способ оценки пороговой чувствительности бактериальных культур на биологические и химические препараты

Формула изобретения

Способ оценки чувствительности бактериальных культур на биологические и химические препараты, включающий подготовку бумажных индикаторов путем пропитывания их соответствующим препаратом различной концентрации, сушку, нанесение на поверхность агаровой исследуемой культуры микроорганизмов, инкубирование с последующей качественной и количественной оценкой результатов, отличающийся тем, что перед сушкой пропитанные препаратом различной концентрации индикаторы в форме полосок наносят в градиентной последовательности на лист бумаги, покрытый нейтральным клеящим составом, и разрезают лист на полоски перпендикулярно приклеенным, а при оценке результатов дополнительно определяют пороговую чувствительность бактериальных культур.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в идентификации, определении чувствительности бактериальных культур к различным биологическим и химическим препаратам.

Известен простой и удобный метод оценки реакции бактериальных культур с использованием бумажных дисков, пропитанных соответствующим препаратом. При нанесении дисков на поверхность агаровой культуры в определенных условиях происходит диффузия препарата в культуру на строго ограниченной площади и в зоне диска наблюдаются видимые изменения поверхности исследуемой культуры.

Установлены условия создания необходимой плотности среды для диффузии препарата, а также прибор для определения прочности агаровых диагностических сред (Amer. Biotechnol. Lab. - 1988. - 6, N 4. - с. 4b, 48 - 50; Ученые записки. Выпуск IV, Махачкала, 1964, МЗ СССР, С. 18 - 27).

Известны способы оценки чувствительности к антибиотикам стафилококков, стрептококков и других микроорганизмов с помощью бумажных дисков, пропитанных различными антибиотиками с определенным содержанием в соответствии с рекомендациями ВОЗ, серийно выпускающимися ПО "Моспрепараты им. Л.Я. Карпова. Диски наносят на агаровую культуру, инкубируют в термостате в течение 18 - 20 ч, после чего учитывают результаты по зоне задержки роста вокруг диска, при этом чувствительность оценивается при ширине зоны задержки роста 11 - 25 мм.

На одной чашке возможно оценить степень чувствительности культуры к различным видам антибиотиков по величине зоны задержки роста, что не дает возможность проведения точной количественной оценки (Методические рекомендации по определению чувствительности стрептококков к антибиотикам, М., 1985; Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков, М., 1983).

Известно использование индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных микробов (Методические рекомендации по применению модифицированной среды Пизу и индикаторных бумажных дисков для идентификации, биохимического типирования и определения токсигенности дифтерийных микробов. М., 1988).

Анализ токсигенности проводится на чашках Петри с дисками, пропитанными дифтерийным антитоксином, культура наносится "бляшками" вокруг дисков.

Недостатками этих методов является трудность количественного учета чувствительности реакции, а также недостаточная информационность оценки зоны активного действия препаратов.

Известно применение бумажных дисков, пропитанных фагами бактериальных культур кишечной группы, стафилококков, сибирской язвы (Matz K., Z. Hyg., 1964, B. 150, S. 103 - 107; Mora E.S., Eisensterk A.J. Lab. Clin. Med., 1958, V. 51, P. 802 - 804).

Наиболее близким к заявляемому способу является метод определения чувствительности микробов к антибиотикам (И.Г. Руфанов "Краткое руководство по антибиотикотерапии", М. "Медицина", 1964, С. 50 - 54), который включает пропитывание дисков фильтровальной бумаги антибиотиками различной концентрации, высушивание, нанесение на поверхность агаровой среды с исследуемой культурой микроорганизмов, инкубирование в термостате и последующую качественную и количественную оценку результатов.

Недостатком способа является более высокая трудоемкость за счет необходимости использования большого количества чашек и невозможность одновременной качественной, с различными препаратами, и количественной оценки чувствительности реакции.

Целью изобретения является обеспечение возможности одномоментной оценки пороговой чувствительности исследуемой культуры на одной чаше как в качественном отношении при варьировании различных препаратов, так и в количественном в зависимости от концентрации препарата за счет градиентного изменения зоны его активного действия.

Поставленная цель достигается тем, что готовятся бумажные индикаторы в форме полосок путем пропитывания их препаратами с различной концентрацией, пропитанные полоски наносятся на лист бумаги с градиентной последовательностью, покрытый нейтральным клеящим составом, затем разрезают лист на полоски перпендикулярно приклеенным, высушивают и наносят их на поверхность агаровой исследуемой культуры, инкубируют и оценивают пороговую чувствительность по измерению зоны активного действия препарата и количественно, в том числе и в зависимости от концентрации препарата.

Отличие заявляемого способа от прототипа, заключающееся в подготовке градиентных индикаторов, обеспечивает достижение поставленной цели и упрощает процесс исследования.

Заявляемый способ возможно использовать при исследовании реакций культуры на одной чашке на антибиотики, фаги, токсины, ингибиторы, иммуноглобулины, красители в качественном и количественном отношении путем определения их пороговой чувствительности, что значительно расширяет информационные результаты исследований, упрощает процесс и сокращает расход бактериальной массы и питательных сред за счет увеличения зоны активного действия препарата.

При манипуляции с дисками, как правило, используют 4-6 зон диска на одной чашке.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами его конкретного выполнения.

Пример 1. Готовили раствор ампициллина с концентрацией, эквивалентной коммерческому диску величины зоны задержки роста на газоне с культурой Staphylococcus aureus 04/28. Стерильные полоски фильтровальной бумаги шириной 5 мм и длиной 100 мм раздельно пропитываем растворами ампициллина с двукратно уменьшающейся концентрацией. Размещаем и фиксируем полоски в градиентной последовательности с интервалом 0,5 - 1,0 мм на тонком листе бумаги размером 100 х 100 мм, предварительно пропитанной 2,0% раствором желатины. Высушенный в стерильных условиях лист с фиксированными на нем полосками разрезаем перпендикулярно на градиентные полоски шириной 5 мм с отметкой начала градиента. На чашке с полноценной питательной средой в соответствии с общепринятой методикой готовим газон с культурой штамма Staphylococcus aureus. Приготовленную градиентную полоску размещали в одном из 6 секторов чашки Петри с убыванием концентрации ампициллина к центру. Посевы инкубируем при 37^oC в течение 20 - 24 ч. Учет производим по ширине максимальной зоны задержки роста и оцениваем пороговую чувствительность по началу градиента зоны задержки роста.

Начало градиента зоны задержки роста, т.е. пороговой чувствительности, исследованного штамма Staphylococcus aureus 04/28 соответствовало концентрации ампициллина на фрагменте градиентной полоски 61 мкг/мл и ширина максимальной зоны задержки роста составила 25 мм.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять пороговую чувствительность и уровень чувствительности культуры Staphylococcus aureus методом диффузии в агаре за счет градиентной концентрации препарата на полоске бумаги.

Пример 2. Стерильные полоски фильтровальной бумаги шириной 5 мм и длиной 100 мм раздельно пропитываем бруцеллезным диагностическим бактериофагом и его разведениями 10^-1; 10^-2; 10^-3. Размещаем и фиксируем полоски в градиентной последовательности с интервалом 0,5 - 1,0 мм на тонком листе бумаги размером 50 х 100 мм, предварительно пропитанной 2,0% раствором расплавленного крахмала. Подсушенный в стерильных условиях лист разрезаем перпендикулярно с фиксированными на нем полосками на градиентные полоски шириной 5 мм с отметкой начала градиента. На чашке с полноценной питательной средой в соответствии с общепринятой методикой определения чувствительности к фагу бруцелл готовим газон культуры штамма Brucella abortus 19. Приготовленную градиентную полоску размещаем с убыванием концентрации бруцеллезного бактериофага к центру в одном из 6 секторов чашки Петри. Посевы инкубируем при 37^oC в течение 36 ч. Учет проводим по ширине максимальной зоны лизиса и оцениваем пороговую чувствительность по началу градиента зоны лизиса культуры бруцелл.

Начало градиента зоны лизиса, т.е. пороговая чувствительность исследованного штамма B. abortus 19 отмечена у фрагмента градиентной полоски с разведением фага 10^-4 и наибольшей шириной зоны лизиса у фрагмента градиентной полоски с цельным бруцеллезным бактериофагом.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить пороговую чувствительность и уровни чувствительности к бруцеллезному бактериофагу культуры B. abortus 19 методом диффузии в агаре за счет градиентной концентрации фага на полоске бумаги.

Пример 3. Выполняется аналогично примеру 2 за исключением того, что при приготовлении градиентных полосок вместо бруцеллезного бактериофага используют растворы основного красителя тионина с градиентным уменьшением их концентрации в 2 раза до окончательного разведения 2^-6

Начало градиента зоны задержки роста, т.е. пороговая чувствительность штамма B. abortus 19, отмечена у фрагмента градиентной полоски, пропитанной раствором исходного разведения тионина, с уменьшением зоны роста у фрагмента, пропитанного раствором тионина в разведении 2^-6.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить пороговую и уровень чувствительности к краске у культуры бруцелл методом диффузии в агаре за счет градиентного нанесения краски.

Пример 4. Выполняется аналогично примеру 2 за исключением того, что при приготовлении градиентных полосок вместо бруцеллезного бактериофага используют дифтерийных анатоксин с градиентным уменьшением концентрации в 2 раза до окончательного разведения 2^-6, а в качестве культуры используют токсигенный дифтерийный штамм C. diphtheriae gravis 39.

Начало градиента зоны проявления токсигенных свойств, т.е. пороговые значения наличия токсина отмечено у фрагмента градиентной полоски, пропитанной анатоксином в разведении 2^-4 и наиболее интенсивным проявлением преципитационной полоски у фрагмента, пропитанного исходным разведением дифтерийного токсина.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить пороговые значения проявления токсигенных свойств и уровень токсинообразования у культуры дифтерийного штамма методом диффузии в агаре за счет градиентного нанесения антитоксина на полоски фильтровальной бумаги.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в микробиологии значительно повышает эффективность бактериологических исследований, в том числе и в полевых условиях.