способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов

Формула изобретения

Способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов, путем окрашивания тканей альциановым синим, отличающийся тем, что стандартные гистологические срезы помещают на 30 мин в 0,35% раствор альцианового синего с pH от 1,0 до 4,0 затем добавляют в качестве электролитов растворы 0,9% NaCl и 0,1 - 1,0 M MgCl₂, проводят ферментативный контроль, метилирование и денситометрический анализ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и может быть использовано для гистохимических исследований гликозаминогликанов (ГАГ) тканей.

В настоящее время для выявления ГАГ в тканях используют биохимические, гистохимические и электронно-гистохимические методы. Биохимические методы очень трудоемкие, сложные и дорогие, хотя и позволяют получить качественные и количественные результаты и выделить ГАГ в "чистом" виде, но не позволяют проследить взаимосвязь ГАГ с клеточными структурами и другими неклеточными компонентами (Слуцкий Л. И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л. : Медицина, 1969. - 376 с.). Известные гистохимические методы (Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980, с. 136-137.) определения ГАГ в тканях позволяют выявить их все, т.е. суммарно, но не позволяют разделить на классы и определить процентное соотношение разных классов ГАГ (гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепарин, гепаран-сульфат, кератан-сульфат) в ткани. Электронно-гистохимические методы (Гайер И. Электронная гистохимия. М. : Мир, 1974, с. 52-71) исследования ГАГ очень сложные, трудоемкие и дорогие, хотя они и позволяют не только выявить ГАГ, но изучить их расположение в цитоплазме клеток и межклеточном матриксе. Этот метод не позволяют дифференцировать ГАГ по классам.

Актуальной задачей исследователей остается разработка простого и широкодоступного способа подготовки тканей для выявления ГАГ, дифференцировки по классам, определения их процентного содержания, соотношения между собой и особенности локализации в межклеточном веществе тканей.

Прототипом изобретения является способ выявления ГАГ при окрашивании тканей альциановым синим (Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980, с. 135-138. ). Этот способ позволяет определить присутствие сульфатированных и несульфатированных ГАГ в тканях, для этого используют 1%-ный раствор альцианового синего при pH 1,0 и pH 2,5.

Однако применение этого способа не позволяет отдифференцировать ГАГ по классам, отсутствует возможность получения процентного содержания ГАГ в тканях, не позволяет получить процентное соотношение разных классов ГАГ в тканях между собой и проследить особенности локализации разных классов ГАГ в ткани.

Целью изобретения является выявление и дифференцировка ГАГ по классам в тканях, определения их процентного содержания и соотношения между собой, выявления особенностей локализации разных классов ГАГ в ткани мозга, что позволяет упростить существующие методы, снизить себестоимость и повысить эффективность результатов.

Данная цель достигается способом подготовки тканей для определения ГАГ на денситометре путем окрашивания их, отличающийся тем, что стандартные гистологические срезы помещают на 30 минут в 0,35%-ный раствор альцианового синего с pH от 1,0 до 4,0 (с добавлением 0,9% NaCl в качестве электролита) и MgCl₂ с молярностью от 0,1 до 1,0 с ферментативным контролем и метилированием.

Способ подготовки ткани мозга для определения ГАГ и дифференцировки их по классам (гиалуроновая кислота, хондроитин, хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, гепарин, гепаран-сульфат, кератан-сульфат) осуществляется следующим образом.

Ткань мозга забирается через 15-20 минут после смерти и помещается в замораживающий криостат, на котором получают стандартные срезы (в большом количестве), толщиной 10 мкм и переносят их на предметные стекла.

Затем 1-ю серию срезов окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 и 4,0 (pH растворов до требуемых доводилась HCl, концентрация которых составляла - от 3,65% до 0,91% HCl) в течение 30 минут (все растворы красителя содержат также 0,9% NaCl в качестве электролита) при температуре 18-23^oC.

После этого 2-ю серию срезов помещают в 0,35%-ный раствор альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0, но с добавлением MgCl₂, имеющим молярности от 0,1 до 1,0 MgCl₂ (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 MgCl₂ в каждом растворе с разными pH) на 30 минут при температуре 18-23^oC.

Затем 3-я серия срезов обрабатывается тестикулярной гиалуронидазой (другую часть срезов - обрабатывают бактериальной гиалуронидазой). Срезы обрабатываются в растворе, состоящем из 0,6 мг/мл тестикулярной гиалуронидазы в 0,1 н. фосфатном буфере (pH 6,0), в течение 4-6 часов при температуре 37^oC. (Ферменты разводят на физиологическом растворе. Для этого в 100 мл дистилированной воды растворяют 0,85 г хлористого натрия, а затем добавляют 30 мл ферментного препарата с учетом того, что для гиалуронидазы оптимальная концентрация NaCl лежит между 0,07 - 0,17 М).

Далее 4-я часть срезов инкубируется в течение 6 - 15 часов при температуре 37^oC, в растворе, содержащим 15 ед. бактериальной гиалуронидазы в 1 мл 0,3%-ного раствора хлористого натрия.

Затем эти срезы окрашивают в течение 1,5 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0 с MgCl₂ (во всех красителях), имеющим молярности - 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 MgCl₂ при температуре 18-23^oC (В этих сериях - срезы ткани мозга окрашиваются при разных pH и молярностях MgCl₂ - см. указанные выше).

Пятая часть срезов мозга переносится в метиловый спирт для метилирования (Луппа Х. , 1980, с. 185-187.). Срезы мозга помещают на 4 часа при 60^oC в метиловый спирт, содержащий 0,1 г-экв соляной кислоты (1 мл соляной кислоты с уд. весом 1,19 в 99 мл метанола). Затем срезы переносят в 70%-ный этанол на 10-20 минут при температуре 18-23^oC, после чего помещают в воду на 1-5 минут при той же температуре.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH от 1,0 до 4,0 с MgCl₂ (во всех красителях), имеющим молярности - 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 (В этой серии - срезы ткани мозга также окрашиваются при разных pH и молярностях MgCl₂ - см. указанные выше).

Шестая часть срезов мозга обрабатывается пепсином и трипсином для удаления белков. Инкубацию гистологических срезов мозга осуществляют в 0,5%-ном растворе пепсина в 0,1 н. HCl (раствор имеет pH 1,2) в течение 5-30 минут при температуре 37^oC. Другую серию срезов помещают в 0,3%-ный раствор трипсина в воде при pH 8,0 в течение 1-23 часов при температуре 37^oC. Затем все гистологические срезы промывают водой в течение 5-30 минут при температуре 18-23^oC, после этого их окрашивают в течение 30 минут в 0,35%-ном растворе альцианового синего при разных его pH и разных молярностях MgCl₂ (см. выше).

В седьмой серии - срезы мозга инкубировали с пепсином и трипсином (см. выше), промывали водой, потом обрабатывали тестикулярной гиалуронидазой (см. выше) и окрашивали в течение 1 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при разных pH и разных молярностях MgCl₂ (см. выше).

Все окрашенные срезы мозга промывают в воде - 5 минут, обезвоживают по стандартной методике в ряду спиртов возрастающей концентрации, помещают в ксилол и заливают в бальзам.

Затем проводят денситометрические исследования всех окрашенных срезов, которые анализируются на анализаторе фореграмм - АФ-1. Анализ осуществляется следующим образом. Серия резов размещается по одной линии на сканирующем столике между лучом проходящего света и анализатора. На экране монитора результат сканирования гистологических срезов мозга представлен графически с указанием процентного содержания и соотношения исследуемого вещества.

Пример. Ткань мозга забирается через 15 минут после смерти и помещается в криостат, на котором получают стандартные срезы (в большом количестве), толщиной 10 мкм и переносят их на предметные стекла.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 (концентрация раствора HCl - 3,65%) в течение 30 минут (раствор красителя содержат также 0,9% NaCl в качестве электролита) при температуре 18^oC.

После этого другая часть срезов помещается в 0,35%-ный раствор альцианового синего при pH 1,0, но с добавлением MgCl₂, имеющим молярность - 0,1 М MgCl₂ на 30 минут при температуре 18^oC.

Затем часть срезов обрабатывается тестикулярной гиалуронидазой (другую часть срезов - обрабатывают бактериальной гиалуронидазой). Срезы обрабатываются в растворе, состоящем из 0,6 мг/мл тестикулярной гиалуронидазы в 0,1 н. фосфатном буфере (pH 6,0), в течение 4 часов при температуре 37^oC. (Ферменты разводят на физиологическом растворе. Для этого в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,85 г хлористого натрия, а затем добавляют 30 мл ферментного препарата).

Другая часть срезов инкубируется в течение 6 часов при температуре 37^oC, в растворе, содержащем 15 ед. бактериальной гиалуронидазы в 1 мл 0,3%-ного раствора хлористого натрия.

Затем срезы окрашивают в течение 1,5 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂ при температуре 18^oC.

Другая часть срезов мозга переносится в метиловый спирт для метилирования. Срезы мозга помещают на 4 часа при 60^oC в метиловый спирт, содержащий 0,1 г-экв соляной кислоты (1 мл соляной кислоты с уд. весом 1,19 в 99 мл метанола). Затем срезы переносят в 70%-ный этанол на 20 минут при температуре 18^oC, после чего помещают в воду на 5 минут при той же температуре.

Затем срезы окрашивают в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

Следующая часть срезов мозга обрабатывается пепсином и трипсином для удаления белков. Инкубацию гистологических срезов мозга осуществляют в 0,5%-ном растворе пепсина в 0,1 н. HCl (раствор имеет pH 1,2) в течение 30 минут при температуре 37^oC. Другую серию срезов помещают в 0,3%-ный раствор трипсина в воде при pH 8,0 на 1 час при температуре 37^oC. Затем все гистологические срезы промывают водой в течение 30 минут при температуре 18^oC, после этого их окрашивают в течение 30 минут в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

В следующей серии - срезы мозга инкубировали с пепсином и трипсином (см. выше), промывали водой, потом обрабатывали тестикулярной гиалуронидазой (см. выше) и окрашивали в течение 1 часа в 0,35%-ном растворе альцианового синего при pH 1,0 с 0,1 М MgCl₂.

Все окрашенные срезы мозга промывают в воде - 5 минут, обезвоживают по стандартной методике в ряду спиртов возрастающей концентрации, помещают в ксилол и заливают в бальзам.

Затем проводят денситометрические исследования всех окрашенных срезов, которые анализируются на анализаторе фореграмм - АФ-1.

Первоначально проводят дифференцировку сульфатированных и не сульфатированных ГАГ, при этом выявляют интенсивное голубое окрашивание межклеточного матрикса при pH 1,0 - 4,0, которое исчезает при pH 2,5 - 4,0 - после обработки бактериальной и тестикулярной гиалуронидазой.

Таким образом, можно предположить наличие в ткани гиалуроновой кислоты, хондроитин-4-сульфата и хондроитин-6-сульфата.

При pH 1,0 наблюдается умеренное окрашивание в голубой цвет межклеточного матрикса. После обработки трипсином интенсивность окраски увеличивается, что свидетельствует о возможном присутствии сульфатированных ГАГ (гепаран-сульфат, гепарин, кератан-сульфат).

Затем проводят дифференцировку ГАГ между гиалуроновой кислотой и хондроитин-сульфатами. Срезы перед окрашиванием обрабатываются метанолом, связывающим сульфатные группы.

Было показано, что основное вещество содержит ГК, т. к. оно окрашивается в голубой цвет после обработки метанолом. В волокнистых структурах голубое окрашивание исчезало, что позволяет отметить в них содержание хондроитин-сульфатов.

Далее проводят дифференцировку сульфатированных ГАГ. Голубое окрашивание волокнистых структур обнаруживается только после предварительной обработки препаратов трипсином при окраске их альциановым синим при 0,2 М и 0,4 М раствора MgCl₂ и постепенно нарастает в 0,8 М и 1,0 М растворе MgCl₂. На срезах межклеточное вещество ткани мозга при pH 0,2 М MgCl₂ слабо окрашивалось альциановым синим в голубой цвет по сравнению с 1,0 М MgCl₂.

После этого осуществляется дифференцировка сульфатированных ГАГ в ткани мозга, для чего препараты сначала обрабатываются пепсином, а затем тестикулярной гиалуронидазой, и окрашиваются альциановым синим. Голубое окрашивание в межклеточных структурах позволяет сделать вывод о присутствии в них сульфатированных ГАГ, устойчивых к действию гиалуронидазы. На экране денситометра наблюдается кривая с указанием процентного содержания исследуемого вещества - гиалуроновая кислота - 48,5%, хондроитин-4-сульфат - 17,7%, хондроитин-6-сульфат - 13,5%, гепарин и гепаран-сульфат - 20,3%. Полученные данные были подтверждены биохимическими и электрофоретическими исследованиями.

Альциановый синий 8 GS (8 GX) образует с полианионами сильноокрашенные нерастворимые в воде пигменты. Специфичность окрашивания альциановым синим можно контролировать. При этом играют роль три следующих фактора: условия окрашивания, предварительная химическая и ферментативная обработка. Так, при длительном окрашивании (4-12 часов) выявляются почти все компоненты ткани, тогда как при менее длительном (около 30 минут) удается более или менее специфично выявить ГАГ эпителиального и соединительно-тканного происхождения. Различия между сульфатированными и несульфатированными ГАГ наиболее надежно устанавливаются при определенных значениях pH раствора красителя и при добавлении электролитов. Использование раствора красителя с pH 1,0 позволяет выявить лишь кислые ГАГ с сульфатными и сульфоновыми группами, тогда как при pH 2,0 и более выявляются главным образом протеогликаны, содержащие группы уроновой кислоты. Протеогликаны, содержащие сульфатированные и карбоксильные группы, связывают альциановый синий при более низких концентрациях электролитов (концентрация MgCl₂ ниже 0,3 М), тогда как при концентрациях MgCl₂ 0,8 М и выше окрашиваются исключительно протеогликаны, содержащие SO₄-группы. И наконец, в присутствии электролитов (HCl, NaCl, KCl) окрашивание альциановым синим усиливается. Влияние электролитов на связывание альцианового синего свидетельствует в пользу ведущей роли электростатических сил при связывании альцианового синего с субстратом.

При метилировании срезов ткани в течение 6 часов полностью снимается ее базофилия. Базофилия цитоплазмы, обусловленная COOH-группами и РНК, снимается через 30 минут, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных ГАГ - через 4 часа.

Окрашивание, присутствующее в контрольных срезах и отсутствующее в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствует о наличии гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов.

Часто применяют два вида гиалуронидазы: тестикулярную и бактериальную. Бактериальная действует на гиалуроновую кислоту, тестикулярная обладает более широким спектром действия и расщепляет хондроитин-4,6-сульфаты (на дерматансульфаты, кератансульфаты и гепарин ни одна гиалуронидаза не действует). При длительном воздействии (24-48 часов) тестикулярная гиалуронидаза может вызывать также гидролиз муко- и гликопротеидов.

Переваривание гиалуронидазой может усиливать или вызывать предварительное окисление некоторых структур уксусной кислотой. Добавление NaCl усиливает активность фермента.

Предлагаемый способ подготовки ткани мозга для определения гликозаминогликанов не требует дорогого оборудования и реактивов, обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами: позволяет подготовить ткани таким образом, что по изменению ее окрашивания в межклеточном пространстве можно определить разные классы ГАГ и выявить их локализацию, определить их процентное содержание и соотношение разных классов ГАГ между собой.