способ диагностики иерсиниозов

Формула изобретения

Способ диагностики иерсиниозов, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки, отличающийся тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, в забуференном физиологическом растворе с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37^oC.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано в медицинской практике для иммуноферментной серодиагностики кишечного иерсиниоза, вызванного различными серовариантами Yersinia enterocolitica.

Известен способ диагностики иерсиниозов, в частности реактивного артрита у людей, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты липополисахаридным антигеном (ЛПС), выделенным из клеток Yersinia enterocolitica серотипа 0:3, последующую отмывку его от несвязавшегося антигена и выявление антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (коммерческая ИФА тест-система DAKO производство Дании) (1).

Недостатком данного способа является менее высокая чувствительность к выявлению иерсиниозов, вызванных серотипами 0:5, 0:7, 0:8. Кроме того для выполнения способа требуется очищенный антиген, на получение которого затрачивается значительное время, что усложняет его.

Известен также способ диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза у людей), включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты протеиновым антигеном, свободно секретируемым в культуральную среду патогенными иерсиниями, в частности Y. pseudotuberculosis 01, с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (2).

Недостатком данного способа является также менее высокая чувствительность и специфичность. Способ не позволяет с высокой достоверностью диагностировать иерсиниоз, вызванный Y. enterocolitica серотипа 0:9 ввиду общей антигенной детерминанты их ЛПС (4,6-дезокси-4-формамидо-L-D-маннопиранозила), присущей данному серотипу и различным видам бруцелл. Кроме того, способ более трудоемок в исполнении и на получение используемого антигена требуются значительные затраты времени и средств.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов, а также его упрощение. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты указанным антигеном осуществляют путем ее инкубации при 37^oC в течение 15 мин.

Для осуществления способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов используют инактивированный иерсиниозный антиген из референтного штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, выращенного на агаре Хоттингера.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучают влияние сенсибилизирующей дозы инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 на величину показателей Единиц ИФА (БД ИФА) гипериммунной сыворотки к Y. enterocolitica 0:3 при постановке твердофазного ИФА, осуществляемого в стандартном непрямом варианте. Для постановки ИФА используют разведения указанного антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР, pH 7,3) со следующими значениями оптической плотности, измеренной при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, (ОП₅₄₀): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о.е. мутности. Антиген вносят в микротитраторную полистироловую планшету по 100 мкл/лунку и осуществляют ее сенсибилизацию при инкубации в течение 60 мин при 37^oC. Планшету отмывают от неприсоединившегося антигена трижды холодной водопроводной водой и 1 раз ЗФР и тщательно стряхивают. Затем в лунки вносят гипериммунную кроличью антииерсиниозную (0:3), а в другие, в качестве контроля, отрицательную (от здорового кролика) сыворотки, взятые в разведении 1:25 600. Инкубацию с сыворотками проводят 1 час при комнатной температуре. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат в подобранном рабочем разведении. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывают. Тщательно стряхивают и добавляют по 100 мкл/лунку субстратной смеси ОФД (орто-фенилендиамин 10 мг, 40 мкл 3% перекиси водорода и 20 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5). Через 10 - 20 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку 0,5М серной кислоты (H₂SO₄). Учет реакции проводят на вертикальном фотометре MicroELISA Auto Reader MR 580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм (ОП₄₉₀), прибор бланкируют по воздуху. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывают по формуле:



где ОП_х - средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом;

ОП_о - средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой. За положительные принимают значения ОП₄₉₀ испытуемой сыворотки не менее, чем в 2 раза превышающие ОП₄₉₀ отрицательного контроля, выраженные в процентах плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (т.е. ЕД ИФА+2 ). В нашем исследовании этот показатель равен 244. Результаты представлены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что оптимальной сенсибилизирующей дозой антигена является суспензия клеток с ОП₅₄₀, равной 0,1 о.е. При этом разведении позитивная сыворотка дает достаточно высокие показатели ЕД ИФА, тогда как в последующих разведениях происходит их снижение.

Пример 2. Изучают влияние времени инкубации на адсорбцию корпускулярного инактивированного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в лунках полистироловых планшет с использованием оптимальной концентрации микробных клеток (ОП₅₄₀ 0,1 о.е в ЗФР с pH 7,3). Сенсибилизацию лунок проводят в течение 5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут при 37^oC.

После сенсибилизации в лунки вносят по 100 мкл гипериммунной кроличьей анти-0: 3 сыворотки а в другие, в качестве контроля, отрицательную сыворотку здоровых животных, взятых в одном разведении (1:12800). Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 является инкубация их при 37^oC в течение 15 минут. Сенсибилизация лунок в течение 5 и 10 минут несколько снижает чувствительность реакции по сравнению с 15-минутной инкубацией. Тогда как увеличение времени инкубации более 15 минут не приводит к сколько-нибудь значительному росту интенсивности окраски конечного продукта реакции и показателей ЕД ИФА.

Пример 3. Изучают влияние pH буферных растворов: фосфатный буфер (pH 5,8 и 8,2), карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9,8), ЗФР (pH 7,3), используемых для разведения инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, на показатели ОП₄₉₀ конечных продуктов реакции, выраженных в ЕД ИФА. Сенсибилизацию проводят в подобранных оптимальных условиях (ОП₅₄₀ 0,1 о.е., 15 мин при 37^oC). После сенсибилизации и отмывки в лунки вносят по 100 мкл положительной анти-иерсиниозной (0:3) сыворотки и отрицательной сыворотки здоровых животных, взятых в одном разведении (1: 25600) в буферном растворе с аналогичным значением pH. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что оптимальным значением pH комплексирующего буфера для разведения антигена при сенсибилизации полистироловых планшет является значение 7,3. При использовании буфера с pH 6,1 в лунках с отрицательной сывороткой наблюдается значительное окрашивание (фон), т.е. понижается специфичность реакции. При использовании буферов с pH 8,2 и 9,8 понижается чувствительность реакции, что выражается в некотором снижении ОП₄₉₀ положительной сыворотки. В обоих случаях происходит уменьшение величин ЕД ИФА.

Все дальнейшие испытания в предлагаемой диагностической системе проводят на планшетах, сенсибилизированных инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, с учетом подобранных оптимальных условий: концентрация антигена по ОП₅₄₀ 0,1 о.е. мутности в ЗФР с pH 7,3 в течение 15 мин при 37^oC.

Пример 4. Специфичность и чувствительность различных тест-систем оценивают путем сравнения ЕД ИФА гипериммунных кроличьих сывороток, полученных к различным серовариантам Y. enterocolitica 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9; коммерческих сывороток к бруцелле, сальмонеллам, шигеллам, E.coli; нормальных кроличьих и КРС сывороток. Гипериммунные антииерсиниозные сыворотки получают после 3-кратной иммунизации кроликов культурами иерсиний, инактивированными 50% раствором этилового спирта. Активность полученных сывороток контролируют в РА.

Полистироловые планшеты сенсибилизируют инактивированным корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в оптимальном отработанном режиме. Для сравнения используют планшеты, сенсибилизированные протеиновым антигеном, полученным из культуральной ростовой среды Y. enterocolitica 0:3 по способу, описанному в прототипе и планшеты из коммерческой тест-системы DAKO (Дания), сенсибилизированные ЛПС Y. enterocolitica 0: 3 (аналог). Исследуют сыворотки: гипериммунные кроличьи к иерсиниям различных серовариантов (0: 3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9), антииерсиниозные крупного рогатого скота (КРС) к 0:9 сероварианту, позитивные антибруцеллезные КРС (национальная бруцеллезная стандартная) и кроличьи и нормальные сыворотки кролика и КРС в разведении 1:400 в ЗФР+0,5% Твина 20 (ЗФРТ), вносимых на планшету в трех повторностях. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 4.

Как следует из табл. 4 предложенный способ является более чувствительным и специфичным, поскольку все исследованные гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные к различным серовариантам иерсиний, дают на корпускулярном иерсиниозном антигене из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 положительные результаты (ЕД ИФА>244); ЕД ИФА анти-бруцеллезных сывороток и антисывороток к другим энтеробактериям были отрицательными (<244).

1. Уменьшение трудоемкости исследования в результате использования в качестве антигена целых клеток культур - Y. enterocolitica 0:3, а не очищенных клеточных или внеклеточных субстанций.

2. Сокращение времени сенсибилизации полистирола антигенами.

3. Предлагаемая ИФА-тест-система обладает более широкой сероварспецифичностью при диагностике Y. enterocolitica по сравнению с аналогом и прототипом. Все проверенные в ней гипериммунные сыворотки, полученные к серовариантам 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8 и 0:9 дают на иерсиниозном антигене положительный результат, тогда как ни одна позитивная бруцеллезная, сальмонелезная, шигеллезная или эшерихиозная сыворотки не реагируют на нем положительно.