способ получения экстракта, обогащенного изофлавоновыми агликонами, из растительного материала (варианты), способ извлечения материала с высоким содержанием генистеина или дайдзеина из обогащенного изофлавоновыми агликонами материала

Формула изобретения

1. Способ получения экстракта, обогащенного изофлавоновыми агликонами, из растительного материала, включающий: (1) экстрагирование растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок, водой или водной экстрагирующей жидкостью, имеющей pH выше изоэлектрической точки указанного белка в указанном растительном материале, (2) обработку водного экстракта при температуре от 2 до 121^oC и pH от примерно 6 до примерно 13,5 в течение периода времени, достаточного для превращения большинства изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды, и (3) контактирование фермента, способного к расщеплению гликозидных связей, с изофлавоновыми гликозидами в водном экстракте при температуре от 5 до 75^oC и pH от примерно 3 до примерно 9 в течение периода времени, достаточного для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает выделение белкового материала, содержащего указанные изофлавоновые гликозиды из водного экстракта после этапа (2), обработку изофлавоновых гликозидов, содержащихся в белковом материале, ферментом, как на этапе (3), и выделение белкового материала, обогащенного изофлавоновыми агликонами.

3. Способ получения экстракта, обогащенного изофлавоновыми агликонами, из растительного материала, включающий: образование водной суспензии указанного растительного материала, содержащей изофлавоновый конъюгат и белок, причем суспензию затем подвергают обработке, как на этапе превращения (2), затем преобразованную суспензию экстрагируют водой или водной экстрагирующей жидкостью с pH выше изоэлектрической точки указанного белка в растительном материале, а изофлавоновые гликозиды в водном экстракте подвергают обработке ферментами, как на этапе (3).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения обогащенного изофлавоновым агликоном белкового материала белковый материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты, выделяют из водного экстракта после стадии (1), формируют водную суспензию белкового материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и в отношении суспензии белкового материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты, применяют операции со стадии (2) и (3).

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что экстрагирование осуществляют при pH от примерно 6 до примерно 10.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный экстракт обрабатывают при значении pH примерно 9 и температуре от 45 до 75^oC для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный водный экстракт обрабатывают при значении pH примерно 11 и температуре примерно от 5 до 50^oC для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды.

8. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный водный экстракт обрабатывают при значении pH примерно от 9 до примерно 11 и температуре примерно от 5 до 75^oC для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды.

9. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что контактирование фермента с указанными изофлавоновыми гликозидами включает добавление эффективного количества дополнительного фермента к водной суспензии или экстракту, содержащему изофлавоновые гликозиды.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительный фермент выбирают из ферментов альфа-галактозидаз, ферментов бета-галактозидаз, ферментов глюкоамилаз, ферментов пектиназ и их комбинаций.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительный фермент добавляют так, чтобы суммарная концентрация фермента, присутствующего в водном экстракте, составляла от примерно 0,1 до примерно 10% по весу от растительного материала по сухой основе.

12. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что растительный материал включает материал сои.

13. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что способ осуществляют таким образом, чтобы большая часть изофлавоновых конъюгатов и изофлавоновых гликозидов перешла в изофлавоновые агликоны.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что способ осуществляют таким образом, что изофлавоновые конъюгаты и изофлавоновые гликозиды полностью перешли в изофлавоновые агликоны.

15. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию доведения pH экстракта примерно до изоэлектрической точки указанного белка для осаждения белкового материала, содержащего белок и изофлавоновые агликоны.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что белковый материал промывается водой в весовом количестве меньше, чем 6-кратный вес осажденного белкового материала.

17. Способ по п.3, отличающийся тем, что водная суспензия содержит до 20% по весу указанного растительного материала.

18. Способ по п.4, отличающийся тем, что водная суспензия содержит до примерно 30% по весу указанного растительного материала.

19. Способ извлечения материала с высоким содержанием генистеина или дайдзеина из обогащенного изофлавоновыми агликонами материала, включающий: - экстрагирование обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала экстрагентом для получения обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта, и - контактирование указанного экстракта с адсорбентным материалом в течение времени, достаточного для выделения материала с высоким содержанием генистеина или дайдзеина, соответственно, из указанного обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта.

20. Способ по п.19, отличающийся тем, что экстрагент является водным раствором спирта, содержащим от примерно 30 до примерно 90% спирта.

21. Способ по п.19, отличающийся тем, что экстрагент имеет значение pH, равное примерно изоэлектрической точке указанного белка в обогащенном изофлавоновым агликоном растительном белковом материале.

22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что обогащенный изофлавоновым агликоном растительный белковый материал экстрагируется указанным экстрагентом, причем весовое отношение экстрагента к материалу не превышает примерно 11:1.

23. Способ по п.19, отличающийся тем, что обогащенный изофлавоновым агликоном экстракт пропускают через указанный адсорбентный материал с помощью элюента, чтобы указанный экстракт проконтактировал с адсорбентным материалом для выделения материала с высоким содержанием генистеина или, соответственно, дайдзеина, из указанного экстракта благодаря дифференциальному обратимому связыванию генистеина или, соответственно, дайдзеина, в указанном экстракте с адсорбентным материалом.

24. Способ по п.19, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию удаления остаточного растительного белкового материала из экстракта.

25. Способ по п.19, отличающийся тем, что материал с высоким содержанием генистеина содержит, по крайней мере, 40% генистеина.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что материал с высоким содержанием генистеина содержит, по крайней мере, 90% генистеина.

27. Способ по п.19, отличающийся тем, что материал с высоким содержанием дайдзеина содержит, по крайней мере. 40% дайдзеина.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к обогащенному изофлавоновыми агликонами растительному белковому экстракту и белковому материалу и методам получения этих материалов путем осуществления двухстадийного способа превращения изофлавоновых конъюгатов в растительном белковом материале в изофлавоновые агликоны, и к материалу с высоким содержанием генистеина и материалу с высоким содержанием дайдзеина и способам получения этих материалов из обогащенного изофлавоновыми агликонами белкового вещества.

Изофлавоны встречаются в ряде бобовых растений, содержащих растительные белковые вещества, таких как соя. Эти соединения включают дайдзин, 6"" - OAx - дайдзин, 6"" - OMal - дайдзин, дайдзеин, генистин, 6"" - OAc - генистин, 6"" - OMal - генистин, генистеин, глицитин, 6"" - OAc - глицитин, 6"" - OMal - глицитин, глицетеин, биочанин A, формононентин и куместрол. Обычно эти соединения ассоциируются с присущим соевым бобам горьким вкусом.

Изофлавоны в растительном белковом материале включают изофлавоновые гликозиды (гликоны), изофлавоновые конъюгаты, и изофлавоновые агликоны. Изофлавоновые гликозиды имеют молекулу глюкозы, связанную с изофлавоновой частью. Изофлавоновые конъюгаты имеют дополнительные части, связанные с молекулой глюкозы изофлавонового гликозида, например, 6"" - OAc - генистин содержит ацетатную группу, связанную с молекулой глюкозы генистина в шестом положении. Изофлавоновые агликоны состоят только из изофлавоновой части.

Соя содержит три "семейства" изофлавоновых соединений, включающих соответствующий гликозид, конъюгат и представителей агликонов: семейство генистеина, семейство дайдзеина и семейство гдицитеина. Генистеиновое семейство включает гликозид генистин; конъюганты 6"" - OMal - генистина (6"" - малонатный эфир генистина) и 6"" - OAc - генистина (6"" - ацетатный эфир генистина) и агликон генистеин. Семейство даидзеина включает гликозид даидзин; конъюганты 6"" - OMal - даидзин и 6"" - OAc - даидзин и агликон дайдзеин. Глицитеиновое семейство включает гликозид глицитин; коньюгат 6"" - OMal - глицитин и агликон глицитеин.

При производстве коммерческих продуктов, таких как изоляты и концентраты растительного белка, основным было удаление этих веществ. Например, при обычном процессе производства изолята или концентрата соевого белка, при котором соевые хлопья экстрагируют с помощью водной щелочной среды, много изофлаванов солюбилизируется в экстракте вместе с соевым белком. Белок осаждается из экстракта путем подкисления экстракта и выделяется с образованием изолята или концентрата, причем остается сыворотка, в которой содержится много солюбилизированных изофлавонов. Осадочные изофлавоны, оставшиеся в осажденном кислотой белке, обычно удаляют путем исчерпывающего промывания. Сыворотку и промывные воды обычно отбрасывают.

Недавно было обнаружено, что изофлавоны, содержащиеся в растительных белках, таких как соевые, имеют медицинское значение. Хотя все изофлавоны представляют интерес по медицинской оценке, агликоны являются особыми изофлавонами, представляющими наибольший интерес. Генистеин и дайдзеин могут значительно снижать сердечно-сосудистые факторы риска. "Plant and Mammalian Estrogen Effect on Plasma Lipids of Female Monkeys", Circulation, vol. 90, p. 1259 (Oct. 1994). Генистеин и дайдзеин, как полагают, также снижает симптоматику при состояниях, вызванных сниженными или измененными уровнями эндогенных эстрогенов у женщин, таких как менопауза или предменструальный синдром. Кроме того, недавно было обнаружено, что изофлавоны агликонов могут подавлять рост человеческих раковых клеток, таких как клетки рака грудных желез и клетки рака простаты, как описано в следующих статьях: "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells Independence from Estrogen Receptors and the Multi - Drug Resistance Gene" by Peterson and Barnes. Biochemical and Biophysical Research Communications. Vol. 179, N 1, pp. 661 - 667, Aug. 30, 1991; "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation" by Peterson and Barnes, The Prostate, Vol. 22, pp. 335-345 (1993); и "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer" by Barnes et al., Mutagens and Carcinogens in the Diet, pp. 239-253 (1990).

Как отмечено выше, изофлавоны включают даидзин, генистеин, и глицитеин. Эти агликоны имеют следующую общую формулу:



где R₁, R₂, R₃ и R₄ могут выбираться из группы, состоящей из H, ОН и OCH₃.

Генистеин имеет формулу, представленную выше, где R₁ = ОН, R₂ = H, R₃ = ОН и R₄ = ОН, дайдзеин имеет формулу, представленную выше, где R₁ = ОН, R₂ = H, R₃ = H и R₄ = ОН и глицитеин имеет формулу, представленную выше, где R₁ = ОН, R₂ = OCH₃, R₃ = H и R₄=OH.

Поэтому данное изобретение направлено на агликоны и обогащение растительного белкового экстракта и растительного белкового материала этими соединениями, а также на материал с высоким содержанием генистеина и материал с высоким содержанием дайдзеина. Данное изобретение также направлено на способы получения обогащенного агликоном растительного белкового экстракта, обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала, материала с высоким содержанием генистеина и материала с высоким содержанием дайдзеина. Основной способ превращения изофлавоновых конъюгатов растительного белка в изофлавоновые агликоны известен и представлен в рассматриваемой в настоящее время заявке США сер. N 08/477.102, поданной 7 июня 1995, принадлежащей Заявителю настоящей заявки.

Способы превращения гликозидов в изофлавоновые агликоны также известны. Способ превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны для получения обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового экстракта и обогащенный изофлавоновым агликоном изолят растительного белка представлен в рассматриваемой в настоящее время Патентной заявке РСТ N PCT/US94/10697, принадлежащей владельцу данного изобретения.

Известны также и другие способы превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны в этой области технологии, такие как описанные в Японской патентной заявке 258669 Obata et al. Эти способы не обеспечивают превращение изофлавоновых конъюга- тов в изофлавоновые агликоны, не обеспечивают получение материала с высоким содержанием генистеина или материала с высоким содержанием дайдзеина, производимых из обогащенного агликоном растительного белкового изолята. Кроме того, при этих способах достигается только умеренная степень превращения гликозидов в агликоны и необходим существенный период времени для осуществления этой умеренной степени превращения. Поэтому такие процессы не желательны при крупномасштабных операциях промышленного значения.

Соответственно целью данного изобретения является получение обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового экстракта и способ его производства.

Дополнительной целью данного изобретения является получение обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала и способ производства этого материала.

Еще одной целью данного изобретения является получение материала с высоким содержанием генистеина и материала с высоким содержанием дайдзеина и процессы производства этих материалов из обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала.

Изобретение представляет собой обогащенный изофлавоновым агликоном экстракт и способ его производства из растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок. Этот способ включает экстрагирование растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты, с помощью водного экстрагента, имеющего pH выше примерно изоэлектрической точки белка, содержащегося в растительном материале. Водный экстракт обрабатывается при температуре, pH и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды. В водном экстракте с изофлавоновыми гликозидами контактирует фермент при температуре, pH и в течение периода времени, достаточного для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны с получением обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта.

В одном варианте осуществления этого изобретения экстрагирование осуществляется при pH от примерно 6 до примерно 10. Предпочтительно весовое отношение экстрагента к растительному белковому материалу составляет от примерно 8:1 до примерно 16:1.

В другом варианте осуществления изобретения изофлавоновые конъюгаты превращаются в изофлавоновые гликозиды путем обработки водного экстракта при температуре, равной примерно от 2^oC до примерно 121^oC, и значении pH, равном от примерно 6 до примерно 13,5. Предпочтительно превращение осуществляется при pH, равном 11, и температуре, равной от примерно 5^oC до примерно 50^oC, или же при pH, равном примерно 9, и температуре, равной от примерно 45^oC до примерно 75^oC.

В еще одном варианте осуществления этого изобретения изофлавоновые гликозиды превращаются в изофлавоновые агликоны путем контактирования изофлавоновых гликозидов с ферментом в водном экстракте при температуре между примерно от 5^oC и примерно 75^oC и значении pH между примерно 3 и примерно 9. Предпочтительно фермент является ферментом сахаридазой, способным к расщеплению 1,4-гликозидных связей.

В другом варианте осуществления изобретения pH обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта доводится до примерно изоэлектрической точки белка в экстракте для осаждения белкового материала, содержащего белок и изофлавоновые агликоны.

Реализованы высокие скорости превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды и изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны. В одном из вариантов изобретения большая часть, а предпочтительно по существу все изофлавоновые конъюгаты превращаются в изофлавоновые агликоны.

В другом аспекте это изобретение относится к обогащенному изофлавоновым агликоном белковому материалу и способу его получения из обогащенного изофлавоновым гликозидом белкового материала, получаемого из растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок. Растительный материал экстрагируется водным экстрагентом, имеющим pH примерно выше изоэлектрической точки белка в растительном материале. Водный экстракт обрабатывается при температуре и pH в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды. Белковый материал, содержащий изофлавоновые гликозиды, отделяется от экстракта, и изофлавоновые гликозиды в белковом материале контактируют с ферментом при pH и температуре и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны.

В еще одном аспекте изобретение относится к экстракту, обогащенному изофлавоновым агликоном, и способу его получения из обогащенного изофлавоновым гликозидом растительного материала, производимого из растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок. Из растительного материала образуется водная суспензия, и эта суспензия обрабатывается при pH и температуре и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды. Обогащенный изофлавоновым гликозидом растительный материал затем экстрагируют водным экстрагентом, имеющим pH примерно выше изоэлектрической точки белка в растительном материале. Изофлавоновые гликозиды в экстракте контактируют с ферментом при температуре и pH и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны.

В предпочтительном варианте осуществления изофлавоновые гликозиды в экстракте контактируют с ферментом с помощью добавления эффективного количества дополнительного фермента к экстракту, где дополнительный фермент предпочтительно является ферментом сахаридазой, способным к расщеплению 1,4-гликозидных связей.

В другом варианте осуществления обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал формируется из обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта путем доведения pH экстракта до примерно изоэлектрической точки белка для осаждения белкового материала, содержащего белок и изофлавоновые агликоны.

В еще одном аспекте это изобретение представляет собой обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал и способ его получения из белкового материала, производимого из растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок. Растительный материал экстрагируется водным экстрагентом, имеющим pH примерно выше изоэлектрической точки этого белка. Белковый материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты, отделяется от экстракта путем доведения pH экстракта до примерно изоэлектрической точки белка. Из белкового материала образуется водная суспензия, и водную суспензию обрабатывают при pH и температуре и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды. Изофлавоновые гликозиды в суспензии контактируют с ферментом при pH и температуре и в течение периода времени, достаточных для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны.

В предпочтительном варианте осуществления изофлавоновые гликозиды в суспензии контактируют с ферментом при добавлении эффективного количества дополнительного фермента к суспензии, когда дополнительный фермент предпочтительно является ферментом сахаридазой, способным к расщеплению 1,4-гликозидных связей.

В еще одном аспекте это изобретение относится к материалу с высоким содержанием генистеина и процессу его выделения из обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала. Получается обогащенный изофлавоновым агликоном растительный белковый материал и экстрагируется с помощью водно-спиртового экстрагента для получения обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта. Экстракт контактирует с материалом адсорбента в течение периода времени, достаточного для выделения материала с высоким содержанием генистеина из экстракта.

В последнем аспекте изобретение относится к материалу с высоким содержанием дайдзеина и способу его получения из обогащенного изофлавоновым агликоном растительного белкового материала. Получается обогащенный изофлавоновым агликоном растительный белковый материал и экстрагируется водно-спиртовым экстрагентом с получением обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта. Экстракт контактирует с материалом адсорбента в течение периода времени, достаточного для выделения из экстракта материала с высоким содержанием дайдзеина.

Исходным материалом для способа предпочтительного осуществления является любой растительный белковый материал или растительный материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты, и растительный белок. В предпочтительном варианте осуществления исходным материалом является материал сои, так как осуществление способа производства обогащенных изофлавоновым агликоном экстрактов и белковых материалов особенно удобно из материала сои. Термин "материал сои", как он использован здесь, относится к соевым бобам или любому типу соевого сырья. Наиболее предпочтительным исходным материалом являются соевые хлопья, из которых было удалено масло путем экстракции растворителем по обычным в этой области технологии процедурам. Данный процесс в основном применим к широкому ряду растительных белковых материалов помимо материалов сои и соевых бобов.

В зависимости от типа вегетативного растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты, может быть необходимо в некоторых случаях перерабатывать растительный материал в тонко измельченную форму. Это может быть желательно для того, чтобы сделать изофлавоновые соединения, содержащиеся в растительном материале, доступными для различных реагентов, что описано более детально ниже. Материал может быть измельченным, истолченным (раздавленным) или обработанным иначе известными общепринятыми способами. Если растительный материал находится в таком состоянии, что изофлавоновые соединения в растительном материале доступны для реагентов или реактивов извне, таком например, как небольшие листовые части некоторых растений, может быть не нужно подвергать растительный материал подобной обработке.

На первой стадии или операции растительный белок и изофлавоновые соединения, включая изофлавоновые конъюгаты, экстрагируют из растительного белкового материала. Хлопья экстрагируют водным экстрагентом, имеющим pH выше примерно изоэлектрической точки белкового материала, предпочтительно при pH, равном примерно от 6,0 до примерно 10,0, и наиболее предпочтительно, при pH, равном от примерно 6,7 до примерно 9,7. Обычно, если необходимо, для повышения pH водного экстрагента можно использовать щелочные реагенты, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид кальция. Желаемые изофлавоновые соединения и растительные белки солюбилизируются в водном экстракте.

Для того чтобы довести до максимума выделение этих соединений в водном экстракте, предпочтительно, чтобы весовое отношение соевых хлопьев или другого растительного белкового материала к экстрагенту регулировалось до определенных уровней, так чтобы солюбилизировать как можно больше изофлавонов в растительном материале. Экстракция белков и изофлавонов может проводиться с помощью обычных процедур экстрагирования, включая противоточное экстрагирование растительного белкового материала, предпочтительно при весовом отношении водного экстрагента к растительному белковому материалу от примерно 8: 1 до примерно 16:1. По завершении экстрагирования растительного белкового материала экстрагент дает водный экстракт белка и изофлавонов.

Альтернативно можно использовать двухстадийный процесс экстракции, когда весовое отношение экстрагента к растительному белковому материалу при первоначальном экстрагировании предпочтительно составляет примерно 10:1, а весовое отношение экстрагента к растительному белковому материалу при втором экстрагировании составляет примерно 6:1 или менее, так что в целом весовое отношение экстрагента к растительному белковому материалу при обоих экстрагированиях не превышает в целом весового отношения экстрагента к растительному белковому материалу, равного примерно 16:1. Могут также использоваться другие методы экстрагирования, при которых весовое отношение экстрагента к растительному белковому материалу составляет предпочтительно 16:1 или менее.

На первой стадии превращения изофлавона или при первой операции изофлавоновые конъюгаты в водном экстракте превращаются в изофлавоновые гликозиды с получением обогащенного изофлавоновыми гликозидами экстракта. Превращение, как было обнаружено, зависит от pH и температуры водного экстракта.

Интервал pH для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые глокозиды находится в пределах от примерно 6 до примерно 13,5. pH водного экстракта должен доводиться до желаемого pH, если необходимо, с помощью подходящего основания, щелочи или реагента с щелочными свойствами, если pH нужно повысить, или, если pH нужно понизить, с помощью подходящей кислоты или кислотного реагента. Превращение изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды, как было обнаружено, катализируется основанием, и таким образом, наиболее предпочтительно использовать высокий pH для достижения быстрого превращения. Наиболее предпочтительным pH для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды является pH, равный от примерно 9 до примерно 11.

Температурный интервал для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды находится в пределах от примерно 2^oC до примерно 121^oC. Температурный интервал, при котором легко происходит превращение, зависит от pH водного экстракта. Изобретатели обнаружили, что превращение легко происходит при более низких температурах, когда pH относительно высок. Например, при pH, равном примерно 11, превращение происходит легко и эффективно в температурном интервале от примерно 5^oC до примерно 50^oC. При pH, равном примерно 9 эффективное превращение происходит в температурном интервале от примерно 45^oC до примерно 75^oC. Когда pH водного экстракта относительно низок, превращение происходит при более высоких температурах. Например, при pH, равном примерно 6, превращение происходит в температурном интервале от примерно 80^oC до примерно 121^oC. При предпочтительном осуществлении превращение производится при температуре примерно 35^oC и pH, равном примерно 11. При другом предпочтительном осуществлении превращение производится при температуре, равной примерно 73^oC и pH, равном примерно 9.

Период времени для превращения изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды на первой стадии зависит непосредственно от используемых интервалов pH и температуры. Такие сроки превращения обычно находятся в интервале от примерно 15 минут до нескольких часов или более. Превращение происходит более быстро при более высоком pH и при более высокой температуре. При pH, равном примерно 9, превращение является по существу полным в течение от примерно 4 часов до примерно 6 часов при 73^oC. При наиболее предпочтительном осуществлении изофлавоновые конъюгаты превращаются в изофлавоновые гликозиды в течение от примерно 30 минут до примерно 1 часа, предпочтительно, примерно 45 минут при pH, равном примерно 11 и при температуре, равной примерно 35^oC.

Первая стадия превращения предпочтительно производится в водной системе. В системе могут также присутствовать другие совместимые с водой компоненты, такие как спирт с низким молекулярным весом и другие водорастворимые растворители.

Первая стадия изофлавонового превращения в высшей степени эффективна, причем превращается по крайней мере большая часть, а предпочтительно по существу все количество, изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды. Обычно от примерно 80% до примерно 100% изофлавоновых конъюгатов превращается в изофлавоновые гликозиды. Путем использования предпочтительных параметров реакции, описанных выше, возможно достичь превращения, равного 95% или более. Эти высокие степени превращения особенно привлекательны для крупномасштабных процессов промышленного значения.

На второй стадии или операции превращения изофлавонов в изофлавоновые гликозиды, полученные на первой стадии, а также изофлавоновые гликозиды, ранее присутствовавшие в водном экстракте, превращаются в изофлавоновые агликоны с помощью ферментативной реакции. Это превращение производит обогащенный изофлавоновым агликоном экстракт из экстракта, обогащенного изофлавоновым гликозидом.

Вторая стадия превращения, как было обнаружено, зависит от концентрации ферментов, присутствующих в экстракте, и их характеристик. Ферментами, необходимыми для осуществления превращения, являются ферменты, способные к расщеплению гликозидной связи между изофлавоновой частью и молекулой глюкозы изофлавоновых гликозидов. При предпочтительном осуществлении ферментами являются ферменты сахаридаза, эстераза или глюкоамилаза, способные к расщеплению 1,4-гликозидных связей.

Концентрация ферментов, необходимая для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны, зависит от ряда факторов, включая тип ферментов, присутствующих в водном экстракте, распределения концентраций ферментов, активности ферментов, pH и температуры экстракта во время превращения. Ферменты по природе могут присутствовать в экстракте и происходить или из растительного белкового материала или появляться в результате микробного роста в экстракте. Такие естественно присутствующие ферменты называются здесь "остаточными" ферментами, а ферменты, которые добавляют к экстракту, называются здесь "дополнительными" ферментами.

В экстракте должно присутствовать достаточно фермента, чтобы превратить по крайней мере большую часть, а предпочтительно, по существу все количество изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны. Обычно, если остаточных ферментов в экстракте недостаточно для осуществления превращения, к экстракту должны быть добавлены дополнительные ферменты. В предпочтительном варианте осуществления дополнительные ферменты добавляются в экстракт независимо от того, достаточно ли остаточных ферментов присутствует в экстракте, так как добавление дополнительных ферментов заметно снижает время, необходимое для осуществления по существу полного превращения гликозидов в агликоны. Если добавляются дополнительные ферменты, эти дополнительные ферменты должны добавляться так, чтобы концентрация присутствующего фермента в целом составляла от примерно 0,1% до примерно 10% по весу от растительного белкового материала по сухому веществу.

Дополнительные ферменты выбираются на основе оптимальной активности при выбранных условиях pH и температуры и стоимостной эффективности. Дополнительные ферменты являются ферментами, способными к расщеплению связи между изофлавоновой частью и молекулой глюкозы изофлавоновых гликозидов, такими как ферменты сахаридаза, эстераза и глюкоамилаза, способными к расщеплению 1,4-гликозидных связей. Предпочтительными дополнительными ферментами являются коммерчески доступные ферменты - альфа- и бетаглюкозидазы, бетагалактозидазы, глюкоамилазы и пектиназы. Особенно предпочтительными ферментами являются такие, как биопектиназа 100L (которая предпочтительно используется при интервале pH от примерно 3 до примерно 6), биопектиназа 300L (оптимальный интервал pH от примерно 3 до примерно 6), биопектиназа OK 70L (оптимальный интервал pH от примерно 3 до примерно 6), биолактаза 30000 (оптимальный интервал pH от примерно 3 до примерно 6), нейтральная лактаза (оптимальный интервал pH от примерно 6 до примерно 8), все из которых доступны от Quest International, 1833, 57^th Street, Office Box 3917, Sarasota, Florida 34243. Также особенно предпочтительными являются лактаза F (которая предпочтительно используется в интервале pH от примерно 4 до примерно 6) и лактаза 50000 (оптимальный интервал pH от примерно 4 до примерно 6), оба доступны от Amano International Enzyme Co., Inc., Post Office Box 1000, Troy, Virginia 22974. Другие особенно предпочтительные дополнительные ферменты включают G - зим G990 (оптимальный интервал pH от примерно 4 до примерно 6) и концентрат лактазы грибов Enzeco (оптимальный интервал pH от примерно 4 до примерно 6), доступный от Enzyme Development Corporation, 2 Penn Plaza, Suite 2439, New York, New York 10121; лактозим 3000L (который предпочтительно используется в интервале pH от примерно 6 до примерно 8) и альфа - Gal 600L (который предпочтительно используется в интервале pH от примерно 4 до примерно 6,5), доступные от Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., 33 Turner Road, Danbury, Connecticut 0681; максипакт L2000 (который предпочтительно используется в интервале pH от примерно 4 до примерно 6), доступный от Gist Brocades Food Ingredients, Inc. , King of Prussia, Pennsylvania, 19406; и нейтральная лактаза (которая предпочтительно используется в интервале pH от примерно 6 до примерно 8), доступная от Pfizer Food Science Group, 205 East 42nd Street, New York, New York 10017.

Интервал pH для превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны составляет от примерно 3 до примерно 9. pH, который используется, зависит непосредственно от типа используемого фермента и должен выбираться в соответствии с этим. Остаточный фермент активен в интервале pH от примерно 7 до примерно 9, хотя полагают, что pH экстракта снижается в течение превращения. Дополнительные ферменты активны в оптимальном интервале pH, указываемом производителем фермента, как представлено выше для нескольких конкретных ферментов. Обычно дополнительные ферменты активны или в нейтральном интервале pH от примерно 6 до примерно 8, или в кислом интервале pH от примерно 3 до примерно 6.

Значение pH может быть доведено до желаемого значения для проведения второй стадии изофлавонового превращения. В большинстве случаев pH снижается с относительно высокого или основного pH первой стадии изофлавонового превращения путем добавления одной или более подходящих кислот, таких как уксусная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, хлористоводородная кислота или любой другой подходящий реагент.

Температурный интервал для второй стадии изофлавонового превращения составляет от примерно 5^oC до примерно 75^oC. Температура значительно влияет на активность ферментов и следовательно на скорость превращения. Дополнительные ферменты могут быть активны при температуре свыше 70^oC, например Альфа - Gal 600L активен при 75^oC, однако предпочтительно проводить превращение при более низких температурах, чтобы избежать дезактивации фермента. При предпочтительном осуществлении превращение производится в интервале температур от примерно 35^oC до примерно 45^oC.

Время, необходимое для второй стадии изофлавонового превращения, зависит от факторов, связанных с ферментом, в частности от концентрации и температуры и pH системы. В большинстве случаев возможно достичь полного превращения в течение 24 часов, однако предпочтительно, чтобы дополнительный фермент добавлялся до заметного увеличения скорости реакции. Избираемые дополнительный фермент, концентрация фермента, pH и температура, предпочтительно, вызывают по существу полное превращение в течение 2 часов, и наиболее предпочтительно, в течение 1 часа.

Очень высокие степени превращения в этом процессе являются такими, что по крайней мере большинство, а предпочтительно по существу все количество изофлавоновых гликозидов, присутствующих в экстракте, превращается в агликоновую форму. Термин "большая часть" (или "большинство") относится к степени превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны, равной по меньшей мере примерно 50%. Термин "по существу все количество" относится к степени превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны, равной по меньшей мере примерно 80%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%. Такие высокие степени превращения на надежной основе замечательны и желательны для применения в промышленном масштабе. Обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал может быть выделен из обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта. По завершении второй стадии изофлавонового превращения pH, если необходимо, доводится добавлением кислоты до примерно изоэлектрической точки растительного белка, для белка сои обычно в интервале от примерно 4,0 до примерно 5,0, а предпочтительно в интервале между примерно 4,4 и примерно 4,6. Белок осаждается в результате изменения pH экстракта в виде творожистой массы. Значительная часть изофлавоновых агликонов захватывается этой творожистой массой. После осаждения творожистая масса, или осажденный белок, отделяется от экстракта в виде белкового материала, обогащенного изофлавоновыми агликонами. Предпочтительно, обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал отделяется от экстракта путем центрифугирования или фильтрации.

При наиболее предпочтительном осуществлении промывание выделенного белкового материала или полностью исключается или сводится к минимуму, чтобы существенно снизить удаление изофлавоновых агликонов из белкового материала. Промывание белкового материала водой может поэтому полностью исключаться или ограничиваться однократным промыванием водой, во время которого весовое отношение воды к белковому материалу составляет от примерно 2:1 до примерно 6: 1. Отсутствие промывания осажденной творожистой массы дает белковый материал, обогащенный желаемыми уровнями изофлавонов, хотя могло бы производиться и более интенсивное промывание с меньшим выходом изофлавонов.

Выделенный белковый материал может быть обезвожен путем центрифугирования или концентрирования или их сочетания и высушен обычным путем. Предпочтительное осуществление не предназначено для ограничения конкретных средств удаления воды, хотя предпочтительно использовать общепринятые методы обезвоживания и высушивания, такие как центрифугирование и распылительная сушка, для получения высушенного белкового материала.

В уже описанном способе предпочтительного осуществления используется как первая, так и вторая стадия изофлавонового превращения сразу же после получения экстракта. Данное изобретение также включает способ, при котором растительный материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты и белок, экстрагируется водным экстрагентом, имеющим pH примерно выше изоэлектрической точки этого белка; первая стадия изофлавонового превращения производится в экстракте; белковый материал, содержащий изофлавоновые гликозиды, отделяется от экстракта; и вторая стадия изофлавонового превращения производится в белковом материале. Стадии в этом способе могут выполняться тем же общим способом, что и описанный выше.

Данное изобретение, кроме того, включает способ, при котором образуется густая водная суспензия из растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок, причем первая стадия изофлавонового превращения производится в водной суспензии; растительный материал экстрагируется водным экстрагентом, имеющим pH выше примерно изоэлектрической точки белка; а вторая стадия изофлавонового превращения производится у флавоновых гликозидов в экстракте. Водная суспензия растительного материала предпочтительно содержит до 20% растительного материала по весу. Стадии этого способа могут выполняться тем же самым общим способом, что и описанный выше. Кроме того, белковый материал, содержащий изофлавоновые агликоны, можно выделять из экстракта после второй стадии изофлавонового превращения способом, описанным выше.

Данное изобретение также включает способ, в котором растительный белковый материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты и белок, экстрагируется водным экстрактом, имеющим pH выше примерно изоэлектрической точки белка: белковый материал, содержащий изофлавоновые конъюгаты выделяется из экстракта; из белкового материала образуется густая водная суспензия, и первая и вторая стадии изофлавонового превращения производятся в густой водной суспензии белкового материала. Густая водная суспензия белкового материала предпочтительно содержит до 30% белкового материала по весу. Стадии этого процесса могут выполняться тем же самым общим способом, что и описанный выше.

Предполагают, что как первая, так и вторая стадии изофлавонового превращения могли бы выполняться в густой водной смеси растительного материала, содержащего изофлавоновые конъюгаты и белок, в экстракте такого растительного материала и в белковом материале, выделенном из такого экстракта. Данное изобретение включает комбинацию любых из предшествующих стадий с образованием обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта белкового материала.

Материал с высоким содержанием генистеина и материал с высоким содержанием дайдзеина может производиться из полученного обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта или белкового материала. Как он использован здесь, материал с высоким содержанием генистеина определяется как растительный материал, содержащий по меньшей мере 40% генистеина, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% генистеина, вместе с остаточным растительным материалом, который является остаточным соевым материалом, если материал с высоким содержанием генистеина получают из материала сои. Материал с высоким содержанием дайдзеина содержит по крайней мере 40% дайдзеина вместе с остаточным растительным материалом, который является соевым материалом, если материал с высоким содержанием дайдзеина получают из соевого материала.

Обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал можно сначала промыть и отфильтровать для удаления нежелательных солей и сахаров. Обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал смешивают с водой, причем вода присутствует в отношении до 6:1 к белковому материалу. Вода должна быть холодной, чтобы свести к минимуму растворение изофлавоновых агликонов в воде, а предпочтительно, имеет температуру от примерно 5^oC до примерно 30^oC. Белковый материал перемешивают с водой в течение от примерно 15 до примерно 30 минут и затем белковый материал отфильтровывают от воды, используя любые общепринятые средства фильтрования, предпочтительно, фильтрование смеси через обычную фильтровальную бумагу. Стадия фильтрования и промывания может быть исключена, если желательно, чтобы свести к минимуму любую потенциальную потерю изофлавоновых агликонов с промывной водой.

Обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал можно затем экстрагировать водно-спиртовым экстрагентом для удаления изофлавоновых агликонов из белкового материала и получения экстракта изофлавоновых агликонов. В качестве спиртового компонента экстрагента предпочтительны спирты с низким молекулярным весом, такие как метанол и особенно этанол. Было обнаружено, что изофлавоновые агликоны растворимы в экстрагенте с почти всеми концентрациями спирта. Изофлавоновые агликоны особенно хорошо растворимы, когда экстрагент содержит спирт в концентрации между примерно 30% и примерно 90%, и наиболее предпочтительно, когда экстрагент содержит спирт в концентрации между примерно 60% и примерно 80%. Хотя водно-спиртовой раствор является предпочтительным растворителем, для осуществления экстрагирования изофлавоновых агликонов из белкового материала можно использовать и другие растворители, включая воду, ацетонитрил, метиленхлорид, ацетон и этилацетат.

Экстрагирование производится с использованием минимального количества экстрагента. Предпочтительно, чтобы весовое отношение экстрагента к обогащенному изофлавоновым агликоном белковому материалу не превышало 11:1. Экстрагирование может производиться любым общепринятым методом экстрагирования, включая противоточную экстракцию или двойную экстракцию, когда весовое отношение объединенных экстрактов к белковому материалу не превышает 11:1.

При предпочтительном осуществлении белковый материал первоначально экстрагируется 80 %-ным этанолом, причем весовое отношение экстрагента к белковому материалу составляет примерно 6:1. Экстрагент отделяется от белкового материала с помощью общепринятых средств отделения, таких как центрифуга или фильтр-пресс, и экстракт собирают. Белковый материал экстрагируют снова 80%-ным этанолом, причем весовое отношение экстрагента к белковому материалу составляет примерно 4: 1. Экстрагент снова собирают и добавляют к первоначально собранному экстракту. Белковый материал затем промывают быстрым потоком воды, причем весовое отношение воды к белковому материалу составляет примерно 4:1, и вода добавляется к собранным экстрактам.

Хотя экстракция может проводиться при любом pH, предпочтительно, чтобы экстрагент имел pH от примерно 7 до примерно 10. Образование белкового геля исключается в предпочтительном интервале pH, и если белковый материал нужно возвратить в исходное состояние, также как и экстракт изофлавоновых агликонов, образование нежелательных аминокислотных побочных продуктов в белковом материале исключается в предпочтительном интервале pH.

Экстрагирование может проводиться при любой температуре вплоть до точки кипения экстрагента, и предпочтительно оно проводится в интервале между примерно 25^oC и примерно 70^oC. Чтобы осуществить максимальное выделение изофлавоновых агликонов из белкового материала, предпочтительно, чтобы экстрагирование проводилось при температуре от примерно 50^oC до примерно 70^oC, наиболее предпочтительно, при примерно 60^oC.

После экстрагирования материал с высоким содержанием генистеина и материал с высоким содержанием дайдзеина можно выделить из экстракта изофлавоновых агликонов путем контакта экстракта с материалом адсорбента в течение времени, достаточного для выделения материала с высоким содержанием генистеина и высоким содержанием дайдзеина из экстракта. При предпочтительном осуществлении материалы с высоким содержанием генистеина и высоким содержанием дайдзеина выделяют из экстракта путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой. Генистеин и дайдзеин отделяют от других изофлавонов и примесей в экстракте путем элюирования экстракта через частицы материала адсорбента, которые свободно связывают генистеин, дайдзеин, другие изофлавоны и примеси специфичным для соединения образом, тем самым обеспечивая возможность отделения каждого из соединений.

Экстракт изофлавоновых агликонов первоначально фильтруют для удаления нерастворимого материала, который может закупорить колонку для ВЭЖХ. Экстракт можно фильтровать обычным способом ультрафильтрации, при котором также удаляется остаточный белок, который может находиться в экстракте.

Колонку ВЭЖХ готовят путем заполнения обычной коммерчески доступной колонки ВЭЖХ конкретным адсорбентным материалом, который будет обратимо связывать генистеин, дайдзеин, другие изофлавоны и примеси специфичным для соединения образом. Адсорбентный материал может быть любым наполнителем для ВЭЖХ с обращенной фазой, однако предпочтительный наполнитель может быть выбран по критериям поглотительной способности, эффективности разделения и стоимости. Одним из таких наполнителей является кромасил C18 (Kromasil C18) 16 мкм, бусины 100 A, доступны от фирмы Eka Nobet, Nobel Industries, Sweden.

Отфильтрованный экстракт пропускают через заполненную колонку для ВЭЖХ до тех пор, пока все связывающие сайты колонки полностью насытятся изофлавонами, что определяется по появлению изофлавонов в вытекающем из колонки. Колонку для ВЭЖХ можно затем элюировать полярным элюентом для осуществления разделения. При предпочтительном осуществлении элюент является водным раствором спирта. Водно-спиртовой элюент может иметь содержание спирта, равное примерно 50% спирта, чтобы получить как хорошее разделение, так и хорошую растворимость изофлавонов. Спирт, предпочтительно, является метанолом или этанолом, причем этанол предпочтительнее, когда материалы с высоким содержанием генистеина или высоким содержанием дайдзеина должны использоваться для пищевых или лекарственных препаратов.

Материалы с высоким содержанием генистеина и высоким содержанием дайдзеина собирают из вытекающего с колонки. Фракция элюента, содержащая дайдзеин, вытекает из колонки первой, за ней следует фракция глицитеина, за которой следует фракция более полярного генистеина. Фракции дайдзеина и генистеина собирают по мере их элюирования из колонки. Можно также собрать фракцию глицетеина, если желательно.

Спирт из фракций может быть удален путем выпаривания, после чего материалы с высоким содержанием генистеина и высоким содержанием дайдзеина и материал с высоким содержанием глицетеина можно получить с помощью обычных методов выделения, таких как центрифугирование или фильтрование. Выделенный материал с высоким содержанием генистеина содержит по меньшей мере 40% генистеина, и предпочтительно, по меньшей мере 90% генистеина, вместе с остаточным растительным материалом, который является остаточным материалом сои, если генистеин выделяют из соевой сыворотки.

Выделенный материал с высоким содержанием дайдзеина содержит по меньшей мере 40% дайдзеина вместе с остаточным растительным материалом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Данное изобретение иллюстрируется более детально следующими примерами с использованием соевого материала в качестве растительного материала. Примеры предназначены для иллюстрации и не должны интерпретироваться как лимитирование или ограничение объема изобретения каким-либо образом.

Как отмечено выше, соевый материал включает "семейства" изофлавонов генистеина, дайдзеина и глицитеина, имеющие соответствующих представителей гликозидов, конъюгатов и агликонов, причем семейство генистеина содержит конъюгаты 6" - OMal - генистин и 6"" - OAc - генистин, гликозид генистин и агликон генистеин, семейство дайдзеина содержит конъюгаты 6"" - OMal - дайдзин и 6"" - OAc - дайдзин, гликозид дайдзин и агликон дайдзеин; и семейство глицитеина содержит конъюгат 6""- OMal-глицитин, гликозид глицитин и агликон глицитеин. В следующих таблицах относительные концентрации изофлавонов определяются количественно в виде процента от всего семейства изофлавонов. Например, в семействе изофлавонов: % генистина + % 6"" - OMal-генистина +% 6"" - OAc-генистина +% генистеина = 100%. Степень превращения конъюгатов в гликозиды и гликозидов в агликоны может определяться сравнением процента каждого типа соединения в изофлавоновом семействе.

Пример 1

В первом эксперименте исследовано превращение изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды в экстракте сои. Степень превращения определяется количественным снижением процента малонатных и ацетатных эфиров изофлавонового семейства в сочетании с соответствующим количественным повышением процента гликозида того же самого изофлавонового семейства.

Экстракт сои приготовлен путем превращения в густую суспензию 400 г тонко растертых обезжиренных соевых хлопьев с помощью 4000 г воды. Показатель pH доводится до 9,7 гидроксидом натрия, и смесь нагревают до 38^oC в течение 15 минут при перемешивании. Густую взвесь затем центрифугируют и экстракт собирают в виде супернатанта.

Превращение изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды исследовано при условиях различных pH и разных температур. У 600 г образцов экстракта pH доводили до 6, 7, 9 и 11 с помощью хлористоводородной кислоты или гидроксида натрия. Для каждого pH отбирают образец в 600 г, и эти образцы инкубируют при 45^oC и 72,5^oC в течение 24 часов. Проводили периодический анализ каждого образца в сроки через 0, 2, 4, 6 и 24 часа для определения содержания изофлавонов в образцах. В таблице 1 показано изменение и распределение изофлавонов в течение эксперимента.

Как показано снижением относительных концентраций соединений изофлавоновых конъюгатов 6"" - OMAl и 6"" - OAc и соответствующим повышением концентраций гликозидов генистина, дайдзина и глицитина, первая стадия превращения происходит наиболее быстро и полно при более высоких, более основных условиях pH и более высоких температурах. По существу полное превращение изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды происходит в образцах при pH 9 и 11 как при 45^oC, так и при 72,5^oC, однако дайдзин и глицетин разрушались в образце при pH 11 и 72,5^oC. Превращение происходит почти до завершения в образцах при pH 6 и 7 при 72,5^oC. Существенное превращение изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны остаточным ферментом в экстракте происходит в образцах при pH 6 и 7 при 45^oC, хотя превращение изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые гликозиды не особенно эффективно в этих условиях.

Пример 2

Во втором эксперименте исследовано превращение изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые агликоны. Степень превращения определяется количественным снижением процента гликозида изофлавонового семейства в соединении с соответствующим количественным повышением процента агликона того же самого изофлавонового семейства.

Обогащенный изофлавоновым гликозидом экстракт получают из соевых хлопьев путем доведения pH соевого экстракта до примерно 11 при температуре примерно 35^oC в течение примерно 1 часа. В первых образцах превращения изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые акликоны осуществляется с использованием остаточного фермента, присутствующего в обогащенном изофлавоновыми гликозидами экстракте, путем доведения pH образцов до pH 7,0 и pH 9,0 и выдерживания образцов при 45^oС в течение 24 часов. Превращение изофлавоновых гликозидов в изофлавоновые акликоны осуществляется с использованием дополнительных ферментов путем введения в образцы обогащенного изофлавоновыми гликозидами экстракта дозы следующих коммерчески доступных ферментов: биолактазы 30000, искомой нейтральной лактазы (Quest Neutral Lactase), лактазы 50000, биопектиназы 1001 и альфа - Gal 600. Количество фермента, добавленного к каждому образцу, показано в таблице 2. У каждого образца pH доводится до такого показателя pH, при котором активен дополнительный фермент, или 4,0, или 4,5, или 7,0. Образцы инкубируют при температурах, меняющихся в интервале от 35^oС до 75^oC. Образцы отбирают через выбранные сроки и определяют в них содержание изофлавонов.

Как показано преобразованием генистина, дайдзина, и глицитина в генистеин, дайдзеин и глицитеин, соответственно, достигается практически полное преобразование изофлавоновых гликозидов в изофла-воновые агликоны. Выбранные дополнительные ферменты заметно повышают скорость превращения по сравнению с превращением остаточным в экстракте ферментом, производя по существу полное превращение в течение 1 часа при эффективных концентрации, температуре и pH.

Пример 3.

В другом эксперименте обогащенный изофлавоновым агликоном белковый материал выделяют из обогащенного изофлавоновым агликоном экстракта и обычный белковый материал выделяют из обычного экстракта. Содержание изофлавонов в выделенных из каждого экстракта белковых материалах определяется при выделении при pH 4,0, 4,5 и 5,0.

Обогащенный изофлавоновыми агликонами экстракт сои готовят путем: 1) экстрагирования обезжиренных соевых хлопьев водным щелочным раствором; 2) доведения pH экстракта до 11 и выдерживания экстракта при 35^oC в течение 1 часа для получения обогащенного изофлавоновыми гликозидами экстракта и 3) добавления 0,1% (от веса твердых веществ в обогащенном изофлавоновыми гликозидами экстракте) лактазы 50000 (Amano International Enzyme Co.) в экстракт, который затем обрабатывают при 50^oC и pH 4,5 в течение 1 часа, чтобы получить обогащенный изофлавоновым агликоном экстракт. Также готовят обычный соевый экстракт путем экстрагирования обезжиренных соевых хлопьев водным щелочным раствором.

Из каждого экстракта получают образец, содержащий 10 г твердых веществ, и pH каждого из образцов экстракта доводят до pH 4,5. Белковый материал выделяют из каждого образца путем центрифугирования и декантирования супернатантной сыворотки с белкового материала. Затем определяют содержание изофлавонов в выделенном из каждого образца белковом материале. В таблице 3 показано общее содержание изофлавонов в миллиграммах на образец и процент каждого типа изофлавона из изофлавонового семейства, присутствующего в белковом материале из каждого из образцов.

Сравнивая содержание изофлавонов в белковом материала из обогащенного изофлавоновыми агликонами экстракта и в белковом материале из обычного экстракта, можно видеть, что белковый материал из обогащенного изофлавоновыми агликонами экстракта содержит значительно более высокие количества изофлавоновых агликонов, особенно генистеина и дайдзеина, чем белковый материал из обычного экстракта. Белковый материал из обычного экстракта содержит существенные количества изофлавоновых конъюгатов, которые отсутствуют в обогащенном изофлавоновыми агликонами белковом материале благодаря превращению изофлавоновых конъюгатов в изофлавоновые агликоны в обогащенном изофлавоновыми агликонами экстракте.

В вышеприведенных примерах все проценты, указанные для 6""-OMal-генистина, 6""-OAc-генистина, 6""-OMal-дайдзина, 6""-OAc- дайдзина, глицитина, 6""-OMal-глицитина и глицитеина, являются рассчетными значениями. Указанные проценты или концентрация фермента рассчитаны на граммы коммерческого препарата фермента на 100 г твердого вещества в каждом образце. Нижеследующее является описанием метода количественного определения изофлавонов в соевых продуктах. Изофлавоны экстрагируются из соевых продуктов путем смешивания 0,75 г образца (высушенного распылением или тонко измельченного порошка) с 50 мл растворителя из метанола/воды 80/20. Смесь взбалтывается в течение 2 часов при комнатной температуре с помощью орбитального вибратора. Через 2 часа оставшийся нерастворенным материал удаляют фильтрованием через фильтровальную бумагу Ватман N 42. 5 мл фильтрата разводят 4 мл воды и 1 мл метанола.

Экстрагированные изофлавоны выделяют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), используя колонку с обращенной фазой Hewlett Packard С 18 Hypersil. Изофлавоны наносят на колонку и элюируют градиентом растворителя, начиная с 88% метанола, 10% воды и 2% ледяной уксусной кислоты и заканчивая 98% метанола и 2% ледяной уксусной кислоты. При скорости потока, равной 0,4 мл/мин, все изофлавоны - генистин, 6""-O- ацетилгенистин, 6""-O-малонилгенистин, генистеин, дайдзин, 6""-O-ацетилдайдзин, 6""-O-малонилдайдзин, дайдзеин, глицитин и его производные и глицетеин - четко разделяются. Идентификация пиков производилась с помощью ВЭЖХ - масс-спектрометра.

Количественное определение достигается с помощью использования чистых стандартов (генистина, генистеина, дайдзина и дайдзеина), закупленных у Indofine Chemical Company, Sommerville, NJ. Для каждого из вышеуказанных соединений рассчитывают коэффициенты чувствительности (интегрированная область / концентрация) и используют для количественной оценки неизвестных образцов. Для конъюгированных форм, для которых не существуют доступных чистых стандартов, принимается, что коэффициенты чувствительности являются такими же, что и у вещества с родственными молекулами, но они корректируются по разнице молекулярного веса. Этим методом получают количества каждого отдельного изофлавона. Для удобства может быть рассчитано общее количество генистеина, общее количество дайдзеина и общее количество глицитеина и можно представить агрегатный вес этих соединений, если все конъюгированные формы превращаются в их соответствующие неконъюгированные формы. Это общее количество может быть измерено непосредственно методом с использованием кислотного гидролиза для превращения конъюгированных форм.

Осуществления этого изобретения, на которые заявляются права на исключительную собственность или привилегию, определяются нижеследующим.