млекопитающему, такому как человек) для предотвращения тромбоза при легочной эмболии, преходящего ишемического нарушения мозгового кровообращения, глубокого венозного тромбоза, при проведении операции по шунтированию коронарной артерии, хирургической операции по установке искусственного клапана сердца или сосуда (в частности, собственного, несобственного или синтетического трансплантанта сосуда). Антитела по настоящему изобретению могут также назначаться индивидууму, с целью предотвращения агрегации тромбоцитов и тромбоза до, во время и после пластических операций на сосудах, которые проводятся методами баллонной коронарной атеректомии, лазерной пластической операции на сосудах или другими подходящими способами. Антитело может назначаться перед проведением пластических операций на сосудах, во время проведения пластических операций на сосудах и после проведения пластических операций на сосудах. Подобная обработка может предотвратить тромбоз и, таким образом, снизить вероятность тромботических осложнений после проведения пластических операций на сосудах, таких как смерть, инфаркт миокарда или рецидивы ишемии, которые приводят к необходимости проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии или операции по шунтированию коронарной артерии (в случаях острой ишемии). Кроме того, подобное лечение может привести к более продолжительному положительному воздействию за счет снижения вероятности ишемии или осложнений при проведении хирургического вмешательства на коронарной артерии (в частности, при проведении пластических операций на сосудах), таких как смерть, инфаркт миокарда или рецидивы ишемии, которые приводят к необходимости проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии или операции по шунтированию коронарной артерии (при проведении операций по реваскуляризации), что подтверждается уменьшением вероятности возникновения, отсрочкой или предотвращением стеноза или повторного сужения просвета сосуда.

Например, как показано в Примере 4, назначение химерного антитромбоцитного антитела (фрагмента химерного 7E3 Fab) в качестве вспомогательной терапии перед проведением пластической операции на кровеносных сосудах (чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии) эффективно увеличивает время кровотечения и снижает индуцируемую агонистом агрегацию тромбоцитов, что подтверждается ex vivo анализом агрегации тромбоцитов. Результаты исследований, приведенные в Примерах 4 и 5, также показывают, что блокада GPIIb/IIIa тромбоцитов и подавление агрегации под действием антитела c7E3 (фрагмента Fab) приводит к in vivo антитромботической эффективности при лечении людей.

Результаты рандомизованного обезличенного анализа с использованием плацебо в качестве контроля при назначении фрагмента химерного антитела 7E3 приведены в Примерах 6 и 7. Данные, представленные в Примере 6, свидетельствуют о том, что назначение фрагмента химерного антитела 7E3 пациентам, которым проводят пластические операции на сосудах и которые подвержены значительному риску внезапной закупорки (окклюзии) сосудов, может предотвратить внезапную закупорку (окклюзию) сосудов и уменьшить вероятность возникновения острой ишемии. Как далее показано в Примере 7, назначение фрагмента химерного антитела пациентам, которым проводят пластические операции на сосудах и которые подвержены значительному риску внезапной закупорки (окклюзии) сосудов, может позднее уменьшить, отсрочить и/или предотвратить развитие рестеноза.

Долговременное полезное воздействие проявляется в снижении вероятности возникновения неострых ишемических осложнений при назначении фрагмента химерного антитела анти-GPIIb/IIIa (см. Пример 7) является беспримерным. С целью предотвращения или уменьшения вероятности возникновения стеноза или рестеноза, могут использоваться дополнительные соединения, которые селективно связываются с рацептором GPIIb/IIIa; полезное клиническое воздействие при этом проявляется в уменьшении вероятности возникновения неострых ишемических осложнений. После их назначения указанные соединения могут дополнительно препятствовать закупорке или повторной закупорке сосудов. Указанные соединения включают, например, антагонисты GPIIb/IIIa, иммуноглобулин или неиммуноглобулиновые пептиды или белки (в частности, синтетические, рекомбинантные), их аналоги и нуклеиновые кислоты и аналоги нуклеиновых кислот. Пациенты, подверженные риску или страдающие от заболеваний коронарных артерий, могут ощутить полезное воздействие при назначении эффективного количества соединения, которое селективно связывается с рецептором GPIIb/IIIa, тем самым подавляя закупорку, повторную закупорку, стеноз и/или рестеноз сосудов.

Агрегация тромбоцитов активирует систему свертывания крови и приводит к формированию более устойчивой фибриновой сетчатой структуры и закупоривающего сгустка, которые могут подвергаться лизису под действием тромболитических средств. Антитела по настоящему изобретению или соединения, которые селективно связываются с рецептором GPIIb/IIIa, могут назначаться индивидууму (в частности, человеку) самостоятельно или в сочетании с тромболитическим средством, таким как активатор плазминогена (в частности, клеточный активатор плазминогена, урокиназа, стрептокиназа, рекомбинантный клеточный активатор плазминогена), или антикоагулянтом (в частности, антитромбиновым средством), или антитромбоцитарным средством, таким как аспирин, гепарин, гирулог, гирудин или кумариновые антикоагулянты (в частности, варфарин), например, с целью предотвращения и снижения вероятности повторной закупорки сосудов, которая может возникнуть после тромболиза, и с целью ускорения лизиса сгустка. Соединения, антитело или его фрагмент могут также назначаться до, вместе или после назначения тромболитического средства, антитромбинового средства, антикоагулянта или антитромбоцитарного средства в количествах, достаточных для предотвращения агрегации тромбоцитов, в результате которой может возникнуть закупорка или повторная закупорка сосуда, и/или для того, чтобы отсрочить или предотвратить развитие стеноза или рестеноза.

Эффективное количество (т.е. количество, достаточное для достижения желаемого терапевтического эффекта, такое как количество, достаточное для ингибирования агрегации тромбоцитов и тем самым для подавления образования или преобразования тромба, или количество, достаточное для предотвращения или отсрочки развития стеноза, или рестеноза, или случаев ишемии) соединения или антитела, или фрагмента антитела, может назначаться парентерально, преимущественно внутривенно, в фармацевтически приемлемом носителе, таком как стерильный солевой физиологический раствор. Могут вводиться буферные добавки. В состав композиции, включающей антитело, могут входить дополнительные добавки, такие как стабилизаторы (в частности, полисорбат 80, в соответствии с Фармакопеей США и Добавлениями к Фармакопее США). Антитело может назначаться в виде единичной дозы, непрерывно или с помощью нескольких вливаний (в частности, с помощью инъекции болюса с последующим продолжительным вливанием), иначе соединение или антитело может назначаться с использованием механизма контролируемого выделения (в частности, с помощью полимера или системы доставки "очажков") или другим подходящим способом. Назначаемое количество зависит от различных факторов, таких как клинические симптомы, вес индивидуума, и от того, проводится ли назначение других лекарств (в частности, тромболитических средств).

При проведении повторной терапии с использованием антитромбоцитарных антител может возникнуть тромбоцитопения, вызванная лекарствами; это явление может быть результатом того, что организм принимает покрытые антителом тромбоциты за чужеродные белки, мобилизует против них антитела, а затем выводит их наружу через ретикулоэндотелиальную систему быстрее, чем обычно. Вследствие чрезвычайно высокой плотности размещения рецепторов GPIIb/IIIa на поверхности тромбоцитов (приблизительно 80000 на один тромбоцит) и большого количества тромбоцитов в циркулирующей крови (приблизительно (0,25-0,5)10⁶ на 1 мкл), тромбоцитопения может оказаться серьезным осложнением при лечении антитромбоцитарными антителами, использование химерных антитромбоцитарных (в частности, анти-GPIIb/IIIa) антител позволяет обойти эту проблему. Химерные антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению могут свести к минимуму тромбоцитопению (снизить или предотвратить), которая в противном случае могла бы наблюдаться при использовании антитромбоцитарных антител. Например, минимальное сокращение содержания тромбоцитов в крови наблюдается при назначении химерного 7E3 Fab (см., в частности, Примеры 6 и 7).

Во-вторых, при назначении людям фрагмент химерного антитела 7E3 Fab показывает удивительно низкую частоту возникновения индуцируемой иммуногенности по сравнению с его муриновым двойником (см., в частности, Примеры 4 и 7). В процессе связывания тромбоцитов большая часть муриновой компоненты антитромбоцитарного химерного антитела связывается с поверхностью, в частности, посредством рецептора GPIIb/IIIa, и, таким образом, становятся недоступны для иммунной системы, что делает химерные антитела функционально неразличимыми от антител человека, направленных против того же самого эпитопа. По этой причине другие химерные антитромбоцитарные антитела по настоящему изобретению могут также быть неиммуногенными несмотря на их связывающую область муринового антигена.

Тромбоцитспецифичные химерные иммуноглобулины по настоящему изобретению полезны также для визуализации тромбов. С этой целью в общем случае более предпочтительно использовать фрагменты антитела. Как указано ранее, химерный ген тяжелой цепочки можно получить в усеченной форме, с целью получения фрагментов химерного иммуноглобулина (в частности, Fab, Fab" или F(ab")₂) для иммуносцинтиграфии. В указанные молекулы можно ввести метку непосредственно или с помощью хелатирующего агента, такого как DTPA, с радиоизотопами, такими как ¹³¹иод, ¹²⁵иод, ^99mтехнеций или ¹¹¹индий и получить агенты для радиоиммуносцинтиграфии. Иначе методами генной инженерии в сайт химерного антитела можно вести домен связывания (хелатирования) радиоактивных металлов, с целью получить сайт для введения метки. Таким образом, химерный иммуноглобулин может быть создан в виде белка, который содержит не принадлежащую человеку тромбоцитспецифичную вариабельную область, константную область человека (предпочтительно усеченную) и домен связывания металла, полученный из связывающего металл белка, такого как металлотионеин.

Тромбоцитспецифичный химерный иммуноглобулин или его фрагмент назначают пациенту, у которого подозревают тромб. По прошествии достаточного количества времени, необходимого для того, чтобы содержащий метку иммуноглобулин локализовался в месте расположения тромба, обнаруживают генерируемый меткой сигнал с помощью фотосканирующего устройства, такого как гамма-камера. Обнаруженный сигнал затем превращают в изображение тромба. Изображение позволяет локализовать тромб in vivo и выработать подходящую стратегию терапии.

Изобретение далее поясняется следующими примерами, которые его ни в коем случае не ограничивают.

Пример 1

Получение химерного тромбоцитспецифичного IgG4

A. Общая стратегия

Стратегия клонирования вариабельных областей для генов с легкой и тяжелой цепочкой из гибридомы 7Е3 основана на образовании связи в геноме между вариабельной областью и соответствующим J-фрагментом (связывающим фрагментом) функционально реаранжированных (и экспрессированных) генов Ig. Зонды J-фрагмента ДНК можно использовать для скрининга геномных библиотек, чтобы выделить ДНК, соединенную с J-фрагментом; ДНК в зачаточной конфигурации (нереаранжированной) также гибридизуется в J-зонды, однако не соединяется с вариабельной областью последовательности и может быть идентифицирована анализом выделенных клонов с использованием фермента рестрикции.

Цель стратегии клонирования заключается, таким образом, в выделении вариабельных областей из реаранжированных генов с тяжелой и легкий цепочкой при использовании J_H и J_K. Указанные клоны подвергают исследованию по методу назерн-блоттинга, с целью выяснить, экспрессируется ли их последовательность в гибридоме 7Е3. Клоны, которые содержат экспрессируемые последовательности, вводят в вектор экспрессии, содержащий константную область человека, и помещают в клетки миеломы мыши для того, чтобы определить, получено ли антитело. Антитело из продуцирующих его клеток затем испытывают на предмет специфичности связывания и на функциональность в сравнении с муриновым антителом 7E3.

Депонирование производного клеточной линии муриновой гибридомы 7Е3 проводят в Американской коллекции тканевых культур (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) 30 мая 1985. Регистрационный номер НВ8832 присвоен после проведения успешных испытаний на жизнеспособность.

B. Материалы и методики

Если специально не оговаривается, то все части и проценты даны по весу, а температура приведена в градусах Цельсия.

Конструирование геномной библиотеки тяжелой цепочки

Для выделения гена вариабельной области тяжелой цепочки из гибридомы 7E3 конструируют геномную библиотеку с разделением по размеру, используя фаговый лямбда вектор gt10. Анализ по методу саузерн-блоттинга 7E3 ДНК, подвергнутой ферментации с EcoRI, с использованием JH-зонда выявляет единственную полосу размером 3, 5 тыс. пар оснований, соответствующую преобразованному локусу тяжелой цепочки. Вероятно, этот фрагмент содержит ген вариабельной области тяжелой цепочки. Из гибридомных клеток 7E3 выделяют ДНК с большим молекулярным весом и подвергают полной ферментации с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI. Затем ДНК фракционируют на 0,7%-ном агарозном геле и непосредственно из геля выделяют ДНК размером 3-4 тыс. пар оснований. После экстракции смесью фенол/хлороформ и гель-фильтрации через колонку Sephadex G-50 фрагменты размером 3-4 тыс. пар оснований лигируют к плечам лямба gt10 (от компании "Promega Biotech, Inc. ") и упаковывают in vitro в частицы фага, используя Packagene от компании "Promega Biotech". Эту библиотеку подвергают прямому скринингу с плотностью приблизительно 30000 тромбоцитов на чашку Петри размером 150 мм, используя JH-пробу, содержащую метку ³²P. Гибридизацию тромбоцитов проводят в 5X SSC, 50%-ном формамиде, 2X реагента Денхардта, 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 42^oC в течение 18-20 час. Финишную промывку проводят в 0,5X SSC, 0,1%-ном додецилсульфате натрия при 65^oC. Позитивные клоны идентифицируют после ауторадиографии.

Конструирование геномной библиотеки легкой цепочки

Для выделения гена вариабельной области легкой цепочки 7E3 конструируют геномную библиотеку в лямбда векторе EMBL-3.

ДНК с большим молекулярным весом подвергают частичной ферментации с помощью рестрикционной эндонуклеазы Sau3A и фракционируют по размеру в градиенте плотности в 10-40%-ном растворе сахарозы. Фрагменты ДНК размером 18-23 тыс. пар оснований лигируют к плечам EMBL-3 и упаковывают in vitro в частицы фага, используя Packagene. Эту библиотеку подвергают скринингу с плотностью приблизительно 30000 тромбоцитов на чашку Петри размером 150 мм, используя JK-пробу. Условия гибридизации и промывки идентичны условиям, которые используют для библиотеки тяжелой цепочки.

ДНК-зонды

JH-зонд тяжелой цепочки мыши представляет собой фрагмент BamHI/EcoRI размером 2 тыс. пар оснований, который содержит как сегмент J3, так и сегмент J4. J_K-зонд легкой цепочки мыши представляет собой фрагмент HindIII размером 2,7 тыс. пар оснований, который содержит все пять сегментов J_x. Зонды, содержащие метку P, получают ферментативным лигированием одноцепочечного разрыва в двухцепочечной ДНК ("ник"-трансляцией) с использованием набора от компании "Amersham, Inc". Свободные нуклеотиды выделяют центрифугированием через колонку с Sephadex G-50. Удельные активности зондов составляют приблизительно 10⁹ отсчетов в минуту на микрограмм.

Анализ по методу назерн-блоттинга

15 мкг полной клеточной РНК подвергают электропорации на 1% геле агароза/формальдегид (Maniatis et al., Molecular Cloning) и переносят на целлюлозу. Пятна гибридизуют с помощью ДНК зондов, подвергнутых "ник"-трансляции, в 50%-ном формамиде, 2X растворе Денхардта, 5X SSC и 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося при 42^oC в течение 10 час. Финишную промывку проводят в 0,5X SSC, 0,1%-ном додецилсульфате натрия при 65^oC.

Трансфекция ДНК с использованием электропорации

Плазмидную ДНК, которую необходимо подвергнуть трансфекции, дважды очищают центрифугированием до наступления равновесия в градиенте растворов бромида этидия/хлорида цезия. 10-50 мкг ДНК плазмиды добавляют 810⁶ SP2/0 клеток в забуференном фосфатом солевом физиологическом растворе при охлаждении в бане со льдом и полученные смеси помещают в аппарат для проведения электропорации фирмы "Biorad". Электропорацию проводят при напряжении 200 вольт, и клетки помещают на планшеты для микротитрования с 96 ячейками. Селекцию с использованием подходящего лекарства проводят через 48 час и через 1-2 недели определяют колонии, устойчивые к действию лекарства.

Количественное определение воспроизводства антитела

Жидкость над осадком тканевой культуры анализируют на содержание белка IgG методом иммуноанализа концентрации частиц с флюоресцентным возбуждением (Jolley et al. , (1984) J. Immunol. Meth. 67: 21), используя стандартные кривые, полученные для очищенного IgG. Концентрацию химерного антитела 7E3 с константными областями человека определяют с помощью шариков из полистирола, покрытых поученным от козла антителом анти-человек IgG Fc и полученным от козла конъюгированным флюоресцеином антителом анти-человек IgG Fc. Анализ проводят на автоматизированной установке (от компании "Pandex Laboratories, Inc.").

Очистка тромбоцитспецифичных химерных антител IgG4

Жидкость над осадком тканевой культуры концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Diaflo YMIOO (от компании "Amicon") и помещают на колонку, наполненную белком A - сефарозой. Химерное антитело элюируют из колонки с белком A раствором цитрата натрия в градиенте pH от 6,5 до 3,5. Очищенное антитело концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Diaflo YM100. Концентрацию антитела определяют, измеряя поглощение на длине волны 280 нм.

Анализ ингибирования связывания

Очищенное антитело (как муриновое 7E3, так и химерное 7E3) используют в конкурентном анализе с антителом 7E3, содержащим метку радиоактивного иода при исследовании связывания тромбоцитов человека. Обогащенную тромбоцитами плазму получают центрифугированием содержащей цитратный буфер цельной крови со скоростью 1875 об/мин в течение 3,5 минут. Антитело 7E3, содержащее метку ¹²⁵I (150000 отсчетов в минуту), добавляют к разбавленному до нужной концентрации раствору испытуемого антитела и инициируют реакцию добавлением 150 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы. Проводят инкубацию в течение 1-2 час при комнатной температуре и тромбоциты с присоединенным антителом отделяют от свободного антитела центрифугированием через 30%-ную сахарозу с ускорением 12000 g в течение 4 минут в трубке для центрифугирования емкостью 0,4 мл. Крышку трубки, содержащую таблетку тромбоцит/антитело, отрезают и определяют количество отсчетов в счетчике Гейгера. Конкуренцию связывания с тромбоцитами между содержащим иод 7E3 и химерным 7E3 сравнивают с конкурентом, содержащим иод 7E3 и не содержащим метку 7E3 IgG.

Подавление агрегации тромбоцитов

Очищенное антитело 7E3 или химерное антитело 7E3 добавляют к содержащей цитратный буфер цельной крови и выдерживают в инкубаторе при 37^oC в течение 10 минут. Скорость агрегации тромбоцитов определяют после активации коллагеном или АДФ с помощь агрегометра цельной крови ("Chronolog Corp.").

C. Результаты

Клонирование тромбоцитспецифичных вариабельных областей гена

Несколько позитивных клонов выделяют после скрининга из библиотеки тяжелой цепочки и библиотеки легкой цепочки и приблизительно одного миллиона тромбоцитов, используя соответственно зонды J_H и J_K. После приблизительно трех раундов очистки тромбоцитов для каждого положительного клона выделяют ДНК бактериофага, подвергают ферментации либо с EcoRI (клоны тяжелой цепочки), либо с HindIII (клоны легкой цепочки) и фракционируют на 1%-ных агарозных гелях.

ДНК переносят на нитроцеллюлозу и пробы гибридизуют с ДНК зондами J_H (тяжелая цепь) или J_K (легкая цепь), содержащими метку P. Для тяжелой цепочки выделяют 2 клона, содержащих фрагменты ДНК EcoRI с массой 3,5 тыс. пар оснований, которые гибридизовались с зондом J_H. Два класса фрагментов HindIII с размерами 3,0 и 6,0 тыс. пар оснований идентифицируют с зондом J_K.

Клонированная ДНК, соответствующая аутентичным областям тяжелой и легкой цепочек из гибридомы 7E3, должна гибридизоваться в мРНК, выделенную из гибридомы. Нефункциональные реаранжировки ДНК в локусах как тяжелой, так и легкой цепи не должны экспрессироваться. На фиг. 1 приведены результаты анализа по методу назерн-блоттинга, которые показывают, что предполагаемый фрагмент EcoRI тяжелой цепочки размером 3,5 тыс. пар оснований и предполагаемый фрагмент HindIII легкой цепочки размером 6,0 тыс. пар оснований оба гибридизуются в соответствующего размера мРНК из гибридомы 7E3. В субклонированные фрагменты вводят метку P методом "ник"-трансляции и гибридизуют их в назерн-блотты, содержащие полную РНК, выделенную из SP2/0 (партнер слияния гибридомы 7E3) или из 7E3, как показано на фиг. 1. Фрагмент тяжелой цепочки EcoRI размером 3,5 тыс. пар оснований гибридизуется с мРНК размером 2 тыс. пар оснований в РНК 7E3, но не в РНК SP2/0. Аналогично фрагмент легкой цепочки HindIII размером 6,0 тыс. пар оснований гибридизуется с мРНК размером 1250 пар оснований в РНК 7E3, но не в РНК SP2/0. Это корректные размеры для РНК тяжелой и легкой цепочек, соответственно. Поскольку клонированные ДНК-фрагменты содержат последовательности, которые экспрессируются в гибридомах 7E3, то полученные данные свидетельствуют о том, что клоны содержат корректные последовательности вариабельных областей из гибридомы 7E3. Однако последний функциональный тест показывает, что указанные последовательности после их объединения с подходящими последовательностями константных областей способны направлять синтез антитела со специфичностью и аффинностью, аналогичными для специфичности и аффинности муринового антитела 7E3.

Векторы и системы экспрессии

V-гены предполагаемых легкой и тяжелой цепочек, полученные клонированием из гибридомы 7E3, присоединяют к генам и G4 константных областей человека в ранее описанных векторах экспрессии (L. Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987)). Фрагмент 17-1A V_KHindIII из pSV184 Hneo17-1AV_KhC_K замещают фрагментом HindIII размером 6,0 тыс. пар оснований, соответствующим предполагаемому гену вариабельной области легкой цепочки из 7E3. Аналогично фрагмент 17-1A V_HEcoRI из pSV2 Hgpt17-1AV_H -hC₄ замещают фрагментом EcoRI размером 3,5 тыс. пар оснований, соответствующим предполагаемому гену вариабельной области тяжелой цепочки из 7E3. Структуры полученных плазмид, обозначенных как p7E3V_KhC_K и p7E3V_Hh C₄, приведены на фиг. 2.

Для экспрессии химерных генов тяжелой и легкой цепочек две плазмиды котрансгенно переносят в непродуцирующую клеточную линию SP2/0 миеломы мыши. Плазмида легкой цепочки придает устойчивость по отношению к G418, а плазмида тяжелой цепочки придает устойчивость по отношению к микофенольной кислоте и, таким образом, позволяют осуществить двойную селекцию при получении клонов, несущих экспрессирующие гены от каждой плазмиды. Колонии, устойчивые к действию G418 и микофенольной кислоты, размножают в устойчивые клеточные линии и

хранят в присутствии обоих лекарственных препаратов. Жидкость над осадком тканевых культур указанных клеточных линий анализируют на наличие антитела с помощью флюоресцентного иммуноанализа концентрации частиц, используя полиэтиленовые шарики, покрытые антителом анти-человек IgG Fc, полученным от козла, и тем же самым антителом, содержащим метку флюоресцеина. Из первых десяти проверенных линий для проведения дальнейших исследований выбирают одну (которую обозначают как C-7E3F6), дающую приблизительно 2 мкг/мл.

Анализ активности связывания тромбоцитов

После очистки антитела C-7E3F6 на колонке, наполненной белком A - сефарозой, антитело концентрируют и сравнивают с муриновым 7E3 IgG в анализе активности связывания. Фиг. 3 показывает, что муриновое 7E3 и с-7E3F6 (предполагаемое химерное антитело) в равной степени конкурируют с содержащим радиоактивную метку 7E3 за связывание тромбоцитов; кривые связывания совпадают, указывая на то, что связывающие свойства муринового и химерного 7E3 в соответствии с этим критерием являются идентичными.

Подавление агрегации тромбоцитов с помощью с-7E3F6

Очищенное с-7E3F6 сравнивают с муриновым 7E3 при проведении функционального анализа, в котором определяют способность испытуемого антитела подавлять агрегацию тромбоцитов человека. Результаты этого анализа представлены на фиг. 4 и показывают, что оба антитела при одинаковых концентрациях в равной степени подавляют индуцируемую коллагеном агрегацию тромбоцитов. Кроме того с-7E3F6 в такой же степени подавляет АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов.

Результаты анализов на связывание и подавление агрегации тромбоцитов показывают, что: (1) из гибридомы 7E3 клонированием действительно получены корректные гены вариабельной области; и (2) по данным указанных анализов замещение константной области человека на муриновые константные области не оказывает воздействия на способность связываться и функциональные характеристики вариабельных областей 7E3.

Анализ с использованием шариков, покрытых фибриногеном

Как оказалось, химерное антитело с-7E3F6 является позитивным при проведении количественного функционального анализа, в котором определяют способность антитела подавлять агглютинацию между тромбоцитами и покрытыми фибриногеном шариками. B. Coller et al., J. Clin. Invest. 73: 325-338 (1983).

Пример 2

Продуцирование химерного IgG1 и IgG3

ДНК фрагменты, кодирующие вариабельную область тяжелой цепочки из муринового антитела 7E3, присоединяют к константным областям ₁ и ₃ человека, которые присутствуют в векторах экспрессии pSV2Hgtp17-1AV_H-hC₁ и pSV2Hgtp17-1AV_H-hC₃ (Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987)), замещая фрагменты 17-1A вариабельных областей тяжелой или легкой цепочки соответствующими фрагментами вариабельной области 7E3. Полученные химерные гены тяжелой цепочки вместе с химерными генами легкой цепочки котрансгенно переносят в клетки SP2/0 и получают устойчивые клеточные линии, секретирующие антитела ₁, K и ₃, K.

Пример 3

Первичные исследования по применению химерного 7E3 Fab для лечения людей

Получение фрагментов химерного 7E3 Fab

Фрагмент химерного 7E3 (c7E3) получаютт ферментацией очищенного химерного 7E3 IgG (тяжелая цепочка гамма 1, легкая цепочка каппа) с помощью протеолитического фермента папаина. Фрагмент Fab выделяют с помощью нескольких стадий очистки, направленных на получение продукта, который свободен от других фрагментов ферментации и других загрязняющих компонентов (в частности, белка, нуклеиновой кислоты, вирусов). Конечный продукт получают в виде стерильного непирогенного раствора, содержащего 2 мг моноклонального химерного 7E3 Fab на миллилитр 0,15 М раствора хлорида натрия, 0,01 М раствора фосфата натрия с pH 7,2. В некоторые препараты добавляют полисорбат 80 до конечной концентрации 0,001% (вес./об.). Непосредственно перед использованием продукт отфильтровывают через фильтр с размерами пор 0,22 микрон, который слабо связывает белок. Продукт хранят при 2-8^oC.

Фармакокинетика: вымывание c7E3 Fab из плазмы человека

Вымывание фрагмента химерного 7E3 (c7E3) Fab из плазмы изучают у трех пациентов, страдающих от хронического заболевания коронарной артерии. После дозы 0,20 мг/кг c7E3 Fab, которое вводят внутривенно в виде вливания в течение пяти минут в различные периоды времени, начиная от двух минут и до 72 час, берут пробы крови. Ожидалось, что некоторые порции антитела будут находиться в плазме в несвязанном состоянии. Для определения этого несвязанного компонента антитела необходимо быстро отделить плазму от тромбоцитов, чтобы предотвратить последующее связывание ex vivo. Содержание в плазме свободного с7E3 Fab определяют твердофазным иммуноферментативным анализом (Е1A). В этом анализе используют аффинность выделенного антимуринового 7E3 IgG, которое получают из сыворотки кролика, для твердофазного захвата и систему определения на основе биотинилированного производного того же самого препарата антигена анти-7E3, полученного от кролика. Полученные результаты приведены в Таблице 1 (см. в конце описания).

Если в виде несвязанного антитела в плазме определяли бы всю введенную дозу 7E3, то теоретическая максимальная концентрация антитела составила бы приблизительно 5,0 мкг/мл (0,25 мг/кг, деленные на 40 мл плазмы на килограмм). Однако эта теоретическая максимальная концентрация не могла бы быть получена, поскольку большая часть введенного антитела связывается с тромбоцитами. На самом деле при наиболее ранних временах проведения измерений (2 минуты) средняя концентрация c7E3 Fab в плазме (n = 2) составляет 2,43 мкг/мл; это значение соответствует наблюдаемой максимальной концентрации в плазме (C_max). Данные, полученные для последующих после введения антитела интервалов времени, показывают быстрое первоначальное убывание содержания 7E3 Fab в плазме. К моменту проведения измерений по прошествии 1 час и 24 час количество оставшегося в плазме введенного антитела (n = 3) составляет, соответственно, 0,5 мкг/мл и 0,1 мкг/мл. График зависимости концентрации (нг/мл) антитела в плазме от времени, приведенный на фиг. 5, показывает быстрое первоначальное вымывание c7E3 Fab из плазмы у всех трех пациентов.

Проводят предварительный анализ фармакинетических свойств фрагмента c7E3 Fab. Для того чтобы удовлетворить результаты, полученные для концентрации в плазме, применяют несколько моделей, в том числе несколько смешанных (случайные и фиксированные эффекты) линейных моделей, а также стандартных двухкомпартментальных и некомпартментальных моделей. Данные о содержании свободного антитела в плазме неадекватно удовлетворяют стандартным фармакинетическим моделям. Поскольку объектом воздействия c7E3 Fab является рецептор, расположенный на тромбоцитах, то нельзя ожидать, что содержание свободного антитела в плазме не будет каким-либо простым образом связано с его концентрацией по месту его действия. Первоначальное быстрое удаление c7E3 Fab из плазмы частично свидетельствует о быстром связывании антитела с рецепторами GPIIb/IIIa. Было показано, что из изученных моделей для описания величин концентраций в плазме наиболее подходит линейная модель вероятностных эффектов. С помощью этой модели определяют предварительные значения фармакинетических параметров C1_p, V_d и t_1/2, которые приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Значения фармакинетических параметров для c7E3 Fab (*)

Параметр - Значение

C1_p (пропорции/час) - 15,6

V_d (L) - 6,8

t_1/2 (час) - 0,1 (6 мин)

(*) Для соответствия полученным данным применяют линейную модель со случайными эффектами

C1_p = Величина очищения плазмы определяется как скорость уменьшения концентрации в плазме, деленная на концентрацию, и выражается как скорость в час, т. е. если скорость в данное время остается неизменной в течение часа, то вычисленное значение будет пропорционально количеству лекарства, которое удаляется в течение этого часа.

V_d = Объем распределения определяется как назначенная доза, которую делят на измеренную концентрацию в плазме, умноженную на объем плазмы. Для проведения расчетов используют объем плазмы 3 л, типичный для человека с массой 70 кг.

t_1/2 = Полупериод очищения

Пробы мочи у людей

Образцы мочи собирают у трех пациентов, страдающих от стойких заболеваний коронарной артерии, которым внутривенно вводят 0,25 мг/кг c7E3 Fab (данные по очищению плазмы для этих же трех пациентов приведены ранее). Общий диурез отбирают через следующие промежутки времени после инъекции: от 0 до 2 час, от 2 до 6 час, от 6 до 12 час и от 12 час до 24 час. Кроме того берут также образец мочи до назначения дозы. Отдельные собранные образцы мочи анализируют на наличие свободного 7E3 Fab, используя слегка видоизмененную методику проведения твердофазного иммуноферментативного анализа, рассмотренную ранее. Во всех случаях c7E3 Fab в моче не обнаружено.

Преклиническая токсикология

Изучение преклинической токсикологии проводят у 18 обезьян (Cyonomolgus и Rhesus), используя химерные 7E3 Fab. Назначают дозу болюса до 0,6 мг/кг с последующим вливанием в количестве до 0,8 мкг/кг/мин в течение 96 час (включает исследования с гепарином, аспирином и рекомбинантным тканевым активатором плазминогена). У всех обезьян для всех доз и для всех комбинаций антитело 7E3 является безопасными и легко переносится, при этом не наблюдается вызываемых кровотечением осложнений или других вредных эффектов.

Эскалация дозы химерного 7E3 Fab у пациентов со стойкой стенокардией

Изучение эскалации дозы проводят, выбрав 52 пациента, страдающих от стойкой стенокардии (мужчины в возрасте от 43 до 75 лет), которым антитромбоцитарная терапия не назначалась в течение более 10 дней. Назначают различные режимы дозировок. Пациенты получают либо единичные внутривенные дозы болюса в количестве от 0,15 до 0,25 мг/кг химерного 7E3 Fab (20 пациентов), или им назначают болюс с последующим непрерывным внутривенным вливанием (10 мкг/мин) в течение от 12 до 96 час (32 пациента).

Блокаду рецептора GPIIb/IIIa, агрегацию тромбоцитов в ответ на действие 20 мкМ АДФ (агонист) и времена кровотечения определяют через 2 час после назначения дозы с 7E3 Fab в виде болюса (0,15-0,30 мг/кг). Блокаду рецептора и агрегацию тромбоцитов в ответ на действие агониста определяют в соответствии с известной методикой (H. K. Gold et al., J. Clin. Invest. 86: 651-659 (1990)). Времена кровотечения определяют по методу Simplate. С увеличением дозы наблюдается прогрессирующее усиление блокады рецептора, на что указывает выраженное в процентах количество блокированных рецепторов (определяют по доступности мест связывания рецептора). Усиление блокады рецептора сопровождается подавлением агрегации тромбоцитов (определяется как процент от значения до введения лекарства или от базового значения) и увеличением времени кровотечения.

Пиковое значение для всех трех параметров наблюдается для дозы 0,25 мг/кг. Эта доза соответствует концентрации в плазме, равной 5 мкг/мл - концентрации, при которой слабое ингибирование наблюдается в обогащенном тромбоцитами образце плазмы, полученном от здорового субъекта, который выдерживают в инкубаторе в течение 15 минут в кювете агрегометра в присутствии возрастающих концентраций химерного 7E3 Fab. (Степень агрегации плазмы здорового субъекта определяют как выраженное в процентах количество света, прошедшего через кювету. Перед назначением агониста плазма является относительно непрозрачной и процент прошедшего света выбирают за ноль. После добавления в контрольный образец, не содержащий антитела, агониста АДФ светопропускание прогрессивно увеличивается по мере развития агрегации. Однако если присутствует c7E3 Fab, то наблюдается зависимое от дозы подавление агрегации и полное ингибирование наблюдается при концентрации 5 мкг/мл c7E3 Fab).

Определяют продолжительность действия с точки зрения блокады рецептора, подавления агрегации тромбоцитов и времени кровотечения. Пиковое значение воздействия на блокаду рецептора, агрегацию тромбоцитов и время кровотечения наблюдается через 2 час, а затем медленно ослабевает. Времена кровотечения возвращаются к близкому к нормальному значению через 6-12 час.

Поскольку пиковое значение блокады рецепторов и функционального ингибирования достигается при дозе 0,25 мг/кг, исследуют длительность подавления тромбоцитов в течение продолжительного вливания, которое проводят после назначения этой дозы, с целью определить, можно ли увеличить длительность подавления тромбоцитов. Степень блокады рецептора, степень подавления агрегации тромбоцитов и увеличение времени кровотечения поддерживают в течение продолжительного вливания пяти пациентам, которые получают по 10 мкг/мин химерного 7E3 Fab в течение 72 час после первоначальной дозы 0,25 мг/кг. Восстановление начинается сразу же после того, как вливание прекращают. Аналогичные результаты наблюдаются после вливаний в течение 12, 24 и 96 час.

Ни у одного из пациентов не отмечена аллергическая реакция. Не наблюдается серьезных тенденций, вызываемых лечением, в гематологии или в значениях, полученных в химической лаборатории. Не наблюдается также каких-либо серьезных случаев кровотечения. Незначительные случае кровотечения являются редкими и включают временное умеренное кровотечение из носа и умеренное выделение крови из десен у больных, страдающих периодонтальными заболеваниями. Результаты испытаний показывают, что химерные 7E3 Fab можно назначать пациентам, используя режимы дозировки, которые приводят к глубокому подавлению функций тромбоцитов вплоть до нескольких дней.

Данные по иммуногенности

При проведении испытаний с муриновыми 7E3 F(ab") и Fab (150 пациентов) иммунные ответные реакции, которые определяют с помощью чувствительного иммуноферментного анализа, возникают у 16% (24/150) пациентов. Все реакции имеют низкий титр, обычно в интервале от 1:50 до 1:200. Подвергавшаяся обработке группа включает здоровых добровольцев, которым вводят дозы 0,01 - 0,25 мг/кг муринового 7E3 F(ab")₂, пациентов, страдающих неустойчивой стенокардией, которым вводят 0,05 - 0,20 мг/кг муринового 73 F(ab")₂, и пациентов, подвергавшихся чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии, которым назначают 0,1 мг/кг муринового 7E3 F(ab") или 0,15 - 0,35 мг/кг муринового Fab, а также пациентов, страдающих от стойкой стенокардии, которым с помощью внутривенной инъекции вводят единичную дозу в виде болюса с дозой 0,10 - 0,30 мг/кг муринового 7E3 Fab, и либо единичную дозу болюса в количестве 0,25 мг/кг или 0,30 мг/кг с последующим продолжительным вливанием в течение 12-36 час (0,15 мкг/кг/мин или 10 мкг/мин) муринового Fab, либо две инъекции муринового Fab с интервалом в шесть часов (единичный болюс 0,2 мг/кг - 0,30 мг/кг, а затем болюс 0,05 мг/кг).

Иммуногенность значительно снижается для химерного 7E3 Fab человек - мышь. Ни у одного из 52 пациентов, страдающих от стойкой стенокардии, которые были отобраны для проведения исследований с эскалацией дозы и которым вводили химерные 7E3 Fab (см. выше), не обнаружено иммунной ответной реакции в процессе лечения, что определяют с помощью аналогичного анализа, который пригоден для химерного Fab.

Обратимость антитромбоцитарной активности

Химерный 7E3 Fab (₁, K) медленно отделяется от тромбоцитов, а свободный химерный 7E3 Fab быстро вымывается из плазмы при циркуляции (см. ранее). Таким образом, антитромбоцитарное воздействие химерного 7E3 является заметно обратимым при назначении тромбоцитов от случайного донора. Это обратимое или антидотное воздействие при переливании тромбоцитов показано для двух пациентов, которым назначали либо муриновое Fab, либо химерное Fab и которым вводят тромбоциты от случайного донора в то время, когда подавление агрегации тромбоцитов у этих пациентов практически закончилось. Восстановление функции тромбоцитов определяют, измеряя времена кровотечения. Свойство обратимости полезно в тех случаях, когда вследствие кровотечения возникает необходимость восстановления функций тромбоцитов у пациента.

Пример 4

Использование химерного антитела 7E3 для предотвращения тромботических осложнений при избирательной пластической операции на коронарной артерии

Чрескожная чресполостная реконструкция коронарной артерии, например, методом баллонной или коронарной атеректомии является эффективным способом увеличения просвета подверженных стенозу коронарных артерий. Для этой операции существует риск острой закупорки коронарной артерии как в процессе ее проведения, так и после пластической операции на сосудах. Сообщается, что уровень коронарной окклюзии варьирует приблизительно от 3 до 6% от общего количества случаев проведения избирательной пластической операции на сосудах (K. M. Detre et al., Circulation 82: 739-750 (1991)) и она является основной причиной осложнений и смертности при госпитализации. У пациентов, входящих в группу с высоким риском, частота возникновения основных сердечно-сосудистых случаев, вызываемых тромбозом, составляет 10-20%.

Острая коронарная окклюзия в процессе или сразу же после проведения пластической операции на коронарной артерии, видимо, вызывается комбинацией глубокого поражения стенок артерии, в результате чего возникает частичная закупорка "лоскутами интимы", на которую накладывается процесс формирования тромба, или просто формированием тромба в месте поражения стенки сосуда. В моделях животных повторной закупорке после успешного тромболиза предшествуют периоды циклического сокращения и восстановления тока крови через коронарную артерию, которые получили название "циклических изменений тока крови". Указанные циклические изменения тока крови представляют собой феномен, практически полностью управляемый тромбоцитами, и возникают вследствие повторяющегося накопления и смещения агрегации тромбоцитов в местах возникновения коронарного стеноза и поражения эндотелия. Описаны случаи циклических изменений тока крови у людей после проведения пластических операций на коронарных артериях. Химерное антитело 7E3 можно использовать для подавления функции тромбоцитов во время проведения пластической операции на сосудах и тем самым предотвращать агрегацию тромбоцитов и тромбоз. Химерное антитело 7E3 особенно полезно для пациентов, подверженных значительному риску развития тромботических закупорок. Этих пациентов можно определить на основе анатомических (в частности, по характеру поражений в месте возникновения стеноза, которые наблюдают с помощью ангиографии) или клинических факторов риска (в частности, инфаркта миокарда, неустойчивой стенокардии, диабета, женщин в возрасте 65 лет и старше), которые создают предрасположенность к острому коронарному тромбозу и вызывают клинические синдромы острого инфаркта миокарда, нестойкой стенокардии или внезапной закупорки кровеносного сосуда.

Химерное антитромбоцитарное антитело при избирательной чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии

Испытание проводят в две стадии. Главной целью первой стадии является определение безопасной и оптимальной дозы химерного 7E3 Fab для пациентов, которым предстоит провести избирательную чрескожную чресполостную реконструкцию коронарной артерии. Вторую стадию проводят с целью предварительно оценить безопасность и эффективность химерного 7E3 (c7E3) при назначении инъекции болюса с последующим различным по длительности вливанием. Изучению на второй стадии подвергают пациентов, которым проведена избирательная реконструкция коронарной артерии и которые подвержены значительному риску возникновения ишемических осложнений. Пациенты, входящие в группу с высоким риском, включают пациентов с неустойчивой стенокардией или стойкими заболеваниями коронарных артерий со специфическими поражениями типа B и C. В Таблице 3 приведены критерии определения пациентов, входящих в группу повышенного риска, а в Таблице 4 (см. в конце описания) приведены типичные для поражений характеристики, которые определяют методом ангиографии. Первичную эффективность определяют как подавление функций тромбоцитов и предотвращение возникновения тромботических осложнений. Для проведения обеих стадий испытания можно выбирать мужчин в возрасте от 18 до 76 лет и неспособных к деторождению женщин в возрасте от 18 до 76 лет.

Стадия I

На стадии 1 из пациентов образуют группы, которые получают одну внутривенную инъекцию болюса фрагмента химерного 7E3 (₁, K) Fab (который получают и формулируют в виде композиции, как это описано в Примере 3). Всего лечению подвергают 15 пациентов (3 женщины и 12 мужчин). Средний возраст пациентов составляет 62 года (в интервале от 46 до 76 лет). Демографические показатели приведены в Таблицах 5A и 5B (см. в конце описания) для всех пациентов, которым назначалась одна доза, и для пациентов из группы с индивидуальными дозировками.

Пять пациентов, каждый (n = 5), получают единичные дозы c7E3 Fab в количестве 0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг или 0,25 мг/кг приблизительно за 30 минут до проведения избирательной чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии по методике с эскалацией дозы. Всем пациентам во время операции дают аспирин (стандартная доза) и проводят их полную антикоагулянтную обработку гепарином (стандартная доза).

Хотя на стадии I операции чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии рассматриваются как избирательные для пациентов, шесть из пятнадцати пациентов имеют остаточную неустойчивую стенокардию. Расположение расширенных частей в коронарной артерии суммируется в Таблице 6 (внизу). Семи из пятнадцати пациентов, которых обследуют на стадии 1, проведена чрескожная чресполостная реконструкции коронарной артерии с одним поражением в одном сосуде, шести пациентам проведена чрескожная чресполостная реконструкции коронарной артерии со множеством поражений в одном сосуде, а двум пациентам проведена чрескожная чресполостная реконструкции коронарной артерии в нескольких сосудах (Таблица 6, см. в конце описания).

Критерии эффективности для получения оптимальной единичной дозы c7E3 были позднее определены как минимальная доза, введение которой позволяет достичь через 2 часа средних значений следующих величин: (1) удлинения времени кровотечения по крайней мере на 20 минут; (2) блокаду рецептора GPIIb/IIIa, так что блокируется более чем 80% мест рецептора по сравнению с базовым уровнем; и (3) ингибирование агрегации тромбоцитов в ответ на действие 20 мкМ АДФ до значения не более 20% от базового уровня.

Стадия II

На стадии II пациентам в виде болюса вводят дозу 0,25 мг/кг, а затем проводят продолжительное вливание c7E3 Fab в количестве 10 мкг/мл в течение 6, 12 или 24 час. При проведении исследований на стадии II испытаниям подвергают группу из 32 пациентов (8 женщин и 24 мужчины). Средний возраст пациентов, которым назначают c7E3 Fab, составляет 57 лет (в интервале от 38 до 76). Контрольную группу составляют девять пациентов (1 женщина и 8 мужчин). Средний возраст пациентов в контрольной группе составляет 56 лет (в интервале от 37 до 74). Контрольную группу составляют пациенты, входящие в группу повышенного риска, как это уже рассмотрено ранее, которые не получают с 7E3, однако за ними ведется наблюдение так же, как и за пациентами, которым назначают лекарство. Демографический профиль для всех пациентов на стадии II и для пациентов в группах с индивидуальной дозировкой приведен в Таблицах 5A и 5B.

Обработку с помощью c7E3 Fab проводят за 30 минут перед баллонным раздуванием при проведении чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии. Аспирин и гепарин назначают в соответствии с клинической практикой, при этом рекомендуется, чтобы после окончания пластической операции на сосудах вводили гепарин в количестве 800 единиц в час. В 6-часовую и 12-часовую группу входят по одиннадцать пациентов, а в 24-часовую группу входят десять пациентов.

Из 32 пациентов, которым назначали c7E3 Fab, двадцати одному пациенту проводят чрескожную чресполостную реконструкцию одной коронарной артерии с одним поражением, семи пациентам проводят чрескожную чресполостную реконструкцию одной коронарной артерии с несколькими поражениями, а трем пациентам проводят чрескожную чресполостную реконструкцию нескольких коронарных артерий с несколькими поражениями (Таблица 6). Тип чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии для одного пациента не установлен. Данные о расположении расширяющихся частей в коронарной артерии для пациентов на стадии 11 суммированы в Таблице 6. Из девяти контрольных пациентов восьми пациентам проводят чрескожную чресполостную реконструкцию одной коронарной артерии с одним поражением, а одному пациенту проводят чрескожную чресполостную реконструкцию нескольких коронарных артерий с несколькими поражениями. 32 пациента, которым назначали с 7E3 Fab, и 9 пациентов контрольной группы имеют клинические или ангиографические характеристики, которые позволяют классифицировать их как пациентов с высоким риском развития ишемии миокарда после проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии. Два пациента, которым назначали c7E3 Fab, и один пациент из контрольной группы имеют неустановленные факторы риска. Оставшиеся 30 пациентов, которым назначали c7E3 Fab, и 8 пациентов контрольной группы имели по крайней мере одну идентифицируемую клиническую особенность или ангиографическую характеристику, в соответствии с которой они подвержены риску развития ишемических осложнений, а для большинства из них имеется более одного фактора риска.

Указанные факторы риска для контрольной группы и группы, которой вводили c7E3, суммируются в Таблице 7, а индивидуальный перечень факторов риска для каждой группы приведен в Таблицах 8A-8D (см. в конце описания).

Подавление функции тромбоцитов

(Результаты стадии I)

С целью изучения активности химерного 7E3 Fab при подавлении функции тромбоцитов, последовательно проводят измерения доступности мест связывания рецептора GPIIb/IIIa (регистрируют как среднее значение количества заблокированных GPIIb/IIIa, выраженное в процентах), определяют среднюю величину ингибирования индуцируемой действием агониста агрегации тромбоцитов в ответ на введение 20 мкМ АДФ и среднее время кровотечения. Блокаду рецептора и агрегацию тромбоцитов в ответ на действие агониста проводят в основном по описанной методике (H. K. Gold et al. , J. Clin. Invest., 86: 651- 659 (1990)). При проведении измерений на блокаду рецептора доступность рецептора определяют в момент времени 0 и количество доступных рецепторов принимают за 0% блокированных рецепторов (базовое значение). Значения в других временных точках приведены относительно количества рецепторов, доступных для базового значения, или результатов, полученных до введения дозы). Время кровотечения определят по методу Simplate.

На фиг. 6 показаны ответные реакции по прошествии двух часов на введение одной дозы болюса химерного 7E3 Fab для блокады рецептора (фиг. 6A), агрегации тромбоцитов (фиг. 6B) и времени кровотечения (фиг. 6C). Непрерывные линии на фиг. 6 показывают средние значения для пяти обследованных пациентов из каждой группы. При увеличении дозы c7E3 Fab прогрессивно возрастает блокада рецепторов, что показано в виде процента блокированных рецепторов (фиг. 6A). Среднее значение блокированных рецепторов по прошествии двух часов составляет 53,8% для группы с дозировкой 0,15 мг/кг, 80,2% для группы с дозировкой 0,20 мг/кг и 86,6% для группы с дозировкой 0,25 мг/кг. Увеличение блокады рецептора сопровождается ингибированием агрегации тромбоцитов, что показано в виде процента по отношению к значению до введения дозы (фиг. 6B). Средняя величина подавления агрегации тромбоцитов через два часа составляет 46,1%, 44,6% и 17,9% от базового значения для групп, соответственно, с дозировкой 0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг и 0,25 мг/мг. Аналогично через два часа после вливания наблюдается зависимое от дозы увеличение времени кровотечения (измерения времени кровотечения прерывают по истечении 30 минут, фиг. 6C). Среднее время кровотечения составляет 26,0 минут, 27,5 минут и 30 минут для дозировок 0,15 мг/кг, 0,20 мг/кг и 0,25 мг/мг, соответственно. Как показывают данные измерений, в условиях проведения эксперимента оптимальная доза для антитромбоцитарной активности составляет 0,25 мг/кг.

На фиг. 7 показана продолжительность действия после единичной дозы болюса в количестве 0,25 мг/кг, т.е. дозы, при которой наблюдается максимальное воздействие на тромбоциты. Линии показывают средние значения от времени 0 (базовое значение) до 24 часов (отложены по оси x) для блокады рецептора (верхний график, фиг. 7A), агрегации тромбоцитов (средняя диаграмма, фиг. 7B) и времени кровотечения (нижняя диаграмма, фиг. 7C). Пиковые значения для блокады рецептора, агрегации тромбоцитов и времени кровотечения наблюдаются через два часа, а затем постепенно снижаются. Время кровотечения возвращается к значению, близкому к нормальному, через 12 час. Ни у одного из пациентов не наблюдается снижение уровня содержания тромбоцитов.

Подавление функции тромбоцитов

(Результаты стадии II)

На стадии II данные по блокаде GPIIb/IIIa и агрегации тромбоцитов получают не для всех пациентов, а эксперименты по вливанию в течение 24 час проведены лишь для двух пациентов. По этой причине проводится лишь анализ данных, полученных для вливания в течение 6 часов и 1 2 часов. В обеих группах, которым назначали вливание в течение 6 часов и 12 часов, среднее значение для блокады рецептора поддерживается на уровне, превышающем 80% от базового значения, в течение всего периода вливания. Среднее значение агрегации тромбоцитов, индуцируемое введением 20 мкМ АДФ, для 6-часовой и 12-часовой групп составляет через 2 часа 13% и 15% от базового значения, соответственно, и для 12-часовой группы сохраняется на уровне менее 25% в течение всего периода вливания. Среднее значение времени кровотечения, измеряемое по прошествии двух часов, для всех трех групп составляет более 30 минут. На фиг. 8 проводится анализ результатов, полученных для пациентов, которым после первоначальной дозы 0,25 мг/кг в течение 12 час непрерывно вводят вливанием химерное 7E3 Fab в количестве 10 мкг/мин. 12-часовой период вливания показан в виде слегка заштрихованных областей, а линии соответствуют средним значениям. Степень блокады рецептора, подавления агрегации тромбоцитов и удлинения времени кровотечения поддерживается в течение всего периода вливания, и уменьшение начинается, как только вливание прекращают (см. Таблицу 9).

Клинические последствия стадии I и стадии II

Ни у одного из 47 пациентов, которым назначали c7E3 Fab, не отмечено случаев тромбоза как во время, так и после проведения чрескожной чресполостной реконструкция коронарной артерии. За исключение двух пациентов, для всех 47 пациентов операция по чрескожной чресполостной реконструкция коронарной артерии прошла успешно, при этом по данным ангиографии поражения уменьшились до величины менее 50% от диаметра кровеносного сосуда. Из двух неудачных попыток проведения расширения у пациента 01-012 величина сужения левой передней коронарной артерии уменьшилась от 90% до 70%, однако осуществление дальнейшего расширения оказалось технически невозможным. У второго пациента (пациент 01-019), о котором речь пойдет ниже, операция расширения вначале была успешной, однако потребовала установки внутрикоронарного стента, с целью расслоения по главному продольному направлению (тромбоз не наблюдается). У одного из 9 контрольных пациентов (01-022) произошла внезапная закупорка тромбом через 15 минут после начала операции, потребовавшая проведения экстренного обходного шунтирования коронарной артерии, которое он перенес успешно. Другие 8 контрольных пациентов прошли успешную операцию расширения, при этом величина остаточного сужения составила 50% или менее.

Пациенту 01-019 (из группы 12-часового вливания) провели баллонное расширение 95% поражений левой огибающей артерии с остаточным сужением 50%. После проведения операции у пациента, видимо, наблюдался вазовагусный синдром, который привел к брахикардии, гипотонии и временной остановке сердца. Пациента вернули в отделение катетеризации и ему экстренно установили внутрикоронарный стент, с целью расслоения по главному продольному направлению. Стент сместился в левую главную коронарную артерию, и пациент был направлен для проведения операции экстренного обходного шунтирования коронарной артерии. По заявлению эксперта, данные, полученные ангиографией и во время проведения операции, свидетельствуют об отсутствии внутрикоронарного тромбоза. Этот пациент также перенес периоперативный инфаркт миокарда. Пациент выздоровел и был выписан через 8 дней после операции.

У трех пациентов, которым назначали c7E3 Fab, наблюдались незначительные отдельные приступы боли в груди после проведения операции по чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии. Пациент 01-009 (из группы с единичной дозой 0,25 мг/кг) почувствовал боли в груди через 9 часов после назначения дозы, пациент 05-003 (группа с 12-часовым вливанием) перенес приступ стенокардии через 21 час после назначения c7E3, а пациент 06-003 (группа с 12-часовым вливанием) перенес приступ стенокардии через 2 дня после назначения c7E3. По сообщению медицинского эксперта, эти случаи грудной боли не связаны с симптомами ишемии, которые могли бы свидетельствовать о повторной закупорке.

Пациент 02-004 (из группы с единичной дозой 0,25 мг/кг) испытывал длительные боли в груди перед назначением c7E3 Fab, которые продолжались во время проведения чрескожной чресполостной реконструкция коронарной артерии. На следующий день изменения в электрокардиограмме, сопровождающиеся повышенным содержанием сердечных ферментов (обнаружено накануне), указали на то, что пациент перенес периоперативный инфаркт миокарда, не соответствующий зубцу Q (пиковое содержание креатининкиназы = 462, MB фракция = 64).

Во время проведения исследований зафиксирован лишь один смертельный исход, который произошел через 52 дня после назначения c7E3 Fab. Пациент 06-002 (из группы с 6-часовым вливанием), история болезни которого включает коллагеноз легкого, застойную сердечную недостаточность и неустойчивую стенокардию, прошел успешную операцию по чрескожной чресполостной реконструкции проксимальной левой передней нисходящей коронарной артерии. Во время операции у пациента развилась стойкая фибрилляция желудочков, что дважды потребовало применения электрической дефибрилляции, однако после этого операция закончилась без последствий. После того как пациент покинул отделения катетеризации, у него развился цианоз, который вначале привел к необходимости применения мочегонных средств и проведения кислородной терапии. Однако далее у этого пациента развилась стойкая респираторная недостаточность, которая позднее потребовала применения аппарата искусственного дыхания. Последующее лечение пациента осложнилось сепсисом, респираторным дистресс-синдромом, малокровием (потребовавшим многочисленные переливания крови) и ишемией сердца. Это пациент скончался на 52 день после назначения c7E3 Fab вследствие отказа многих органов.

Безопасность: Наблюдения на стадии I и стадии II

На фиг. 9 для пациентов из каждой дозировочной группы приведены абсолютные изменения в гематокритном числе по сравнению с базовым значением через 24 час после окончания вливания. Для сравнения приведена линия, соответствующая нулевому изменению. Данные по измерению гематокритного числа для одного пациента из контрольной группы (01-022) и одного пациента (01-019), которому назначали c7E3 Fab, не показаны, поскольку обоим пациентам в течение первых 24 часов пришлось провести переливание крови после проведения экстренной операции по обводному шунтированию коронарной артерии (см. ниже). Вторая нижняя линия со значением минус 12 указывает на изменение гематокритного числа, которое необходимо определить как соответствующее минимальному кровотечению при использовании критериев тромбоза при инфаркте миокарда (Rao et al. , J. Am. Coil. Cardiol. 11: 1-11 (1988)). Изменения в гематокритном числе одинаковы для пациентов контрольной группы и всех групп, которым назначались дозы c7E3 Fab. В Таблице 10 суммированы средние значения количества тромбоцитов через 24 часа после окончания вливания. Изменения количества тромбоцитов в не подвергавшейся обработке контрольной группе и группах, которым назначали c7E3 Fab, имеют одинаковое распределение и не обнаруживают явную зависимость от дозы.

Обсуждение результатов стадии I и стадии II

На стадии I проведенного исследования установлено, что c7E3 показывает ту же зависимость параметров от дозы при проведении чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии пациентов, которым назначают аспирин и гепарин, что и наблюдаемая для пациентов со стойкой стенокардией при испытаниях с эскалацией дозы (Пример 3). Химерное 7E3 вызывает зависимую от дозы блокаду рецепторов GPIIb/IIIa тромбоцитов, и эта блокада рецепторов коррелирует с подавлением функции тромбоцитов. Кроме того, результаты, полученные на стадии II, показывают, что продолжительного, вплоть до 24 часов, подавления функций Fab тромбоцитов можно добиться путем непрерывного вливания. У всех пациентов восстановление функции тромбоцитов начинается через 6-12 часов после прекращения вливания, независимо от длительности вливания.

Клинические последствия у пациентов, подвергавшихся воздействию c7E3, как показывают ангиографические и клинические данные, значительно лучше, чем можно было бы ожидать на основании их показателей риска. Ни у одного из пациентов из группы, подвергавшейся воздействию c7E3, не наблюдались случаи тромбоза как в течение, так и после операции. Далее, для всех пациентов, за исключением двух, операции, согласно ангиографическим данным, проведены успешно. Все пациенты, отобранные для проведения исследований на стадии II, и 6 из 15 пациентов, отобранных для проведения исследований на стадии I, являются пациентами, которые, в соответствии с их клиническими и ангиографическими характеристиками, входят в группу повышенного риска. Индивидуальные клинические факторы (такие как неустойчивая стенокардия, диабет, женщины старше 65 лет) или ангиографические специфические признаки поражений (такие как признаки типа B или C) приводят пациента в группу с повышенным риском возникновения осложнений, при этом воздействие множества факторов является кумулятивным.

17 пациентов на стадии II, которым назначали антитело, страдали от неустойчивой стенокардии и имели или не имели другие дополнительные клинические или ангиографические признаки факторов риска. Далее, неустойчивая стенокардия наблюдалась у 6 пациентов на стадии I. В ряде опубликованных результатов указывается, что неустойчивая стенокардия является главным фактором осложнений (смерть, инфаркт миокарда, экстренное обходное шунтирование коронарной артерии или повторная чрескожная чресполостная реконструкция коронарной артерии) у 10-15% пациентов (P.J. De Feyter: Editorial. Am. Heart J. 118: 860-868 (1989) и H. J. Rupprecht et al., Eur. Heart J. 11: 964-973 (1990)). Ангиографические параметры также указывают на высокую вероятность осложнений после проведения чрескожной чресполостной реконструкция коронарной артерии (S.G. Ellis, 1990, "Elective coronary angioplasty: technique and complications", In: "Textbook of Interventional Cardiology" (E.J. Topol, Ed.), W.B.Saunders Co., Philadelphia; P.J. De Feyter et al., Circulation 83; 927-936 (1991); S. G. Ellis and E.J. Topol, Am. J. Cardiol. 66: 932-937 (1/90); и АСС/АНА Task Force Report: Guidlines for percutaneous transluminal coronary angioplasty, J. Am. Coil. Cardiol. 12: 529- 545 (1988)). У двадцати девяти пациентов, подвергавшихся обработке с помощью c7E3 на стадии II, встречаются отдельные признаки осложнений, выбранные по данным ангиографии. Из них 12 пациентов имели один признак поражения типа B, 14 пациентов имели два и более признаков поражения типа B, а у троих пациентов наблюдаются признаки поражения типа C. Далее, у многих принимавших участие в испытаниях пациентов множественные поражения распространились на один или несколько сосудов, что также потенциально увеличивает риск возникновения осложнений после операции (М. Samson et al., Am. Hearfe J. 120: 1-12 (1990)). На основе как количества, так и степени тяжести определенного ангиографически фактора риска, можно было ожидать появление ишемических осложнений у 10-20% пациентов (S. G. Ellis, "Elective coronary angioplasty; technique and complications", In: "Textbook of Interventional Cardiology" (E.J. Topol, Ed.), W.B. Saunders Co. , Philadelphia (1990); P.J. De Feyter et al., Circulation 83: 927-936 (1991); S. G. Еllis and E.J. Topol, Am. J. Cardiol. 66: 932-937 (1990)).

Контрольную группу также составляют пациенты, входящие в группу повышенного риска. Однако в общем случае количество и степень тяжести факторов риска у пациентов контрольной группы ниже. У пяти из девяти пациентов отмечен один фактор риска или одно поражение типа B (4 пациента) или неустойчивая стенокардия (1 пациент), в то время как 26 из 32 пациентов, которым на стадии II вводили c7E3, имели либо поражение типа С, либо два или более признаков высокого риска. Это различие в статусе риска между двумя группами является значительным (в соответствии с точным тестом по Фишеру, p = 0,018). Интересно отметить, что контрольные пациенты со внезапной закупоркой (пациент 01-022, неустойчивая стенокардия с двумя поражениями типа B) был одним из трех пациентов, которые были определены как пациенты, имеющие более одного фактора риска (один пациент из контрольной группы имел неустановленный фактор риска). Таким образом, в то время как у одного из трех пациентов из контрольной группы с наиболее высоким риском поражений отмечены тромботические явления, ни у одного из 26 пациентов, которым вводили c7E3 Fab, входивших в эту группу с наибольшим риском, тромботические явления не отмечены.

Это исследование также показало, что потенциальное антитромбоцитарное воздействие c7E3 может быть безопасно реализовано у пациентов, которых уже лечили внутривенным введением гепарина и оральным назначением аспирина. Случаи кровотечения у контрольной группы и группы, получавшей c7E3, сравнимы между собой, и для обеих групп не замечено отличий гематокритного числа от базового значения. Другие нежелательные последствия были редкими и отличались незначительной или умеренной степенью тяжести. При проведении испытаний отмечен один смертельный исход, и он произошел почти через два месяца после назначения c7E3 Fab у пациента, который страдал от коллагеноза легкого и сердечной недостаточности и у которого развилась после чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии респираторная недостаточность, осложненная сепсисом, респираторным дистресс-синдромом и в конце концов отказом в работе нескольких органов.

Наконец, ни у одного из двадцати пациентов, для которых известны результаты, не наблюдались ответные иммунные реакции, направленные против химерного антитела.

В заключение следует отметить, что химерное 7E3 потенциально безопасно подавляет функции тромбоцитов у пациентов, подвергавшихся чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии, которым назначали аспирин и внутривенно гепарин. Антитромбоцитарное воздействие можно продлить вплоть до 24 часов без значительного увеличения риска возникновения кровотечения и ответной реакции иммунной системы. Среди пациентов с высоким риском возникновения тромботических осложнений в группе, которой назначали c7E3, не наблюдается случаев тромбоза, что указывает на то, что c7E3 может уменьшить риск тромботических осложнений у отмеченных пациентов.

Пример 5

Лечение внезапной закупорки во время проведения пластической операции на сосуде

Внезапная закупорка коронарной артерии во время проведения пластической операции на кровеносном сосуде является основным фактором осложнений и смертности при проведении указанной операции. Они возникают приблизительно в 3-6% случаях проведения избирательных пластических операций (K.M. Detre et al., Circulation 82: 739-750 (1991)), однако отмечается, что они возникают у 20-40% пациентов, которым проводят пластические операции при неустойчивой стенокардии или после острого инфаркта миокарда (S.G. Еllis al., Circulation 77: 372-379 (1988); P.J. De Feyter et al., Circulation 83: 927-936 (1991)). Механизм внезапной закупорки заключается в остром тромбозе по месту артерии, где пластическая операция создает или расширяет площадь нарушенного слоя эндотелия. Обычно наблюдается нарушение картины течения крови, вызванное изменением геометрии сосуда, причиной которой часто является разрыв тромбоцитов, а также наблюдается обнажение субэндотелиальных элементов, в том числе интимы, и часто рассечения при проведении операции. Поскольку для инициирования образования тромба необходима адгезия и агрегация тромбоцитов, то для лечения неожиданной закупорки коронарной артерии, которая возникает при проведении пластических операций на коронарной артерии, используют фрагмент антитела 7E3 Fab.

История болезни

Пациентом являлся врач-мужчина в возрасте 45 лет, который ранее отличался хорошим здоровьем. За неделю до то, как ему была проведена пластическая операция на сосудах, он начал испытывать дискомфорт в области груди и шеи. Когда эти симптомы стали повторяться и углубляться в течение нескольких дней, он обратился за советом к коллеге. Электрокардиограмма выявила инверсию зубца T переднего предсердия. Пациент был помещен в отделение кардиологии местного госпиталя, и ему был назначен внутривенно нитроглицерин и гепарин и орально аспирин. Серия определений в течение последующих 24 часов концентрации сердечных изоферментов не выявила повышение их уровня по сравнению с обычным. Серия записей электрокардиограмм в течение следующих двух дней показала устойчивое уплощение зубца T переднего предсердия, однако не выявила никаких эволюционных изменений, характерных для инфаркта миокарда. На второй день после госпитализации пациента помещают в отделение катетеризации, где вентикулография левого желудочка показала в целом нормальное его функционирование с очень маленькой гипокинетической областью в антеролатеральной левой стенке желудочка и другой гипокинетической областью в инферопостеробазилярной зоне. Доля выброса крови из левого желудочка составляет 72%. Коронарная артериография показывает доминантность левой коронарной системы с небольшой и полностью закупоренной правой коронарной артерией. Наблюдается значительное сужение просвета в средней порции левой передней нисходящей коронарной артерии. Небольшой диффузно болезненный диагональный отросток появился дистально к средней части сужения просвета левой передней нисходящей коронарной

артерии.

Пациента вернули в кардиологическое отделение, и ему продолжили вводить внутривенно нитроглицерин и гепарин в течение еще 48 часов. В течение этого времени у него отсутствовали боли, уровень содержания сердечных изоферментов не увеличивался, а ежедневные электрокардиограммы выявляли лишь устойчивое уплощение T-зубцов для переднего предсердия. Пациента перевели в госпиталь имени Хермана (Хьюстон, штат Техас) для проведения пластической операции на сосудах.

Перед проведением пластической операции на сосудах пациент продолжал получать внутривенно нитроглицерин и гепарин, орально аспирин и ему начали орально вводить средство для блокирования кальциевого канала. Парциальное время тромбопластина сохранялось в интервале 70-90 секунд в течение нескольких дней. В начале пластической операции на сосудах время активированного свертывания крови составляло 173 секунды. Пациенту внутривенно ввели 5000 единиц гепарина. В левое устье коронарной артерии вводят направляющий катетер French JL 3.5 с номером 8. Провели визуализацию левой передней нисходящей коронарной артерии в каудальной правой передней наклонной и краниальной передней наклонной проекциях. Вначале в левую переднюю нисходящую артерию поместили проволочное направляющее катетера Допплера (от компании "Cardiome-trics, Inc.", Маунтин-Вью, штат Калифорния) с толщиной 0,018 дюйма (0,45 мм). Это проволочное направляющее катетера обычно используют для контроля за потоком крови у пациентов, подверженных значительному риску возникновения внезапной закупорки. Зарегистрировали данные о скорости потока крови в проксимальном и дистальном конце левой передней нисходящей коронарной артерии. По проволочному направляющему Допплера ввели коронарный баллонный катетер (от компании "Intrepid, Baxter, Inc.", Ирвин, штат Калифорния) размером 2,5 мм, при этом проволочное направляющее в коронарной артерии сохранилось. Баллон разместили таким образом, чтобы он охватил поражение левой передней нисходящей коронарной артерии. Провели последовательные наддувы в виде коротких импульсов с помощью баллона до достижения давления 6 атмосфер. Степень сужения просвета сосуда уменьшилась, о чем свидетельствовали данные ангиографии, при этом, как показывают данные измерения скорости потока крови, пиковое значение скорости потока возросло с 12 см/сек до 33 см/сек.

Наблюдение в течение нескольких минут после проведенного расширения показало, что сигнал скорости потока начал уменьшаться. Введение контрастного вещества показало повторное сужение места проведения пластической операции вследствие эластической тяги легкого, разрыва тромбоцитов и образования тромба. Вновь устанавливают баллон в место поражения и проводят еще один наддув из баллона. Артерия вновь расширилась, и значение скорости потока вновь составило 34 см/сек.

Контроль в течение нескольких последующих минут за сигналом о скорости потока вновь показал его уменьшение. В течение пяти минут величина сигнала была очень низкой, и средняя скорость потока составляла 3 см/сек. Пациент начал испытывать боли в груди. При проведении электрокардиограммы на мониторе наблюдалось увеличение ST-сегмента для переднего предсердия. Ангиография показала, что артерия полностью закупорена. Время активированного свертывания крови, которое определяли за несколько минут до проведения ангиографии, составляло 344 секунды.

Ввели фрагмент химерного моноклонального антитела 7E3 Fab, специфичного для рецептора GP IIb/IIIa тромбоцитов (c7E3 Fab, ₁, K). Доза составляла 0,25 мг/кг, которую водили внутривенно в течение 1 минуты. В течение приблизительно 1-2 минут после назначения c7E3 Fab скорость тока крови через коронарную артерию начала возрастать. Инъекция контрастного вещества показала возвращение коронарной артерии в раскрытое состояние, при этом его величина по критерию величины тока крови при тромбозе при инфаркте миокарда (TIMI) равнялась единице (TIMI 1). В течение последующих 15 минут поток крови через коронарную артерию продолжал возрастать и стабилизировался на пиковом значении тока крови, равном 23 см/сек. Несколько дополнительных инъекций контрастного вещества выявили улучшение тока крови. Боли в груди у пациента ослабли, и наблюдаемый на экране монитора сегмент ST уменьшился и сравнялся с базовой линией.

Через пятнадцать минут после назначения c7E3 Fab проводят ангиографию по известной методике. Сигнал скорости потока крови в этот момент составлял 20 см/сек. Непрерывный контроль в течение последующих пяти минут не показал дальнейшего улучшения в токе крови через коронарную артерию. В течение этого времени видеосигнал ангиограммы свидетельствовал о том, что в месте проведения пластической операции на сосуде все еще сохраняется небольшое количество тромба. По этой причине было решено ввести в коронарную артерию урокиназу в количестве 250000 единиц. Указанное тромболитическое средство вливают в течение приблизительно десяти минут. В течение этого времени происходит дальнейшее улучшение тока крови, что определяют с помощью проволочного направляющего катетера Допплера. По окончании внутрикоронарного вливания урокиназы, на тридцать третьей минуте после введения c7E3 Fab, провели еще одну ангиографию коронарной артерии. Артерия была открыта, и величина тока крови соответствовала значению TIMI 3. Некоторое умеренное, однако вполне определенное, остаточное сужение просвета сосуда в месте поражения сохранилось. Далее было обнаружено, что тромб уменьшился в размере, однако полностью не растворился. Было принято решение провести еще одно баллонное расширение, с тем чтобы уменьшить остаточный стеноз.

Вновь, используя проволочное направляющее, вводят баллонный катетер в место поражения. Затем проводят раздувание в течение дух минут до величины 6 атмосфер. Затем баллонный катетер вынимают, а направляющее оставляют на месте. Величина сигнала тока крови возросла до пикового значения 29 см/сек и оставалась стабильной в течение нескольких минут. Ангиограмма показала адекватное уменьшение остаточного стеноза. Затем переместили проволочное направляющее проксимально по отношению к сужению просвета сосуда и провели еще одно измерение скорости тока крови. Проволочное направляющее катетера, баллонный катетер и направляющий катетер удалили, и операция тем самым была завершена.

Пациента затем направили в кардиологическое отделение. Ему в течение нескольких дней орально вводили аспирин, нитраты, средства блокирования кальциевого канала и внутривенно гепарин, с тем чтобы величина парциального времени тромбопластина находилась в интервале 70-90 секунд. Серия электрокардиограмм показала уменьшение инверсии T-зубца для переднего предсердия, а все последующие электрокардиограммы были в норме. Значения концентрации креатинкиназы (СК) в серии проведенных измерений устойчиво составляли менее 100 единиц на литр. Число тромбоцитов перед проведением чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии составляло 248000, а последующие значения числа тромбоцитов через 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа и 48 часов после назначения c7E3 Fab составило 304000, 279000, 246000, 185000 и 222000, соответственно. Агрегация тромбоцитов, индуцируемая введением 10 мкМ АДФ, равнялась перед проведением операции 73% по данным оптической денситометрии, а последующие значения через 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа и 48 часов составили 0%, 13%, 26%, 45% и 51%, соответственно. Через неделю после проведения пластической операции на сосуде пациенту с целью осуществления контроля ввели катетер. Было показано, что левая передняя нисходящая коронарная артерия широко раскрыта со значением TIMI 3. Через несколько дней пациент был выписан домой.

Обсуждение истории болезни

Для указанного пациента комбинация 0,25 мг/кг c7E3 Fab внутривенно, 250000 единиц урокиназы внутрикоронарно и повторные расширения позволили провести успешное лечение острой ишемии коронарной артерии после внезапной закупорки при проведении пластической операции на коронарной артерии. Указанные результаты свидетельствуют о том, что антитромбоцитарная терапия, которая подавляет связывание рецептора гликопротеина IIb/IIIa тромбоцита и сшивку тромбоцитов, может оказать эффективную помощь для достижения устойчивого возобновления тока крови при острой закупорке коронарных артерий при аналогичных клинических ситуациях.

Пример 6

Рандомизованная дважды обезличенная оценка эффективности использования анти-GPIIb/IIIa фрагмента химерного антитела для предотвращения ишемических осложнений при проведении пластических операций на сосудах у пациентов, входящих в группу повышенного риска.

Обзор

Количество операций по чрескожной реваскуляризации миокарда значительно выросло после открытия пластической операции коронарных артерий в 1977 году (A. R. Gruentzig et al., N. Engl. J. Med., 316: 1127-1132 (1987)). Хотя эта операция сопровождается улучшением симптомов ишемии и качества жизни (A.F. Parisi et al., N. Engl. J. Med., 326; 10-16(1992)), серьезным недостатком ее являются острые осложнения. Подвергнутый лечению сосуд в 4-9% случаев внезапно закрывается в процессе операции или при нахождении пациента после проведения операции, а повторная закупорка или внезапная закупорка связана со значительными осложнениями и приводит приблизительно к десятикратному увеличению смертности (A. M. Lincoff et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19: 926-938 (1992); A. N. Tenaglia et al., Am. J. Cardiol., в печати (1993); К.М. Detre et al., Circulation, 82: 739-750 (1990); S.G. Ellis et al., Circulation, 77: 372-379 (1988)). Хотя механизм внезапной закупорки сосуда часто непонятен, основной вклад вносит образование тромба и расслоение сосуда. Признаки, по которым пациентов можно отнести к группе, подверженной высокому риску, включают наличие клинических синдромов, связанных с образованием тромба в коронарной артерии (неустойчивая ангина, острый или недавно перенесенный инфаркт миокарда), диабетом, женщинами и коронарными морфологическими характеристиками (места изломов, тромбы, разветвления), указывающими на повышенную сложность индивидуальных поражений (A. M. Lincroff et al., J. Am. Coll. Cardiol. , 19: 926-938 (1992); S.G. Ellis et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17 (Suppl. B): 89B-95B (1991); B. Moushmoush et al., Cath. Cardiovasc. Diagn., 27: 97-103 (1992); и R. K. Myler et al., Circulation, 82 (Suppl. 11): 11-88-11-95 (1990).

Хотя было показано, что аспирин уменьшает риск возникновения внезапной закупорки сосудов и острого инфаркта миокарда у пациентов, которым проводят пластические операции на сосудах (L. Schwartz et al., N. Engl. J. Med., 318: 1714-1719 (1988): E. S. Barnathon et al., Circulation, 76: 125-134 (1987), его воздействие на функции тромбоцитов является относительно слабым и случаи ишемии продолжают возникать у 10-20% пациентов, входящих в группу повышенного риска, которым назначают аспирин (A.M. Tenaglia et al., J. Am. Coll. Cardiol. (193, в печати)). Напротив, назначение фрагмента Fab химерного антитела 7E3 людям приводит к значительной блокировке рецептора GPIIb/IIIa и подавлению агрегации тромбоцитов (см. Пример 4, Подавление функции тромбоцитов).

При проведении предварительного изучения пациентов, которым проводят пластические операции на сосудах, было показано, что с 7E3 Fab уменьшает риск возникновения внезапной закупорки сосуда во время и после проведения чрескожного хирургического вмешательства (см. Пример 4 и S.G. Ellis et al., Cor. Art. Dis. , 4: 167-75 (1993)). Настоящее рандомизованное исследование предпринято для с целью дальнейшей оценки эффективности фрагментов химерного антитела, которые селективно связываются с рецептором гликопротеина IIb/IIIa, для предотвращения ишемических осложнений (Исследование EPIC: Изучение c7E3Fab при предотвращении вызванных ишемией осложнений). В частности, оценку клинической эффективности фрагмента 7E3 Fab (c7E3 Fab) у пациентов, входящих в группу повышенного риска возникновения послеоперационных осложнений, которым проводят пластические операции на сосудах, осуществляют в обезличенном рандомизованном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля. В исследовании принимают участие 2099 пациентов в 56 центрах, которым предписано проведение пластической операции на коронарной артерии или прямой атеректомии в ситуациях с повышенным риском; тяжелая форма неустойчивой стенокардии с остаточной болью и зарегистрированными изменениями в электрокардиограмме, развивающийся инфаркт миокарда или клинические или коронарные морфологические признаки поражения, связанные со значительным риском развития послеоперационных осложнений. Пациентам назначают либо (а) плацебо в виде болюса плюс вливания, (b) болюса c7E3 Fab и вливание плацебо или (с) болюс и вливание c7E3 Fab. Основными результатами, которые приводят к остановке дальнейших испытаний, являются составные результаты, включающие проявление одного из следующих компонентов: смерть, нефатальный инфаркт миокарда, незапланированная хирургическая реваскуляризация или повторная пластическая операция на сосудах, незапланированная имплантация коронарного стента или внутриаортальное размещение баллонного насоса при стойкой ишемии.

Назначение болюса и проведения вливания ведет к уменьшению на 35% количества основных случаев прекращения испытаний (12,8 против 8,3%, p = 0,008), в то время как при введении одного болюса уменьшение составило 11% (12,8 против 11,4%, p = 0,43). Уменьшение количества случаев осложнений, которое достигается при назначении болюса плюс вливания, согласуется с каждым из компонентов основных случаев прекращения испытаний и, далее, согласуется с основными подгруппами пациентов, в том числе с возрастом, полом, предрасположенностью к возникновению внутрикоронарного тромба и острыми формами заболеваний коронарных сосудов (инфаркт миокарда, неустойчивая стенокардия). Случаи кровотечения и переливания крови возросли для группы, получавшей болюс и вливание, и были умеренными при назначении одного лишь болюса. Проведенное изучение пациентов, входящих в группу повышенного риска, которым проводили операции на коронарных артериях, показало, что назначение фрагмента антитела, направленного против рецептора IIb/IIIa тромбоцитов, обеспечивает длительное клиническое облегчение за счет значительного снижения вызванных ишемией осложнений.

Методы

На основании предыдущих испытаний, в которых проведена стратификация факторов риска при проведении обычного чрескожного хирургического вмешательства, пациентов отбирают лишь в том случае, если они подвержены значительному риску возникновения внезапной закупорки сосуда и не имеют основных противопоказаний вследствие высокого риска возникновения кровотечения. Считается, что пациент находится в группе повышенного риска, если он входит в одну из трех клинических групп: (1) с острым развитием инфаркта миокарда в течение 12 часов после появления симптомов, которые указывают на необходимость проведения прямого или "спасительного" чрескожного хирургического вмешательства; (2) с ранней стенокардией после инфаркта миокарда или неустойчивой стенокардией с по крайней мере двумя случаями остаточной стенокардии, связанными с остаточными изменениями на электрокардиограмме в предшествующие 24 часа несмотря на терапию; или (3) с клиническими и/или ангиографическими критериями в соответствии с критериями Американской кардиологической ассоциации/Американского колледжа кардиологии (критериями АНА/АСС) (T.J. Ryan et al. , J. Am. Coll. Cardiol., 12: 529-45 (1988)) и их модификациями (S.G. Ellis et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17 (Suppi. B): 89B-95B (1991)). Эти клинические или ангиографические критерии повышенного риска включают либо два признака поражения типа В или один признак поражения типа C или признак поражения типа B у женщин в возрасте старше 65 лет или у пациентов с диабетом.

Ниже более подробно описываются специфические критерии включения пациентов в группу повышенного риска:

(I) Проведение избирательной или экстренной коронарной баллонной пластической операции или атеректомии с использованием одобренного ФДА устройства в одной из следующих ситуаций:

(A) Неустойчивая стенокардия и/или инфаркт миокарда, при котором на электрокардиограмме не наблюдается Q-зубец, которые определяются как:

1) остаточная стенокардия: два или более случаев остаточной стенокардии с ишемическим ST-сегментом или аномалиями T-зубца; или

2) рецидивирующая стенокардия: рецидивирующая стенокардия ишемическим ST-сегментом или аномалиями T-зубца во время госпитализации независимо от стандартного фармакологического вмешательства; или

3) ранняя послеинфарктная стенокардия; стенокардия в течение 7 дней после установленного инфаркта миокарда с остаточной стенокардией, сопровождающейся ишемическим ST-сегментом или изменениями T-зубца; или легко провоцируемая стенокардия,

где временный ишемический ST-сегмент или аномальный T-зубец определяют как:

a) 1 мм депрессия (80 миллисекунд после J-точки) или увеличение (20 миллисекунд после J-точки) ST-сегмента, и/или

b) изменения T-зубца (обычно инверсия) или по крайней мере в два раза меньшее нормы содержание креатинкиназы (СК) для всех пациентов на момент регистрации.

(B) Острый инфаркт миокарда с Q-зубцом:

1) прямое хирургическое вмешательство во время инфаркта миокарда без предшествующего применения тромболитической терапии или

2) спасительная пластическая операция на сосудах после неудачной тромболитической терапии во время инфаркта миокарда,

где регистрируемый инфаркт миокарда определяют по наличию по крайней мере двух из следующих трех критериев:

(1) продолжительная стенокардия (более 30 минут);

(2) превышение уровня содержания креатинкиназы более чем в два раза по отношению к верхнему предельному уровню (подтвержденное увеличение уровня содержания полосы изофермента креатинкиназы в миокарде);

(3) подтвержденный электрокардиограммой инфаркт, который определяется как;

a) увеличение ST-сегмента по крайней мере на 0,1 милливольт (измеряют через 0,2 секунды после J-точки) по крайней мере в одном из трех мест:

(i) по крайней мере в двух из трех нижних отведениях электрокардиограммы (II, III, aVF); или

(ii) по крайней мере в двух из шести грудных отведениях электрокардиограммы (V1-V6); или

(iii) депрессия ST-сегмента грудных отведений V1-V4, типичная для заднего тока раны (правило зеркала); или

(iv) в случае левой межжелудочковой блокады первичные ST-изменения в нижних или передних отведениях электрокардиограммы;

b) новый значительный Q-зубец продолжительностью не менее 0,04 секунд, или Q-зубец с глубиной не менее одной четверти от амплитуды соответствующего R-зубца, или оба.

(C) Клинические/морфологические признаки повышенного риска:

1) стеноз с двумя или более поражениями типа B в расширяемой артерии; признаки поражения основаны на критериях АСС/АНА;

2) стеноз с одним или более поражениями типа C в расширяемой артерии;

3) возраст более 65 лет в сочетании с женским полом и по крайней мере одним поражением типа B;

4) сахарный диабет и по крайней мере одно поражение типа B в расширяемой артерии; или

5) пластическая операция на сосудах по устранению вызванного инфарктом поражения в течение 7 дней после инфаркта миокарда, зарегистрированного по повышению содержания изофермента креатинкиназы в полосе миокарда.

II. Мужчины в возрасте от 18 до 80 лет и женщины в возрасте от 18 до 80 лет, не способные к деторождению (т.е. женщины, подвергнутые хирургической стерилизации, или женщины после климакса, которых определяют по отсутствию менструаций в течение по крайней мере одного года).

III. Письменное информированное соглашение, которое составляется перед началом проведения процедур в соответствии с выбранной методикой и назначением изучаемого средства.

Из пациентов, отвечающих приведенным критериям отбора, были затем исключены те, которые подпадают под хотя бы одно из следующих ограничений:

(1) диагноз геморрагического диатеза в истории болезни;

(2) обширное оперативное вмешательство в течение 6-недельного срока регистрации для проведения испытаний;

(3) недавнее (в течение 6-недельного срока регистрации для проведения испытаний) клинически значимое кровотечение желудочно-кишечного или мочеполового тракта;

(4) инсульт в течение 2 лет до проведения регистрации или любой другой удар, повлекший значительную остаточную нейрологическую недостаточность;

(5) более чем 50%-ная закупорка левой главной коронарной артерии;

(6) предполагаемый или занесенный в историю болезни васкулит;

(7) участие в других клинических исследованиях, в которых проводится изучение испытуемого лекарства или устройства в течение 7 дней до начала вливания изучаемого средства по настоящему изобретению;

(8) оральное назначение антикоагулянтов в течение 7 дней, предшествующих рандомизации перед началом изучения средства, если только время тромбина перед проведением рандомизации не превышает в 1,2 раза контрольного времени;

(9) назначение внутривенно декстрана до проведения пластической операции или запланированное для проведения пластической операции;

(10) занесенные в историю болезни предыдущие случаи назначения муриновых моноклональных антител или имеющиеся сведения об аллергии по отношению к муриновым белкам; и

(11) нежелание дать информированное согласие.

Во всех случаях было получено одобрение ученого совета во всех принимавших участие учреждениях, и информированное согласие было получено ото всех пациентов. Набор добровольцев для проведения исследований проводился в период с декабря 1991 года по ноябрь 1992 гола; было отобрано 2099 пациентов в 56 учреждениях США.

Методика проведения исследований

Всем пациентам вводили аспирин и гепарин. Аспирин назначали орально с дозой 325 мг по крайней мере за два часа до начала операции и назначали по 325 мг в день после проведения операции. Гепарин (свиной) назначали внутривенно в виде болюса с первоначальной дозой от 10000 до 12000 единиц, а затем дозу постепенно повышали на 3000 единиц с интервалами 15 минут, однако дозировка не превышала 20000 единиц; цель заключалась в том, чтобы поддерживать активированное время свертывания крови в "терапевтическом" диапазоне, который в общем случае составляет в процессе операции от 300 до 350 секунд (K. G. Dougherty et al., Abstracts of thе 63rd Scientific Sessions, 111-189 (1991); B. Rath et al., Br. Heart J., 63: 18-21 (1990); J.D. Ogilby et al., Cath. Cardiovasc. Diag. , 18: 206-9 (1989)). Гепарин продолжали вводить с помощью вливания в количестве 1000 единиц в час в течение по крайней мере 12 часов. В соответствии с клиническими показаниями могут внутривенно и внутриаортально вводиться нитраты. Химерное 7E3 Fab (₁, K) поставляется в виде стерильного непирогенного раствора, содержащего 2 мг моноклонального Fab на миллилитр 0,15 М раствора хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия и 0,001% полисорбата 80 с pH 7,2. Единственным назначаемым лекарственным препаратом после выписки является аспирин в количестве 325 мг в день.

Пациентов методом слепого отбора разделяют на три равные группы по принципу двойного обезличивания результатов эксперимента. Одна группа пациентов должна получать болюс c7E3 Fab с дозой 0,25 мг/кг с последующим непрерывным вливанием c7E3 Fab с дозой 10 мкг/мин. Вторая группа получает дозу болюса 0,25 мг/кг c7E3 Fab и непрерывное 12-часовое вливание раствора плацебо. Третья группа получает болюс плацебо и непрерывное 12-часовое вливание раствора плацебо. Болюс назначают по крайней мере за 10 минут до начала операции и вводят в течение 5 минут, а вливание продолжают в течение 12 часов или до тех пор, пока не возникнут клинические противопоказания.

Образцы крови для подсчета количества тромбоцитов берут через 30 минут, 2, 12 и 24 часа после начала введения лекарства, а затем ежедневно вплоть до выписки пациента из госпиталя, с целью тщательной проверки возможной тромбоцитопении. Для оценки опасного для жизни кровотечения и сокращения количества тромбоцитов используют предварительно разработанный алгоритм D.C. Sane et al. , Ann. Intern. Med., 111: 1010-22 (1989)). Методика не содержит специфичных предписаний относительно переливания красных кровяных телец; напротив, переливание крови назначают в соответствии с местной практикой, принятой в каждом отдельном учреждении. Пластические операции на сосудах проводят по стандартным методикам. Перед и после расширения просвета сосудов проводят ангиографические исследования, используя 150-300 мкг нитроглицерина в виде внутрикоронарной инъекции. После проведения операции защитные оболочки сосудистых катетеров сохраняют в течение по крайней мере шести часов после окончания вливания испытуемого средства. Кроме того, защитные катетеры сохраняют на местах по крайней мере еще четыре часа после прекращения вливания гепарина до тех пор, пока не будет достигнуто приемлемое для остановки кровотечения активированное парциальное время тромбопластина.

Прекращения эксперимента

Независимый клинический совет для рассмотрения случаев остановки эксперимента изучает все эпизоды, которые могут привести к прекращению эксперимента или серьезному осложнению. Этот совет остается анонимным для врачей, которые проводят лечение, в течение всего срока проведения эксперимента и рассматривает отчеты, электрокардиограммы, а в случае необходимости и соответствующие медицинские карты. Для принятия заключения по каждому случаю необходимо согласованное мнение двух экспертов.

Основным случаем остановки проведения дальнейших испытаний является сложный клинический случай прекращения испытаний, который включает возникновение в течение 30 дней после проведения слепого отбора одного из следующих событий:

(1) смерть по любой причине;

(2) нефатальный инфаркт миокарда; или

(3) срочное оперативное вмешательство:

(a) Вторая пластическая операция. Повторное чрескожное оперативное вмешательство для предотвращения острой рецидивирующей ишемии (баллонная пластическая операция или коронарная атеректомия). Плановые (т.е. операции, которые проводятся в несколько этапов) не рассматриваются как критерии остановки эксперимента.

(b) Обводное шунтирование коронарной артерии. Срочное (неизбирательное) хирургическое вмешательство, с целью лечения острой рецидивирующей ишемии.

(с) Размещение коронарного эндоваскулярного стента. Внутрикоронарный стент размещают для быстрого приведения расширяемого сосуда в раскрытое состояние.

(d) Размещение насоса для внутриаортальной баллонной контрпульсации. Баллонный насос помещают в случае рецидивирующей ишемии у пациентов, которые не рассматриваются как возможные кандидаты для проведения повторной пластической операции на сосудах или для проведения оперативного вмешательства.

Для целей настоящего изобретения "раскрытое состояние" определяется как состояние, для которого величина скорости потока по критерию TIMI составляет 2 или 3; стеноз, определяемый хирургом, составляет не более 50%; а электрокардиограмма не выявляет признаков ишемии.

Окончание проведения эксперимента вследствие инфаркта миокарда определяют следующим образом:

1. У пациентов, подвергнутых слепому отбору в течение 24 часов после развития инфаркта миокарда, для диагностики нефатального инфаркта требуется наличие одного из двух изоферментных критериев: (a) содержание креатинкиназы или полосы креатинкиназы в миокарде по крайней мере в 3 раза превышает верхний нормальный предел, показывающий увеличение по крайней мере на 33% по сравнению с предыдущим значением "в долине" (определяют как 25%-ное увеличение по сравнению с предыдущим пиковым значением, которое, однако, по крайней мере вдвое превосходит верхний нормальный предел); или (b) по крайней мере 100%-ное увеличение содержания креатинкиназы или полосы креатинкиназы в миокарде, которое по крайней мере в 3 раза превышает верхний нормальный уровень, с последующим 50%-ным сокращением по отношению к предыдущему пиковому значению, а значение "в долине" менее чем в два раза превышает верхний нормальный уровень. Зарегистрированный новый случай длительной стенокардии (более 20 минут), сопровождающийся повторным повышением содержания сердечных ферментов используют для установления времени начала повторного инфаркта. В случае отсутствия зарегистрированной стенокардии начало повторного инфаркта устанавливают как время измерения уровня фермента "в долине", которое непосредственно предшествует новому повышению. Определение 1 применяют лишь по отношению к тем пациентам, у которых начало рецидивирующей стенокардии и/или значение содержания фермента "в долине" наблюдается в течение 24 часов после развития инфаркта миокарда, который зафиксирован перед началом проведения испытаний. Во всех случаях, кроме тех, когда он не определен, используют уровень содержания полосы креатинкиназы в миокарде; в противном случае используют величину общего содержания креатинкиназы.

2. У пациентов, которые поступили для проведения исследований более чем через 24 часа после острого инфаркта или без недавно перенесенного инфаркта, инфаркт миокарда, возникший при госпитализации, устанавливают по одному из следующих критериев: (a) новый Q-эубец длительностью не менее 0,04 секунды или глубиной более одной четверти от амплитуды соответствующего R-эубца в двух или более смежных отведениях электрокардиограммы; или (b) уровень содержания полосы креатинкиназы в миокарде по крайней мере в 3 раза превышает верхний нормальный предел и увеличение составляет не менее 50% от предыдущего значения "в долине". Для этого определения время начала повторного инфаркта у пациентов, у которых в начале исследований зарегистрирован острый инфаркт миокарда, равно либо времени возникновения нового случая продолжительной стенокардии (более 20 минут), либо времени определения уровня содержания фермента "в долине", предшествующее новому подъему. Чтобы это определение можно было применить, любое время должно превышать 24 часа после первичного инфаркта.

3. После выписки из госпиталя для диагностики инфаркта миокарда необходимо наличие одного из следующих двух критериев: (a) новый значительный Q-зубец длительностью не менее 0,04 секунды, либо Q-зубец глубиной не менее одной четверти от амплитуды соответствующего R-зубца, либо оба в двух или более смежных отведениях электрокардиограммы; или (b) уровень содержания креатинкиназы или полосы креатинкиназы в миокарде по крайней мере в 2 раза превышает верхний нормальный предел.

Другим компонентом основного случая прекращения исследований является необходимость проведения экстренного повторного оперативного вмешательства, которое определяется как незапланированное возвращение пациента в операционную для проведения оперативного вмешательства; сюда не включаются плановые операции, проходящие в несколько этапов. Аналогично, в качестве основного случая прекращения проведения эксперимента рассматривается лишь экстренная операция на коронарных артериях, с целью лечения рецидивирующей стенокардии или исправления неудачной пластической операции. Введение внутрикоронарного стента рассматривается в качестве основной причины остановки исследований в том случае, когда стент помещают с целью лечения грозящей или реально возникшей внезапной закупорки сосуда, на котором проводят пластическую операцию. Размещение баллонного насоса рассматривается как случай, приводящий к прекращению исследований, если насос помещают вследствие рецидивирующей стенокардии у пациента, которому не предполагается проводить повторную операцию по реваскуляризации.

Случаи кровотечения классифицируются как значительные, слабые или несущественные, используя критерии группы по изучению тромбоза при инфаркте миокарда (A. К. Rao et al., J. Am. Coll. Cardiol., 11: 1-11 (1988)). Значительное кровотечение определяют как внутричерепное кровотечение или кровотечение, вызванное с уменьшением гемоглобина более чем на 5 г/дл (или, если гемоглобин недоступен, по уменьшению гематокритного числа по крайней мере на 15%). Слабое кровотечение бывает либо спонтанным, или же наблюдается в виде макроскопической гематурии или кровавой рвоты, вызванной резким уменьшением гемоглобина более чем на 3 г/дл (или, если гемоглобин недоступен, определяют по уменьшению гематокритного числа по крайней мере на 10%), а если место кровотечения не установлено, то по уменьшению содержания гемоглобина более чем на 4 г/дл (или, если гемоглобин недоступен, определяют по уменьшению гематокритного числа по крайней мере на 12%). У пациентов, которым проводят переливание крови, чтобы определить величину общего уменьшения содержания гемоглобина и установить, произошло ли значительное или слабое кровотечение, количество внесенных за счет переливания единиц добавляют к наблюдаемому уменьшению гематокритного числа, деленному на три (C.S. Landefeld et al., Am. J. Med., 82: 703-13 (1987)).

Обработка информации и статистика

Слепой отбор пациентов проводят по телефону из координационного центра обработки данных в Duke University. Отобранных по слепому методу пациентов стратифицируют в зависимости от месторасположения учреждения и в зависимости от того, возникал ли у пациента острый инфаркт миокарда. На основании ранее полученных данных планируемая квота должна была составить 2100 пациентов, с тем чтобы можно было зафиксировать 33%-ное уменьшение количества основных случаев остановки в проведении эксперимента (по оценке оно составляет 15% в группе, получающей плацебо) с показателем 0,8 и p = 0,05.

Данные собираются посредством координаторов в виде отчетов и рассматриваются перед записью информации специальными анонимными наблюдающими. Организаторы проводимых исследований не знают о коде рандомизации и о полученных результатах до тех пор, пока не будет проведен отбор всех пациентов и пока все случаи остановки эксперимента не будут рассмотрены в специальных комитетах по прекращению исследований.

Базовые характеристики приводятся в графически виде средних значений и в виде линий со значениями 25% и 75% для непрерывных переменных или в виде процентов в прилагаемых ниже таблицах для дискретных переменных. При анализе основных случаев остановки эксперимента принимается во внимание время, прошедшее до первого появления одного из любых компонентов сложного случая прекращения исследований в течение первых 30 дней после проведения отбора. Если никаких подобных случаев в 30-дневный интервал не зафиксировано, то наблюдение за пациентом продолжают по прошествии 30 дней. Для графического представления результатов используют кривые выживания Каплана-Мейера (E.L. Kaplan et al. , J. Am. Stat. Assn., 53; 457-81 (1958)). Все сравнения результатов лечения проводят по принципу цель/лечение. В случае возникновения основных случаев остановки эксперимента проводят тест регистрация/ранжирование для оценки тенденции (зависимой от дозы) и рассматривают пациентов, которым вводили только болюс как промежуточных по отношению к группе пациентов, которым вводили болюс и проводили вливание (J.D. Kalbfieichsch and R. L. Prentice, "The Statistical Analysis of Failure Time Data", John Wiley and Sons, New York (1980)). Дальнейший план проведения эксперимента предусматривает попарное сравнение по принципу регистрация/ранжирование для каждой из групп, получавшей c7E3 Fab, если важно определить тенденцию. Промежуточный анализ безопасности проведения эксперимента проводят в тот момент, когда получают данные об одной трети и приблизительно о двух третях пациентов. Номинальный установленный уровень значения альфа для оценки значимости результатов эксперимента для зависимости от дозы при каждом промежуточном анализе заранее выбирают таким образом, чтобы уровень всех ошибок типа 1 не превышал 0,05. При проведении конечного анализа уровень значимости при проведении сравнения выбирают равным 0,036. Аналогичную стратегию (тест для определения тенденции с последующим соответствующим попарным сравнением) используют и при проведении финишного анализа, с целью установления взаимосвязи между методом лечения и каждым компонентом составного случая остановки эксперимента, хотя эти сравнения в основном проводятся лишь с целью пояснения. Конечный анализ также проводят, используя указанную стратегию, с целью сравнения методов лечения с количеством вызванных кровотечениями осложнений, при этом применяют обычный тест по определению хи-площади. Рассчитывают соотношения и доверительные интервалы для основных подгрупп (возраст, пол, вес, клиническая подгруппа) и изображают их графически.

Результаты

Базовые клинические характеристики для групп пациентов показывают, что пациенты входят в группу повышенного риска с точки зрения вероятности возникновения острых осложнений при проведении пластической операции вследствие высокой доли пациентов с диабетом, недавно перенесенным инфарктом миокарда, пожилого возраста и большого количества женщин в сочетании с признаками поражения, которые соответствуют критериям отбора (см. Таблицу 11). У большинства пациентов обнаруживаются один или два больных сосуда, при этом левый желудочек функционирует нормально. Подробности проведения оперативного вмешательства приведены в Таблице 12. Никаких значительных различий в намеченных процедурах при лечении не обнаружено.

Составные основные случаи прекращения в проведении эксперимента и его компоненты приведены в Таблице 13. По сравнению с плацебо, заметно ранжированный эффект от воздействия c7E3 Fab (p = 0,009), при этом снижение вероятности возникновения составных случаев прекращения эксперимента составляет 11% (p = 0,43) для группы, которая получала только болюс, и 35% для группы, которая получала болюс и последующее вливание (p = 0,008). Те же самые ранжированные эффекты наблюдаются для всех основных случаев остановки эксперимента по причине ишемии, приведенных в Таблице 13. Таким образом, установлено, что блокада гликопротеина IIb/IIIa приводит к снижению вероятности возникновения инфаркта миокарда, экстренного проведения обводного шунтирования коронарной артерии и экстренного проведения повторной чрескожной реваскуляризации, в то время как при кратковременной блокаде, которая достигается назначением одного болюса, наблюдается лишь незначительная тенденция в том же направлении. Три случая смерти в группе пациентов, получавших болюс и вливание, наблюдаются у пациентов, которые скончались после проведения слепого отбора, однако до начала введения лекарства: несмотря на это указанные смертные случаи включены в анализ в соответствии с принципом цель/лечение.

Поскольку c7E3 Fab предотвращает возникновение нефатального инфаркта миокарда, то интерес представляет степень тяжести предотвращенных инфарктов миокарда. Как видно из Таблицы 14, предотвращаются как инфаркты с Q-зубцом, так и инфаркты, связанные с высоким уровнем содержания ферментов, при этот наблюдается зависимость от дозы.

Обширный МИ без Q-зубца определяется как инфаркт миокарда, подтвержденный наличием пикового значения полосы креатинкиназы в миокарде или общим содержанием креатинкиназы, которое более чем в 5 раз превышает верхний нормальный предел.

Необширный МИ без Q-зубца определяется как инфаркт миокарда, подтвержденный наличием пикового значения полосы креатинкиназы в миокарде или общим содержанием креатинкиназы, которое в 3-5 раз превышает верхний нормальный предел.

Определение времени нефатальных ишемических осложнений разное для каждой из трех групп для проведения экстренной повторной пластической операции, т. е. события, которое может быть точно установлено (см. фиг. 10). Большинство случаев в группе, которая получает плацебо, возникает в первые часы после проведения указанной операции, в то время как в группе, получающей болюс, наблюдается некоторый период отсрочки (приблизительно 6-12 часов), лишь по прошествии которого начинают проявляться признаки осложнения, соответствующие времени максимальной блокады рецептора. Отмечается явно выраженная отсрочка в наступлении ишемических осложнений, а также уменьшение абсолютной частоты их возникновения в группе, которая получает болюс плюс вливание.

Распределение вызванных кровотечениями осложнений в процессе госпитализации приведено в Таблице 15. Как и при изучении эффективности для основных случаев прекращения исследований, наблюдается зависимость вызванных кровотечением осложнений от степени воздействия. У пациентов, которым назначали болюс плюс вливание, наблюдается повышенное количество как основных случаев кровотечения, так и случаев переливания крови, в то время как у пациентов, которым назначали только болюс, отмечается лишь их умеренный рост. Большинство случаев кровотечения наблюдается в процессе проведения обводного шунтирования коронарной артерии или в паху в месте прокола сосуда, хотя показатель хирургического восстановления сосудов распределяется равномерно (1% в группе с плацебо и группе болюс плюс вливание и 2% в группе с одним болюсом). Аналогично, у шести пациентов наблюдается внутричерепное кровотечение, при этом два таких случая отмечены в группе с плацебо, один в группе с болюсом и 3 случая в группе пациентов, которым назначают болюс плюс вливание, при этом один из пациентов лекарство не получал, поскольку отмечаемый случай произошел уже после проведения слепого отбора, но до проведения пластической операции на сосудах).

Частота наступления повторных клинических событий низка, и основные различия в полученных результатах соответствуют назначенному типу лечения. Установленные по прошествии 30-ти дней случаи сердечной недостаточности (2,3%, 2,4%, 2,3%), длительной ишемии (3,0%, 3,6%, 4,1%), фибрилляции желудочков (3,0%, 2,6%, 3,4%) и клинические случае ишемии (21%, 17%, 18%) аналогичны для групп, получавших, соответственно, плацебо, болюс и болюс плюс плацебо.

При проведении оценки эффективности лечения в подгруппах (см. фиг. 11) в зависимости от того, зарегистрирован ли у пациентов острый инфаркт миокарда, неустойчивая стенокардия или анатомический фактор повышенного риска, благоприятное воздействие с 7E3 Fab отмечается для всех трех зарегистрированных подгрупп. Аналогично, эффективность лечения равномерна по подгруппам, выделенным по возрастному или половому признаку. Как функция от веса, эффективное положительное воздействие болюса плюс вливания с 7E3 Fab отмечается для всех пациентов, хотя лечебное воздействие более ярко выражено для пациентов с большим весом.

Риск возникновения сильных кровотечений возрастает у пациентов с меньшим весом по сравнению с пациентами с большим весом как для группы, получавшей только болюс, так и для группы, получавшей болюс плюс вливание. В наиболее легкой тертили пациентов сильные кровотечения возникали в 21% против 15% против 7% случаев, соответственно, для пациентов, которым вводили болюс+вливание, болюс и плацебо, в то время как в самой тяжелой тертили соответствующие показатели для кровотечения составляют 8%, 7% и 7%. Переливание консервированных красных кровяных телец в самой легкой тертили пациентов возникают в 24%, 20% и 11% случаев, соответственно, для пациентов, которым вводили болюс+вливание, болюс и плацебо, в то время как в самой тяжелой тертили соответствующие показатели составляют 11%, 7% и 4%.

Обсуждение результатов

Полученные результаты подтверждают важную роль, которую играют тромбоциты, по-видимому, управляемые тромбоцитами медиаторы и выполняемые тромбоцитами функции при возникновении острых ишемических осложнений у пациентов, которые подвергаются чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии. Тест по методу EPIC специально разработан для регистрации пациентов, подверженных значительному риску возникновения внезапной закупорки (повторной закупорки) кровеносного сосуда и связанных с ним осложнений. Анализ ранее накопленных результатов показывает, что некоторые пациенты могут быть отнесены в группу повышенного риска на основании клинических признаков образования тромба в сосуде, таких как острый инфаркт (R.S. Stack et al. , J. Am. Coll. Cardiol., 11: 1141-1149 (1988)), тяжелая неустойчивая стенокардия (R. K. Myler et al., Circulation, 82 (Suppl. II): II-88-II-95 (1990)) или регистрируемое ангиографически возникновение тромба (D.D. Sugrue et al., Br. Heart J., 56: 62-66 (1986); B.D. Hettleman et al., J. Am. Coll. Cardiol. , 15: 154A (1990)). Другие пациенты попадают в группу повышенного риска вследствие механических факторов, таких как маленький размер сосудов, диффузные заболевания или неблагоприятная морфология сосудов (I.N. Sinclair et al. , J. Am. Coll. Cardiol., 61: 61G-66G (1988); N.A. Ruocco et at., J. Am. Coll. Cardiol., 69: 69-76 (1992); S.G. Ellis et al., J. Am. Coll. Cardiol. , 63: 30-4 (1989)). При проведении исследований зарегистрировано значительное количество пациентов обоих типов, что позволяет пролить некоторый свет на возможное участие ингибирования тромбоцитов для каждой группы пациентов. Ожидается, что включение указанных пациентов, входящих в группу повышенного риска, приведет к возникновению ишемических осложнений у 15% пациентов, входящих в группу, которой назначают плацебо, несмотря на применение аспирина и высоких доз гепарина для каждого пациента; в результате проведенных исследований получены значения этого показателя, близкие к ожидаемым.

Назначение с 7E3 Fab приводит к снижению на 35% количества случаев тяжелых осложнений, при этом основными наблюдаемым воздействием является уменьшение случаев инфаркта миокарда, случаев проведения экстренных пластических операций на сосудах и случаев проведения экстренного обводного шунтирования коронарной артерии. Ведение болюса c7E3 приводит к отсрочке наступления указанных событий, которое соответствует продолжительности воздействия на агрегацию тромбоцитов. Однако ишемические осложнения начинают появляться через 4-6 часов. Этот интервал соответствует периоду, в течение которого, как было показано, агрегация тромбоцитов приблизительно на 50% возвращается к базовому значению после введения болюса муринового 7E3 Fab.

Помимо отсрочки комбинированное назначение болюса и вливание, которое приводит к глубокому и продолжительному подавлению агрегации тромбоцитов (см. Пример 4), приводит к предотвращению появления острых ишемических осложнений. Сложные случае остановки эксперимента позволят провести оценку влияния указанного терапевтического подхода на ишемические явления в период проведения операции.

Одним из наиболее важных открытий настоящего исследования является согласованное снижение вероятности возникновения осложнений для различных случаев прекращения испытаний. Снижение вероятности возникновения инфаркта миокарда является значительным и согласуется с аналогичным уменьшением

клинической необходимости в проведении экстренных операций. Классификация нефатального инфаркта является важным фактором при оценке результатов проведения чрескожных реконструкций коронарной артерии. Наиболее общим является определение уровня полосы фермента креатинкиназы в миокарде, превышающее верхний нормальный предел, и составляет от 4 до 21% для всех опубликованных в литературе результатов для серий пациентов (L.W. Klein et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 621-6 (1991); A.C. Hunt et al., Eur. Heart J., 12: 690-3 (1991); P. Paulettto et al., Am. J. Cardiol., 69: 999-1000 (1987); J. J. Spadaro at al., Cath. Cardiovasc. Diagn., 12: 230-4 (1986)). В тех случаях, когда увеличение содержания указанного фермента нельзя однозначно связать с конкретными клиническими явлениями, не отмечается и длительных неблагоприятных результатов. Таким образом предотвращение увеличения содержания выделенного фермента вне зависимости от клинических событий может не иметь прогностической ценности. С целью получения объективных результатов в этом тонком вопросе, при оценке события как инфаркта миокарда, систематически проводятся измерения уровня содержания фермента и снимаются электрокардиограммы, привлекают к работе анонимный экспертный совет и используют критерий по крайней мере троекратного превышения порогового значения для уровня содержания специфичных для сердца ферментов. То, что c7E3 Fab снижает полный спектр инфарктов миокарда, в том числе связанных с умеренными повышением уровня содержания ферментов, с высоким повышением уровня содержания ферментов, развитием Q-зубца, вселяет уверенность относительно важности того, какие осложнения были предотвращены, особенно потому, что одновременно снижается необходимость в проведении экстренных операций по реваскуляризации коронарных артерий.

Хотя не ожидалось обнаружить и не обнаружено влияния на показатель смертности, следует отметить 3 смертных случая у пациентов, входящих в группу, где назначают болюс плюс вливания, хотя лекарство указанным трем пациентам никогда не вводили. Эти смертные случаи включены в анализ случаев остановки эксперимента в соответствии с принципом цель/лечение. Все остальные умершие пациенты действительно получали предписанную им терапию. Что касается смертности при проведении пластических операций на сосудах, то для того, чтобы увидеть 25%-ный положительное или отрицательное воздействие метода лечения, требует провести наблюдения более чем 20000 пациентов.

Благотворное воздействие блокады рецепторов гликопротеина IIb/IIIa на вероятность возникновения случаев остановки эксперимента при проведении пластических операций у пациентов, входящих в группу повышенного риска, вполне убедительно и согласуется с положительными результатами последнего наблюдения при использовании того же самого антитела у пациентов, которым проводят пластические операции на сосудах в состоянии резистентной неустойчивой ишемии (M.L. Simoons et al., J. Am. Coll. Cardiol., 21: 269A (1993)).

Поскольку в настоящем исследовании впервые предпринято масштабное изучение блокады рецептора IIb/IIIa, то существовала вероятность развития тромбоцитопении. Однако для с 7E3 Fab отмечается лишь небольшое важное с клинической точки зрения уменьшение содержания тромбоцитов. В частности, анализ показывает, что тромбоцитопения (количество тромбоцитов < 100000/мкл) наблюдается у большего количества пациентов (5,2%) в группе, которой назначали и болюс, и вливание, чем в группах в одним болюсом (3,6%) или плацебо (3,4%). Таким образом, отмечается вероятность развития тромбоцитопении (количество тромбоцитов < 100000/мкл) для группы, получавшей болюс и вливание, по сравнению с группами, получавшими плацебо (для данной пары p = 0,062). Тяжелая тромбоцитопения (количество тромбоцитов < 50000/мкл) развивается у 11 (1,6%) пациентов в группе с лечением болюсом и вливанием и у 5 (0,7%) пациентов в группе с лечением с помощью плацебо. Лишь для 4 пациентов (< 1%) в каждой из этих групп отмечена тяжелая тромбоцитопения и смертельно опасные или фатальные осложнения. Все случаи уменьшения содержания тромбоцитов были временными и сохранялись обычно в течение первых нескольких дней.

У подвергавшихся лечению пациентов наблюдается значительное увеличение количества осложнений, связанных с кровотечениями и переливанием крови. Это увеличение происходит в основном как результат кровотечения в местах проведения бедренной пунктуры и не приводит к значительной разнице в минимальном значении гематокритного числа или количеству опасных для жизни осложнений во всех трех группах. Тенденции сохраняются независимо от того, включают ли в анализ пациентов, подвергавшихся хирургическому вмешательству. При проведении анонимного исследования неуверенность в том, какой тип лечения проводится, может привести в различных учреждениях к более низкому порогу назначения переливания, которое проводят с целью остановки кровотечения. Проведенные нами ранее исследования показали, что улучшенная методика по устранению кровотечения и назначения переливания крови у пациентов, которым проводят тромболитической терапию, может привести к эффективному снижению необходимости назначения продуктов крови (T.C. Wall et al., J. Am. Coll. Cardiol., 21: 597-603 (1993)).

Взаимосвязь между благоприятными последствия лечения и риском возникновения кровотечений как функция веса пациента оказалась более сложной, чем ожидалось. Хотя частота возникновения основных случаев остановки эксперимента и риск возникновения сильного кровотечения не сильно меняется по сравнению с весом пациентов в группе, получавшей плацебо, отмечается явно выраженная тенденция с уменьшением веса к увеличению количества основных случаев прекращения эксперимента и увеличению доли сильных кровотечений в обеих группах, которым назначали c7E3 Fab.

Заключение о клинической пригодности указанного подхода к блокированию рецептора гликопротеина IIb/IIIa у пациентов до проведения, в процессе проведения и после проведения операции чрескожной реваскуляризации зависит от относительной важности предотвращения ишемических осложнений в сравнении с необходимостью назначать продукты крови. Для пациентов, входящих в группу повышенного риска, которые были зарегистрированы для проведения настоящего испытания, этот баланс в пользу назначения антитела. Прогностические аспекты острого инфаркта миокарда или необходимости проведения экстренной повторной реваскуляризации являются весьма серьезными, а риск переливания крови, к счастью, продолжает снижаться (J.G. Donahue et al., N. Engl. J. Med., 327: 369-73 (1992); R.Y. Dodd, N. Engl. J. Med., 327: 419-21 (1992); K.E. Nelson et al., Ann. Intern. Med., 117: 554-9 (1992)). Попытки разработать практические алгоритмы к снижению ненужного кровотечения и переливания крови и к более эффективной дозировке при проведении антитромботической терапии, в том числе воздействия антитромбина и антитромбоцитарные воздействия, должны привести к дальнейшему усиления положительных клинических факторов, которые наблюдаются в настоящем исследовании. На практике парентеральное назначение средства, потенциально обладающего антитромбоцитарным действием, пациентам, которым проводят операцию с использованием технических средств, должно сфокусироваться на дозировке применяемой антитромботической терапии (в частности, дозы гепарина не были согласованы с весом пациентов) в зависимости от веса пациента. Использование более точных методов оценки и методик, которые приводят к уменьшению кровотечения, и их распространение во всех центрах, которые принимают участие в настоящем исследовании, может способствовать получению большей информации о возникновении связанных с кровотечением осложнений.

Высокая степень согласованности полученных при лечении эффектов во всех группах пациентов является сильным доводом в пользу того, что образование тромба играет более важную роль для многих пациентов, хотя в некоторых случаях внезапная закупорка может в одних случаях вызваться в основном тромботическими явлениями, а в других случаях механическими явлениями. Отсрочка в наступлении осложнений, которой способствует терапия с использованием болюса и предотвращение этих осложнений при назначении болюса и вливания, свидетельствует о том, что во многих случаях поверхность разорванной артерии потеряла большую часть своей тромбогенности по прошествии 18-24 часов после проведения операции. Терапевтические подходы должны учитывать необходимость поддержания длительного антитромботического воздействия у пациентов, подверженных значительному риску внезапной закупорки сосудов.

Подводя итог, следует отметить, что проведенное исследование демонстрирует благоприятное воздействие, которое оказывает длительная блокада рецептора гликопротеина IIb/IIIa у пациентов, входящих в группу повышенного риска и подвергаемых операциям чрескожной реваскуляризации, понижая и/или предотвращая повторную закупорку или внезапную закупорку сосуда. Хотя это благоприятное воздействие достигается за счет возрастания риска возникновения кровотечения, значимость полученных положительных клинических результатов благоприятствует этому подходу при лечении пациентов, для которых известно, что они входят в группу повышенного риска возникновения серьезных ишемических осложнений, что определяют на основании клинических и ангиографических критериев перед проведением операции. Настоящее исследование представляет собой первую оценку значимого терапевтического подхода к подавлению функций интегративных белков клеточной мембраны, прокладывая дорогу биотехнологии для разработки в будущем других целей для селектина и интегрина, а также подходам к тому же самому гликопротеину IIb/IIIa, в которых не используют антитела или же используют пептиды.

Пример 7

Сокращение случаев клинического рестеноза при проведении оперативного вмешательства с помощью раннего назначения фрагмента химерного антитела анти-GPIIb/IIIa

Процесс повторного сужения просвета после проведения баллонной пластической операции на сосудах и чрескожного оперативного вмешательства при проведении операций на коронарных сосудах - явление весьма распространенное и более чем в 25% случаев приводит к рецидиву симптомов стенокардии и необходимости проведения в течение 6 месяцев повторной операции реваскуляризации, на что в США затрачивается более 2 миллиардов долларов ежегодно (J.J. Popma et al. , Circulation, 84: 1426-1436 (1991); E.J. Topol et al., Circulation, 87: 1489-1497 (1993); J.- P.R. Herrman et al., Drugs, 46: 249-262 (1993)). Основным механизмом, который приводит в действие рестеноз, является травма сосуда под действием баллона или другого альтернативного приспособления в месте проведения оперативного вмешательства, сопровождаемая формированием образований тромбоцит-тромб и изменением фенотипа клеток средних гладких мышц от их состояния покоя или контрактильного состояния в такое, при котором они приобретают способность перемещаться, разрастаться и секретировать (J.S. Forrester et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758-769 (1991); J.H. Ip, J. Am. Coll. Cardiol. , 17: 77B-88B (1991); W. Casscells, Circulation, 86: 723-729 (1993)). Хотя в экспериментальных моделях при модулировании характеристик роста миоинтимы, которая наблюдается после травмы сосуда, были успешно опробованы различные фармакологические средства и немногочисленные ангиографические исследования подтверждают их благотворное действие, до сих пор не проводилось масштабных клинических испытаний на пациентах, которое бы показало эффективность этих средств и до настоящего времени не известны методы фармакологического лечения, которые бы приводили к уменьшению вероятности развития рестеноза (J. J. Popma et al., Circulation, 84: 1426-1436 (1991); J.-P.R. Herrman et al., Drugs, 46: 249-262 (1993); Mercator Stude Group, Circulation, 86: 100-110 (1992)).

Пластические операции на коронарных сосудах обычно сопровождаются введением в качестве вспомогательных средства аспирина орально и гепарина внутривенно. Однако этот антитромботический подход является слабым и слабо препятствует агрегации тромбоцитов. Различные агонисты, в том числе тромбин, коллаген и аденозиндифосфат, способны стимулировать тромбоциты даже несмотря на терапию с использованием аспирина. Методами молекулярной биологии при изучении тромбоцитов установлено, что гликопротеин IIb/IIIa, который является интегративным белком клеточной мембраны, отвечает в качестве рецептора за процесс агрегации тромбоцитов (E. F.Plow et al., Prog. Hemostas. Thromb., 296: 320-331 (198); B.S.Coller, J. Clin. Invest., 76: 101-108 (1985)). Фрагмент химерного антитела 7E3 Fab селективно связывается с интегрином IIb/IIIa тромбоцитов. После того как предварительные исследования подтвердили первичные данные о безопасности и эффективности фрагмента химерного моноклонального Fab антитела, во многих центрах были проведены дважды обезличенные исследования с участием 2099 пациентов (см. Пример 6). Помимо первичной эффективности, основным результатом является снижение вероятности развития острой фазы серьезных ишемических осложнений, в частности, подавление внезапной закупорки сосудов (см. Пример 6), было установлено, что 7E3 способен уменьшать вероятность возникновения клинического рестеноза, что определяется ишемическими осложнениями или необходимостью проведения повторных операций реваскуляризации в течение 6 месяцев медицинского наблюдения.

Методы

Детали отбора кандидатов и методики приводятся в Примере 6. Если кратко, то регистрируют пациентов, которым должна проводиться пластическая операция на коронарных сосудах или прямая атеректомия и у которых развивается инфаркт миокарда или которые недавно перенесли инфаркт миокарда, страдают от неустойчивой стенокардии или подвержены ангиографическим поражениям в соответствии с критериями Американской кардиологической ассоциации/Американского колледжа кардиологии (АСС/АНА Task Force Report, J. Am. Coll. Cardiol., 12; 529-545 (1988)). В качестве критериев, по которым пациенты отклонялись от участия в эксперименте, были гемморагический диатез, возраст более 80 лет, инсульт в течение 2 лет или обширное хирургическое вмешательство в течение 6 недель. Методики были одобрены учеными советами всех принимавших участие центров, и информированные соглашения были получены для всех пациентов.

Пациентам орально назначали аспирин (325 мг в день), при этом первую дозу назначают по крайней мере за два часа до проведения операции. В процессе операции внутривенно вводят гепарин, с тем чтобы время активированного свертывания крови составляло по крайней мере 300 секунд. Помимо назначения аспирина и гепарина пациентов методом слепого отбора определяют в одну из трех группы с альтернативными режимами лечения: (1) болюс плацебо и вливание плацебо в течение 12 часов; (2) активное c7E3 (от компании "Centocor", Малверн, штат Пенсильвания) в виде болюса с дозой 0,25 мг/кг и вливание плацебо в течение 12 часов; или (3) активное c7E3 в виде болюса с той же дозой и немедленное вливание c7E3 с дозой 10 мкг/мин в течение 12 часов. Болюс назначают по крайней мере за 10 минут до начала проведения операции на коронарных сосудах.

Основные критерия остановки эксперимента является составными и включают появление в течение 30 дней следующих событий: смерть независимо от причины, инфаркт миокарда, обводное шунтирование коронарной артерии при острой ишемии, повторное чрескожное оперативное вмешательство при острой ишемии, необходимость в размещении эндолюминального стента или введения внутриаортально баллонного насоса для лечения ишемии. Все эти случаи разбираются независимым экспертным советом по расследованию случаев прекращения эксперимента, который остается анонимным для проводящих лечение врачей в течение всего времени исследования и требует наличия согласованного решения по крайней мере двух экспертов.

В течение 6 месяцев, в течение которых проводится наблюдение, принцип двойной анонимности сохраняется. Помимо соответствующих ишемических осложнений, таких как смерть или инфаркт миокарда, за пациентами ведется наблюдение с целью определить необходимость проведения повторной реваскуляризации, заключающейся в проведении чрескожной реконструкции коронарной артерии или обводном шунтировании коронарной артерии или обоих типов операции. В отличие от острых случаев прекращения испытаний, размещение стента или внутриаортального баллонного насоса не рассматривается в качестве итога, поскольку основное внимание в случае внезапной ишемии обращено на проведение операции реваскуляризации, а не на ее суррогат. Критерием для диагностики инфаркта миокарда после выписки из госпиталя является либо новое появления на электрокардиограмме значительного Q-зубца длительностью не менее 0,04 секунд или имеющего глубину, составляющую не менее одной четверти от амплитуды соответствующего R-зубца в двух или более смежных отведениях электрокардиограммы; или повышение содержания креатинкиназы или полосы креатинкиназы в миокарде, которое более чем вдвое превышает верхний нормальный предел. Данные по повторной реваскуляризации собирают в месте с информацией о том, подвергался ли повторной чрескожной реваскуляризации первоначально оперируемый сосуд. Врачебное наблюдение завершено на 97,2%.

Чтобы отделить данные шестимесячных наблюдений от случаев возникновения острых фаз, анализ включает все события, прошедшие от базового уровня до состояния через 6 месяцев, события, произошедшие после последовавшей в течение 30 дней остановки эксперимента у пациентов с первоначально успешно проведенным оперативным вмешательством (определяют по величине конечного сужения сосуда, составляющего в соответствии в отчетом клинического эксперта, менее 50%, при отсутствии ишемических осложнений), и событий, произошедших в течение 48 час у пациентов с первоначально успешно проведенным оперативным вмешательством. Случае остановки эксперимента в течение 30 дней затем отбирают, поскольку они наблюдаются во многих случаях проведения оперативного вмешательства на коронарных сосудах. 48-часовой предел установлен по той причине, что, как известно, практически все случаи внезапного закупоривания, которые возникают после проведения оперативного вмешательства на коронарных сосудах, попадают в этот временной интервал (K.M. Detre et al., J. Am. Coll. Cardiol. , 13: 230A (1989); A.M. Lincoff et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19: 926-938 (1992); P.J. de Feyter et al., Circulation, 83: 927-936 (1991)).

Слепой отбор проводят по телефону в Координационном центре Duke University и стратифицируют по месту расположения центра и в зависимости от того, наблюдается ли у пациента острый инфаркт миокарда. Данные в виде отдельных отчетов о проведении 6-месячных наблюдений собираются координаторами, и их качество перед обработкой данных оценивается и документально подтверждается анонимными экспертами. Заказчик не знает о результатах испытаний до тех пор, пока не будут получены сведения обо всех пациентах, события рассмотрены комитетом по прекращению исследований и сбор данных закончен.

Статистический анализ

Все сравнения методов лечения проводятся по принципу цель/лечение. Вероятности появления событий оценивают пo методу Каплана-Мейера (E.L. Kaplan and P. Meier, J. Am. Stat. Assn., 53: 457-481 (1958)), и кривые выживаемости используют для графического представления результатов испытаний. Тест для зависимости от дозы для вероятности появления событий от плацебо до болюса и далее до болюса плюс вливание (со значениями 0, 1 и 2, соответственно) проводят с использованием обобщенной статистики оценка/ранжирование. Парные сравнения между плацебо и одним из вариантов назначения c7E3 также проводят с использованием статистики оценка/ранжирование. Модели пропорциональных вредных факторов (C_ox) подбирали так, чтобы они удовлетворяли возможным взаимосвязям между базовыми характеристиками и результатами. Такой анализ проводят для всех испытуемых групп, объединяя их с моделируемыми различиями в проведении лечения, и отдельно для лечебной группы, с целью выявления различий между отдельными направлениями лечения. Далее, регрессионные модели пропорциональных вредных факторов (C_ox) должны удовлетворять всем составным случаям окончания проведения исследований после 48 часов наблюдения, с целью изучения факторов, которые могут быть связаны с последующими событиями или влиянием метода лечения. Факторами, которые включаются в этот анализ, являются лечение, реваскуляризация одного или нескольких поражений, продолжительность операции, инфаркт миокарда или неустойчивая стенокардия вблизи базового значения или другие критерии факторов повышенного риска, пол, возраст > 65 лет или < 65 лет, вес и сахарный диабет.

Результаты

Регистрация начата 1 декабря 1991 года и закончена 18 ноября 1992 года, при этом участие приняло 2099 пациентов. Особенности изучения всех пациентов приведены выше (см. Пример 6, Таблица 10). Базовые характеристики пациентов, для которых первоначально проведены успешные пластические операции или атеректомия, а потому могут быть зарегистрированы для проведения последующих клинических исследований рестеноза, приведены в Таблице 16. Существенных отличий между пациентами, подвергавшихся разным вариантам лечения и для которых первоначально проведены успешные операции, не наблюдается.

У пациентов, получающих болюс с7E3 или болюс вместе с вливанием, отмечается значительный рост осложнений, связанных с кровотечением, главным образом в первые 48 час, и приблизительно в два раза большее количество переливаний крови (плацебо - 7%, один болюс - 13%, болюс и вливание - 15%, p < 0,01). 12-часовое вливание не закончено для 48 пациентов (7,0%), получавших плацебо, для 85 пациентов (12,5%), которым назначен один болюс, и для 107 пациентов (15,8%) из группы, получавшей болюс и вливание.

При использовании c7E3 не наблюдается значительного возрастания тромбоцитопении и не отмечено появление гиперчувствительности или аллергических реакций. Положительные ответные реакции антихимерного антитела человека возникают у 5,2% пациентов, которым назначен болюс и у 6,5% пациентов, которым назначают болюс и вливание. Большинство пациентов с положительными ответными реакциями антихимерного антитела человека имеют низкий титр. Все 32 пациента, у которых отмечается положительная ответная реакция антихимерного антитела человека в группе, которой назначали болюс, имеет титр не более 1: 1600. Тридцать четыре из сорока пациентов из группы, получавшей болюс и вливание, у которых отмечена положительная ответная реакция антихимерного антитела человека, имеют титр не более 1:1600. У шести пациентов из группы, получавшей болюс и вливание, и у одного пациента из группы, получавшей болюс, значения титров положительной ответной реакции антихимерного антитела человека лежат в интервале от 1:6400 до 1:51200.

По прошествии 30 дней наблюдается 35%-ное снижение основных ишемических осложнений (смерть, инфаркт миокарда, экстренная реваскуляризация) для пациентов, получавших c7E3 болюс и вливание (8,3%) по сравнению с теми пациентами, которые подвергались действию плацебо (12,8%, p= 0,009) (см. Пример 6, Таблица 13). Данные по прошествии 6 месяцев приведены в Таблице 17, в которой указаны случаи смерти, инфаркта миокарда и необходимость обводного шунтирования коронарной артерии или повторного проведения пластической операции на коронарном сосуде с целью реваскуляризации подвергавшегося операции сосуда (a) для всех зарегистрированных пациентов, (b) пациентов, которым операция проведена успешно, и (c) для тех пациентов, у которых операция вначале прошла успешно и не наблюдалось осложнений в течение первых 30 дней. Через 6 месяцев наблюдается 23%-ное снижение количества ишемических осложнений и реваскуляризации (27% против 35%, p = 0,0001; см. Таблицу 17 - Все зарегистрированные пациенты, Составной исход: Смерть, Инфаркт миокарда, Обводное шунтирование коронарной артерии, Чрескожная чресполостная реконструкция коронарной артерии). Долговременный положительный эффект достигается главным образом за счет меньшей необходимости проведения шунтирований или повторных операций, поскольку количество реваскуляризации подвергавшихся операции сосудов снизилось на 26% для назначения c7E3 в виде болюса и вливания (16,4%) против обработки с использованием плацебо (22,3%; p = 0,007; см. Таблицу 17). Группа, получавшая только болюс, показывает промежуточный результат, который в соответствии с применяемыми в настоящем исследовании критериями немногим лучше, чем результат для плацебо.

Отдельно проводят анализ данных, полученных по прошествии 6 месяцев для всех пациентов, у которых не зафиксированы случаи прекращения исследований в течение первых 30 дней. Эти результаты приведены в Таблице 18. Полученные данные указывают на 21%-ное снижение необходимости в проведении повторных операций по реваскуляризации за счет назначения c7E3 болюса и вливания во время протекания острой стадии.

Данные для всех случаев осложнений (смерть, нефатальный инфаркт миокарда или необходимость коронарной реваскуляризации) для всех пациентов, которые принимали участие в эксперименте, приведены также на фиг. 12. Данные для пациентов, которые перенесли успешную операцию и не имели осложнений в течение 30 дней, показаны также на фиг. 13.

Среди пациентов с острым осложнением, повлекшим прекращение эксперимента, 81% таких случаев произошел в течение 48 часов. Картина аналогична для всех трех испытуемых групп (82,0% плацебо, 79,7% болюс, 81,4% болюс и вливание). Проводя анализ случаев осложнений через 48 часов у пациентов с первоначально успешно проведенной операцией, идентифицируют сосуд, который подвергался повторной реваскуляризации в течение первых 30 дней. Как показывает фиг. 14, существует незначительная разница между субострыми ишемическими осложнениями между группами с болюсом c7E3 и группой с болюсом и вливанием после прекращения наблюдения через 30 дней.

Вместо составного исхода (смерть, инфаркт миокарда и реваскуляризация) и любой реваскуляризации, включая и сосуды, которые ранее не подвергались воздействию, полезно заострить внимание на реваскуляризации только сосудов-мишеней, ранее подвергнутых операции. Для всех пациентов в течение 6 месяцев наблюдается значительное снижение, составляющее 26%, реваскуляризации сосудов-мишеней в группе, получавшей болюс и вливание, по сравнению в другими испытуемыми группами (см. фиг. 15). Следует отметить, что назначение одного болюса при прочих равных условиях оказывает незначительное воздействие на реваскуляризацию сосудов-мишеней.

Анализ в подгруппах сравнивает пациентов, у которых в базовых условиях установлено острое заболевание коронарных сосудов (неустойчивая стенокардия, недавний или острый инфаркт миокарда), с остальными пациентами, у которых наблюдается стойкая стенокардия и определяемые ангиографически морфологические осложнения (Таблица 19). Это сравнение вскрывает значительное воздействие на снижение составных исходов для обеих подгрупп, однако уменьшение необходимости проведения повторного коронарного вмешательства существенно лишь для пациентов со стойкой стенокардией (Таблица 19). Это наблюдение согласуется, независимо от того, сравниваются ли результаты с базовыми значениями или по прошествии 48 часов, для пациентов с успешно проведенными операциями.

Обсуждение результатов

Настоящие результаты на основании широкомасштабного рандомизованного исследования, проведенного в разных центрах, свидетельствуют о сокращении количества клинических событий и меньшем количестве рестеноза для пациентов, подвергавшихся операциям на коронарных артериях, которым путем назначения болюса и вливания проводилась блокада интегрина IIb/IIIa тромбоцитов. Степень благоприятного исхода по прошествии 6 месяцев выражается в общем снижении, составляющем 23%, ишемических осложнений, в том числе смерти, нефатального инфаркта миокарда и необходимости проведения реваскуляризации, и в снижении на 26% повторной реваскуляризации сосуда-мишени. Эти результаты расширяют границы благотворного воздействия болюса c7E3 и вливания в течение 12 часов от снижения вероятности внезапной закупорки сосуда и возникновения острых осложнений до снижения необходимости проведения последующих повторных операций на коронарных сосудах.

Фрагмент моноклонального Fab, который используют в настоящем исследовании, обладает потенциальной способностью связывать поверхностный интегрин IIb/IIIa тромбоцитов с минимальной константой диссоциации. Предыдущие исследования пациентов, которым проводят пластические операции с использованием c7E3, показали, что после окончания вливания антитела места связывания IIb/IIIa остаются занятыми по крайней мере еще в течение 36-48 часов, а признаки, свидетельствующие о подавлении агрегации тромбоцитов - по крайней мере в течение 72 часов (см. Пример 4; см. также S.G. Ellis et al., Cor. Art. Dis., 4: 1675-175 (1993); J.E. Tcheng et al., Circulation, 88: (1993). Хотя оба этих воздействия ослабевают и возвращаются в исходное состояние, продолжительное действие c7E3 на агрегацию тромбоцитов представляется интересным ввиду того, что болюс плюс вливание плацебо не оказывает клинически значимого воздействия на острые случаи осложнений или результаты по прошествии 6 месяцев в соответствии с принятыми в настоящем исследовании критериями и условиями его проведения. Это наблюдение заставляет предположить, что снижение вероятности возникновения острых ишемических осложнений или клинического рестеноза путем назначения антитела анти-GPIIb/IIIa может потребовать более длительного воздействия средства (в частности, достигаемого назначением болюса и вливания лекарства) и что более длительное подавление интегрина GPIIb/IIIa может сопровождаться дальнейшим улучшением результатов.

Следует также отметить, что, по сообщениям, с7E3 способен также связывать рецептор витронектина (R.O. Hynes., Cell, 69: 11-25 (1992)), вероятно, потому, что этот рецептор содержит компонент GPIIb/IIIa. Указанный интегрин (витронектин) может играть роль при модулировании стеноза или рестеноза, так что связывание анти-GPIIb/IIIa с рецептором витронектина может способствовать наблюдаемому эффекту. Другие ингибиторы рецептора GPIIb/IIIa обладают разной степенью специфичности по отношению к мишени и гомологичным интегринам (J. Sutton et al., Clinical Research AFCR, 41: 118A (1993)). Для выяснения клинических последствий от взаимодействия указанных молекул следует провести сравнительные исследования.

В настоящем исследовании систематическое шестимесячное повторное ангиографическое исследование, с целью количественного определения степени сужения испытуемых групп, не проводилось. Тем не менее повторная ангиография проводилась во многих исследованиях, посвященных стенозу (J.S. Forrester et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758-769 (1991); J.H. Ip et al., J. Am. Coll. Cardiol. , 17: 77B-8B (1991); W. Casscells, Circulation, 86: 723-729 (1993); E. J. Topol et al., N. Engl. J. Med., 329: 228-233 (1993); A.G. Adelman et al. , N. Engl. J. Med., 329: 228-233 (1993); P.W. Serruys et al., Circulation, 84: 1568-1580 (1991)), оно имеет важный недостаток, поскольку диагноз сосуда-мишени, подверженного стенозу, у бессимптомных больных часто приводит к повторным процедурам, которые на практике не должны возникать. Напротив, в настоящем исследовании предлагается моделирование клинической практики, проведенное на большом количестве пациентов. Итоговой целью изучения рестеноза является демонстрация значительного снижения в необходимости проведения повторных операций по реваскуляризации, поскольку польза от ангиографии как таковой, которая отмечается в ряде нескольких исследований рестеноза, не всегда однозначно соответствует клиническим результатам. Далее, поскольку смерть и инфаркт миокарда не являются обычным явлением после проведения чрескожных реконструкций коронарных артерий, то основной результат, который можно модулировать, применяя эффективное фармакологическое вмешательство, - это повторная реваскуляризация сосуда, что мы и наблюдаем в данном исследовании. Поскольку пациенты при проведении исследований подвергались похожему воздействию, за исключением того, что назначали болюс и вливание, при этом проводилось строгое сохранение анонимности до полного завершения эксперимента, то можно сделать вывод, что уменьшение вероятности сокращения просвета сосуда объясняет наблюдаемый клинически значимый результат.

Настоящее исследование представляет собой первое широкомасштабное рандомизованное исследование с цель показать клинически значимое сокращение необходимости проведения последующих операций по реваскуляризации, которое можно интерпретировать как меньший клинический стеноз. Это достигается путем блокады IIb/IIIa с помощью болюса и вливания и указывает на истинную пассивацию пораженной стенки сосуда. Даже в том случае, когда вливание с7E3 проводят в течение всего 12 часов, агент оказывает продолженное антитромбоцитарное воздействие в течение нескольких дней, при этом не отмечается случаев острой ишемии. Важно отметить, что независимое благотворное воздействие на реваскуляризацию сосуда-мишени по прошествии 6 месяцев свидетельствует об остаточном воздействии острого фармакологического вмешательства с использованием с7E3 и может служит клиническим доказательством пассивации стенки кровеносного сосуда.

Обнаружение меньшей вероятности возникновения повторного стеноза при использовании блокады IIb/IIIa тромбоцитов подчеркивает роль, которую играет связка тромбоцит-тромб при возникновении рестеноза, который рассматривается как потенциально основной фактор развития послеоперационного или эндотелиального поражения неоинтимы (R.S. Schwartz et al., J. Am. Coil. Cardiol., 20: 1284-1293 (1992); E.J. Topol, Mayo Clin. Proc., 68; 88-90 (1993); J.T. Willerson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10624-10628 (1991)). Хотя разрастание клеток средних гладких мышц может играть значительную роль в развитии рестеноза (J.S. Forrester et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758-769 (1991); J. H. lp et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 77B-8B (1991); W. Casscells, Circulation, 86: 723-729 (1993)), полученные нами результаты показывают, что потенциальные антитромбоцитарные и антитромботические подходы к этому важному клиническому феномену могут быть особенно плодотворными. Следует отметить, что, как показано в настоящем исследовании, использование аспирина в процессе проведения операций на коронарных сосудах (L. Schwartz et al. , N. Engl. J. Med., 318: 1714-1719 (1988) в качестве единственного антитромбоцитарного средства не является достаточным для подавления ответа тромбоцитов на травму сосуда.

Пример 8

Дополнительные открытия после проведения рандомизованного дважды анонимного исследования с использованием плацебо

Размер чехла катетера и связанные с кровотечением осложнения

Связанные с кровотечением осложнения оценивают по критерию EPIC (см. Примеры 6 и 7), с целью определить, коррелирует ли размер чехла в процессе PTCA/DCA с вызванными кровотечением осложнениями. Размер чехла и направляющего катетера определяют клинически. Исследуют далее случаи сильного кровотечения, кровотечения в паховой области, переливания крови, восстановления сосудов, самые низкие значения гематокритного числа.

Можно прогнозировать, что размер чехла вызывает кровотечение в паховой области даже при использовании известных прогностических факторов, в том числе способа проведения лечения и использования гепарина в процессе катетеризации (p = 0,0004). Тенденция к проведению большего количества операций по восстановлению сосудов при использовании чехла с большими размерами не является значимой (p = 0,0004). Сильные кровотечения (10,5%), переливание крови (11,8%) и самые низкие значения гематокритного числа (34) не изменятся с изменением размеров чехла. У пациентов, которые получали с7E3 Fab, количество кровотечений в паховой области превышает аналогичный показатель для пациентов, которым c7E3 не назначался (55% против 30%, p < 0,0001) (см. табл. A).

Приведенные результаты показывают, что большие размеры чехла вызывают повышенное кровотечение в паховой области, однако не приводят к осложнениям при проведении PTCA/DCA. Добавление c7E3 Fab связано с повышенным кровотечением в паховой области, однако его можно свести к минимуму, используя чехлы и катетеры меньших размеров.

Совпадение случаев ишемии и кровотечения после ингибирования рецептора GPIIb/IIIa при проведении операции на коронарной артерии

Тест EPIC (оценка влияния c7E3 на предотвращение ишемических осложнений) (см. Примеры 6 и 7) показывает, что терапия с использованием c7E3 Fab, потенциального антагониста рецепторов GPIIb/IIIa тромбоцитов, предотвращает ишемические осложнения при проведения пластических операций (чрескожных чресполостных реконструкций коронарной артерии) в группе повышенного риска, однако при этом количество случаев кровотечения, которые требуют применения переливания крови, возрастает с 7% для группы, получавшей плацебо, до 14% в группе, получавшей c7E3 Fab. С целью дальнейшего изучения этого явления проводят сравнение между индексами кровотечения (наименьшее значение гематокритного числа, показатель кровотечения, изменения гематокритного числа, количество единиц красных кровяных телец при переливании консервированной крови) и основными случаями остановки в проведении эксперимента (смерть, инфаркт миокарда, обводное шунтирование коронарной артерии или чрескожная чресполостная реконструкция коронарной артерии, с целью устранения острой ишемии, или размещение коронарного стента в случае неудачной операции). Отмечается сильная взаимосвязь между кровотечением и основными случаями остановки в проведении эксперимента (p = 0,0001 для всех индексов кровотечения). Эта взаимосвязь прослеживается для всех типов терапии: плацебо, болюс c7E3 Fab и болюс плюс вливание c7E3 Fab. Так, пациенты со значительным кровотечением с большей вероятностью подвержены ишемическим осложнениям. Эта сильная взаимосвязь может быть связана с тем, что случае остановки в проведении эксперимента (в частности, чрескожная чресполостная реконструкция коронарной артерии) связаны с повышенным кровотечением. Иначе, кровотечение, вызванное гипотонией, может вносить важный вклад в ишемические осложнения после проведения операции. В подтверждение этого пациенты, у которых развивается гипотония (за исключением гипотонии, которая развивается после наступления события, повлекшего остановку в проведении эксперимента), после успешно проведенной чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии с большей вероятностью испытывают осложнения, а также более подвержены риску появления кровотечения и возникновения случая, который влечет за собой остановку в проведении эксперимента (см. табл. B).

Таким образом, кровотечение вероятно приводит к ишемическим осложнениям у некоторых пациентов, и меры по дальнейшему снижению кровотечения (например, модификации дозы гепарина) могут еще более усилить антиишемическую эффективность ингибирования GPIIb/IIIa при проведении операций на коронарных сосудах).

Экономические преимущества и недостатки ингибирования агрессивных тромбоцитов при проведении пластических операций в группе повышенного риска

Для 2100 пациентов при проведении рандомизованного теста EPIC (см. Примеры 6 и 7) ингибирование агрессивных тромбоцитов большими дозами c7E3 Fab приводит к уменьшению на 35% последующих случаев смерти, повторного инфаркта и рецидивирующей ишемии во время проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии в группе повышенного риска, однако при этом вдвое возрастает вероятность появления сильного кровотечения. С целью оценки экономических последствий использования указанной комбинации клинических эффектов проводят экономический анализ. В течение шести месяцев после регистрации собирают данные по затратам на госпитализацию и стоимости исходных материалов для каждого участника эксперимента. Средние базовые затраты на госпитализацию в случае отсутствия осложнений составляют 9300 долларов США. Влияние основных осложнений на базовую величину расходов на госпитализацию оценивают с помощью линейной регрессионной модели со многими переменными:

Средние расходы на госпитализацию = $9065 + $5923 экстренная РТСА + $28219экстренное CABG + $3645повторный инфаркт + $3462сильное кровотечение

Эта модель показывает, что, уменьшая долю экстренной чрескожной чресполостной реконструкция коронарной артерии от 4,5% до 0,8%, долю экстренного обводного шунтирования коронарной артерии с 3,6% до 2,4%, долю повторного инфаркта с 8,6% до 5,2%, терапия с использованием фрагмента химерного 7E3 позволяет сэкономить в среднем $682 на каждого пациента по сравнению с терапией, в которой используют плацебо. Однако, удваивая вероятность возникновения сильного кровотечения, указанная терапия теряет $242 от своего потенциального преимущества по стоимости, что приводит к итоговой экономии $440 на человека. Наблюдаемая средняя разница между применением высоких доз c7E3 (X = $10970 + 7284) и плацебо (X = $11376 + 12555) составляет $406, что хорошо согласуется с модельными расчетами.

Таким образом, значительно снижая вызванные ишемией осложнения при проведении чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии у пациентов, входящих в группу повышенного риска, ингибирование агрессивных тромбоцитов с помощью фрагмента химерного анти-GPIIb/IIIa приносит не только медицинские плоды, но и приводит к общему снижению затрат. Меры по снижению сильного кровотечения при назначении c7E3 помимо предоставления дополнительных лечебных преимуществ, могут способствовать также увеличению экономии до $700 на человека.

Время активированного свертывания крови увеличивается при проведении операций на коронарных сосудах в присутствии антагониста GPIIb/IIIa тромбоцитов

Время активированного свертывания крови используют при проведении чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии, с целью контроля за степенью подавления тромбина и степенью антикоагуляции и свести к минимуму неблагоприятные тромботические явления. При добавлении потенциальных ингибиторов тромбоцитов, таких как моноклональное антитело c7E3 Fab, полезность проведения измерения и регулирования времени активированного свертывания крови в процессе проведения чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии ранее не рассматривалась. До настоящего времени влияние c7E3 на время активированного свертывания крови не было известно. Изучено возможное влияние антагониста GPIIb/IIIa тромбоцитов на величину времени активированного свертывания крови в процессе проведения операции. В этом исследовании 2099 пациентов, которым предстояло провести чрескожную чресполостную реконструкцию коронарной артерии, выбираются методом слепого отбора и им назначают плацебо (n = 696) или антагонист GPIIb/IIIa, c7E3Fab (n = 1403). Несмотря на то, что обе группы получают одинаковое количество гепарина, а некоторые пациенты получают очень большие дозы гепарина (более 14000 единиц), по сравнению с группой, получающей плацебо, пациенты группы, которой назначают c7E3 Fab, имеют с поправкой на вес значительно большие значения (p < 0,001) для времени активированного свертывания крови (см. табл. C).

Подводя итог, следует отметить, что время активированного свертывания крови под действием антагониста c7E3 Fab по отношению к GPIIb/IIIa тромбоцитов увеличивается на 35-40 секунд. Это важный результат для выбора дозы конъюнктивной гепариновой терапии и проведения операций на коронарных артериях с использованием терапии, направленной против GPIIb/IIIa.

Влияние пола пациентов при проведении анализа результатов исследований по предотвращению ишемических осложнений в процессе проведения пластических операций на сосудах с использованием моноклонального антитела по отношению к рецептору GPIIb/IIIa тромбоцитов

Было изучено различие между полом пациентов при проведении исследований по предотвращению ишемических осложнений в процессе проведения пластических операций на сосудах с использованием c7E3 Fab, моноклонального антитела по отношению к рецептору GPIIb/IIIa тромбоцитов (см. Примеры 6 и 7). Пациентам проводят чрескожную чресполостную реконструкцию коронарной артерии и назначают непосредственно перед проведением оперативного вмешательства одно из следующих лечений с использованием слепого метода деления на группы: болюс c7E3 с последующим вливанием c7E3 в течение 12 часов; только болюс c7E3; только плацебо. Несмотря на то, что женщины были старше, имели меньший вес и у них отмечено больше сердечно-сосудистых факторов риска, чем у мужчин, не наблюдается различий между мужчинами по частоте наступления смертельного исхода (2,2% против 1,3%), инфаркта миокарда (7,5% против 6,3%), экстренной чрескожной чресполостной реконструкции коронарной артерии (2,6% против 3,1%), экстренного обводного шунтирования коронарной артерии (1,7% против 3,2%), размещения стента, внутриаортального баллонного насоса или с точки зрения общего негативного воздействия указанных ишемических осложнений в течение первых 30 дней (10,5% против 11,0%, p = 0,74). Поправка на известные показатели (методики лечения, вес, гипотонию, заболевания периферической сосудистой системы), а также на потенциальные статистические взаимосвязи между полами не изменили этот результат. Назначение болюса и вливания c7E3 Fab приводит к одинаковому уменьшению вероятности возникновения ишемических осложнений у обоих полов.

У женщин наблюдаются более сильные кровотечения (12,6% против 9, 8%), им потребовалось чаще проводить переливания (PRBC) крови (19,5% против 9,0%), и для них отмечается более высокий показатель кровотечения (гематокритное число/3 + единицы PRBC, 2,4 против 1,9). При использовании регрессионной модели для вычисления показателя кровотечения, несмотря на учет известных показателей (локализация лечения, возраст, вес, базовое значение гематокритного числа, гипертония) половой признак остался статистически независимым показателем (p = 0,0041).

В заключение следует отметить, что при использовании c7E3 кровотечение у женщин наблюдается чаще, чем у мужчин, однако для них не отмечено возрастание случаев осложнений при проведении пластических операций на кровеносных сосудах для групп с повышенным фактором риска.

Эквиваленты

Для специалистов в данной области техники вполне очевидны или же с помощью стандартных методик получены многие эквиваленты конкретных способов осуществления настоящего изобретения, которые приводятся в данном описании. Следует понимать, что все эти эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.