способ количественного определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов е в сыворотке (плазме) крови

Формула изобретения

Способ количественного определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов E в сыворотке (плазме) крови, включающий введение в исследуемую пробу сыворотки материала, содержащего тестируемый аллерген и определение в пробе содержания общего иммуноглобулина E, отличающийся тем, что перед определением в пробе содержания общего иммуноглобулина Е берут два образца исследуемой пробы, в один из которых вводят материал, содержащий тестируемый аллерген, во второй - материал без аллергена, а определение содержания общего иммуноглобулина Е в пробе проводят после удаления материала из образцов и о количестве аллерген-специфичных иммуноглобулинов E в пробе судят по разности содержания общего иммуноглобулина E во втором и первом образцах, причем в качестве материала используют целлюлозную подложку.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технике лабораторных исследований, в частности к способам проведения иммунологического анализа, и может быть использовано в клинической иммунологии для определения концентрации аллергенспецифичных иммуноглобулинов E в сыворотке (плазме) крови, благодаря чему диагностируют аллергические заболевания.

Известен способ полуколичественного иммуноферментного определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов E (см. патент США N 4774177, к.л. G 01 N 33/53, опубл. 1988 г.), согласно которому получают образцы сыворотки крови, вводят в исследуемую пробу нитроцеллюлозную подложку (бумажный диск), к поверхности которого прикреплен тестируемый аллерген, промывают диск моющим раствором и инкубируют его с антисывороткой против человеческих иммуноглобулинов E, конъюгированной с пероксидазой хрена, вновь промывают диск буферным раствором, производят окрашивание иммунохимического комплекса хромогеном и с помощью спектрофотометрического метода устанавливают качественную концентрацию аллергенспецифичных иммуноглобулинов E в крови путем отнесения этой концентрации к одному из пяти классов концентраций (от сверхвысокой до низкой).

Недостатком указанного известного способа является невозможность установления с помощью него истинного количества аллергенспецифичных иммуноглобулинов E, а значит - и недостаточная точность определения.

Еще одним недостатком являются высокие материальные затраты на осуществление этого способа, т.к. требуются импортные реактивы и бумажные диски, стоимость которых для одного определения составляет порядка 15,4 доллара.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности является способ количественного определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов E (lg Е) в сыворотке (плазме) крови, согласно которому в исследуемой сыворотке определяют исходную концентрацию общего lgE, вводят в пробу раствор тестируемого аллергена, далее определяют в этой же пробе количество оставшегося lgE (т.е. несвязанного с тестируемым аллергеном) и по разности исходного и оставшегося (после введения аллергена в пробу) общего lgE устанавливают количество аллергенспецифичных lgE (см. Л.А. Дуева, Ю.Л. Мизерницкий. Сенсибилизация к промышленным химическим аллергенам при бронхиальной астме у детей в условиях загрязнения окружающей среды. Журнал "Медицина труда и промышленная экология", N 2, 1997 г., с. 41-44).

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная точность и достоверность, т.к. содержащийся в пробе lgE, связанный с тестируемым аллергеном, может образовывать "сэндвич-комплекс" с анти-IgE (известно, что аллерген и идентичные к нему моноклональные антитела могут быть специфичными к разным участкам молекулы lgЕ), что делает результаты определения недостоверными и неточными.

Целью настоящего изобретения является повышение точности и достоверности определения аллергенспецифичных иммуноглобулинов E в сыворотке (плазме) крови.

Дополнительной целью является снижение материальных затрат.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе количественного определения аллергенспецифичных lgE в сыворотке (плазме) крови, включающем введение в исследуемую пробу сыворотки материала, содержащего тестируемый аллерген, определение в пробе содержания общего иммуноглобулина E, новым является то, что перед определением в пробе содержания общего иммуноглобулина E берут два образца исследуемой пробы, в один из которых вводят материал, содержащий тестируемый аллерген, во-второй - материал без аллергена, а определение содержания общего иммуноглобулина E в пробе проводят после удаления материала из образцов, и о количестве аллергенспецифичных иммуноглобулинов E в пробе судят по разности содержания общего иммуноглобулина E во втором и первом образцах, причем в качестве материала используют целлюлозную подложку.

Из научной и патентной литературы нам не известны способы определения аллергенспецифичных lgE с использованием указанной выше совокупности признаков, что позволяет сделать вывод о "новизне" предлагаемого технического решения.

Благодаря тому, что при осуществлении заявляемого способа берут два образца исследуемой пробы и в один из них помещают материал (целлюлозную подложку), содержащий тестируемый аллерген, а в другую (контрольную) пробу помещают материал, не содержащий тестируемый аллерген, обеспечиваются равнозначные условия в обоих дублированных образцах пробы по отношению к целлюлозной подложке.

А благодаря тому, что указанные материалы в дальнейшем удаляются из проб, обеспечивается извлечение из последних связанных аллергенспецифичных lgE, которые в дальнейшем не будут оказывать мешающего влияния на установление концентрации оставшегося общего lgE, а значит будут обеспечены высокая точность и достоверность способа.

Благодаря тому, что в качестве материала, содержащего тестируемый аллерген, используют целлюлозную подложку, например бумажный диск с прикрепленным к ней тестируемым аллергеном, обеспечивается простота способа, а также оригинальность подхода к устранению мешающего влияния аллергенспецифичных lgE (путем удаления из пробы этого материала вместе со связанными lgЕ), что обеспечивает повышение точности определения.

Для реализации предлагаемого способа в лабораторных условиях осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:

- производят забор крови у пациента;

- получают из нее образцы сыворотки или плазмы;

- берут два образца исследуемой пробы сыворотки (опытный образец и контрольный);

- в опытный образец вводят материал - целлюлозную подложку (например, бумажный диск) с прикрепленным к нему тестируемым аллергеном (например, формальдегидом, фталиевым ангидридом и т.п.), причем такой диск готовят путем его инкубирования при постоянном перемешивании в растворе тестируемого аллергена и последующего его промывания в фосфатном буфере, при этом концентрация раствора аллергена должна не превышать концентрацию, оказывающую повреждающее действие на структуру волокон целлюлозной подложки;

- а в контрольный образец сыворотки вводят целлюлозную подложку, не содержащую тестируемый аллерген;

- выдерживают подложки в образцах пробы не менее 90 мин;

- далее удаляют их из образцов;

- затем определяют в обоих образцах содержание общего lgE методом иммуноферментного анализа;

- и устанавливают разницу в содержании общего lgE в контрольном и опытном образцах, по которой судят о количестве аллергенспецифичных lgE в пробе крови.

Пример конкретного осуществления предлагаемого способа.

В процессе испытаний была исследована кровь у 12 пациентов. После отбора крови из вены стандартным методом центрифугирования была получена сыворотка, которая в последующем подверглась исследованиям.

Для этого в лунки стандартной планшеты для иммуноферментного анализа вносили дублированные образцы (опытный и контрольный) исследуемой пробы сыворотки в количестве 50 мкл. Затем в опытный образец вносили бумажный диск с иммобилизованным на нем тестируемым аллергеном, а в контрольный образец - чистый бумажный диск без аллергена. При этом бумажный диск с иммобилизованным на нем тестируемым аллергеном готовили следующим образом.

Специальным перфоратором нарезали диски 4 диаметром 5,5 мм из фильтра обеззоленного "белая лента" (ТУ 6-09-1678-86), затем их помещали в раствор 0,25%-ной концентрации тестируемого аллергена-формальдегида. Причем было установлено, что именно такая концентрация является щадящей, т.е. не оказывающей повреждающего действия на волокна диска. Диски инкубировали в этом растворе 120 мин при постоянном перемешивании, в результате чего получили бумажные диски с прикрепленным к нему тестируемым аллергеном в максимальном сорбционном количестве. После трехкратной промывки дисков фосфатным буфером (0,02 М раствором KH₂PO₄ и Na₂HPO₄) для удаления с его поверхности не связавшегося аллергена, эти диски и помещали в опытные образцы исследуемых проб сыворотки, а "чистые" диски (без аллергена) помещали в контрольные образцы исследуемых проб. Диски выдерживали в образцах 90 мин. В течение этого времени сыворотка в опытных образцах инкубировалась с тестируемым аллергеном, и аллергенспецифичные lgE оказались связанными с аллергеном, иммобилизованным на бумажном диске.

По завершении экспозиции диски извлекали из обоих образцов. Таким образом, опытный образец освободили от аллергенспецифичных lgE. Затем во всех оставшихся образцах сыворотки (опытных и контрольных) одновременно проводили определение содержания общего lgE известным методом иммуноферментного анализа с применением набора реагентов для определения общего lgE (см. "Инструкцию по применению набора реагентов lgE - ИФА-БЕСТ-стрип" А 8610, ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск, Россия). И по разности в содержании общего lgE в контрольном и опытном образцах определяли количество аллергенспецифичных lgE в сыворотке (плазме) крови пациента.

Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.

В этой же таблице для сравнения приведены данные, полученные при осуществлении известного по аналогу (с использованием диска Ultra lrgen Disc компании Cypress Diagnostics-Бельгия) и по прототипу (по методике Л.А.Дуевой и др.) способов.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что результаты определения содержания аллергенспецифичных lgE к формальдегиду предлагаемым способом идентичны диапазону концентраций, выявленных аналогичным известным способом (Cypress Diagnostics-Бельгия) полуколичественного определения аллергенспецифичных lgЕ.

Данные таблицы также наглядно демонстрируют большую точность и информативность определения специфичного lgE предлагаемым способом в отличие от способов по аналогу и прототипу.

В отличие от предлагаемого способа, недостаток способа по прототипу - большой процент инверсий (т.е. отрицательных значений аллергенспецифичного lgE), что не соответствует реальной заболеваемости пациента, а существенный недостаток способа по аналогу - преимущественно качественная (а не количественная) характеристика степени аллергии. Проведение анализа предлагаемым способом позволяет избежать неточностей, присущих известным способам.

Кроме того, преимуществом предлагаемого способа является возможность диагностики аллергии, вызываемой не только облигатными аллергенами, но и гаптенами (низкомолекулярными веществами), приобретающими свойства полноценных аллергенов после конъюгации (сцепления) с белками организма.

Таким образом, благодаря более высокой точности и достоверности, а также низкой стоимости определения аллергенспецифичного lgE предлагаемый способ имеет существенные преимущества перед известными способами и может найти широкое применение в лабораторной практике.