способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот
| Классы МПК: | C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала |
| Автор(ы): | Куликова В.Ф., Иванова Е.М., Пышный Д.В., Лохов С.Г., Кривенко А.А., Дымшиц Г.М. |
| Патентообладатель(и): | Куликова Валентина Филипповна, Иванова Евгения Михайловна, Пышный Дмитрий Владимирович, Лохов Сергей Георгиевич, Кривенко Анжелика Анатольевна, Дымшиц Григорий Моисеевич |
| Приоритеты: |
подача заявки:
1996-04-11 публикация патента:
20.03.2000 |
Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики генетических заболеваний. Проводят гибридизацию короткого олигонуклеотидного зонда длиной 4-6 звеньев с фланкирующими олигонуклеотидными последовательностями или их производными, несущими полициклические ароматические группировки с комплементарной ему анализируемой последовательностью нуклеиновых кислот. Последовательность может содержать точечные мутации. Определяемая мутация должна находиться в сайте связывания зонда. Изобретение позволяет проводить высокоселективную диагностику заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2
Формула изобретения
1. Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот, включающий гибридизацию комплементарной анализируемой последовательности олигонуклеотидного зонда, несущего репортерную группу, отличающийся тем, что детекция любой последовательности осуществляется по факту лигирования короткого олигонуклеотида (длиной 4 - 6 звеньев) с фланкирующими олигонуклеотидными последовательностями или их производными, несущими полициклические ароматические группировки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявляют последовательности нуклеиновых кислот, включающие точечные мутации. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что при определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания.Описание изобретения к патенту
Область техникиИзобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая труднодиагностируемые точечные мутации, а также для выявления вирусных нуклеиновых кислот при диагностике вирусных заболеваний. Уровень техники
Наиболее близким к предлагаемому является способ выявления анализируемых последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих точечные мутации, с помощью комплементарного анализируемому участку ДНК олигонуклеотидного зонда, полученного легированием в комплементарном комплексе двух олигонуклеотидов (длиной 8 и 14 звеньев), один из которых несет 32P-метку. При наличии мутации в сайте комплементарного связывания олигонуклеотидов выход легированного в несовершенном комплексе олигонуклеотидного зонда уменьшается по сравнению со случаем образования правильного комплекса. Максимальный фактор дискриминации точечной мутации (3-5) наблюдается в том случае, когда несовершенный комплекс, образованный двумя олигонуклеотидами и ДНК, имеет один мисматч в точке легирования (Dan Y.Wu and R.Bruce Wallace. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNK ligase. Gene (1989) 245-254. Недостатком этого способа является низкая селективность легирования в случае образования неправильных комплексов при наличии точечной мутации в ДНК. Различие в количестве легированного продукта в случае "правильной" и "неправильной" ДНК (фактор дискриминации) составляет 3-5 раз. Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа высокоселективной (с высоким фактором) диагностики вирусных, генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая точечные мутации. Поставленная задача достигается тем, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид, длиной 4-6 звеньев, который легируют с двух сторон с соответствующими анализируемой последовательности комплементарными олигонуклеотидами или их производными, содержащими полициклические ароматические группировки. При определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания. Суть предлагаемого подхода состоит в том, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид (тетра-, пента-, гекса-), который легируется с двумя фланкирующими его с двух сторон короткими олигонуклеотидами (или их производными, несущими полициклические ароматические группировки) в случае образования полного правильного комплементарного комплекса с анализируемой последовательностью ДНК. Обычно в качестве олигонуклеотидных зондов как при выявлении чужеродных нуклеиновых кислот методом гибридизации, так и при определении точечных мутаций с использованием лигазы, используют протяженные олигонуклеотиды, образующие прочные комплементарные комплексы с анализируемыми последовательностями НК. Однако такие олигонуклеотиды способны образовывать достаточно прочные несовершенные комплексы с НК, что приводит к снижению селективности выявления анализируемых последовательностей НК. Короткие олигонуклеотиды, особенно тетрануклеотиды, в физиологических условиях обладают крайне низкими гибридизационными свойствами. В предлагаемом способе короткий олигонуклеотидный зонд (тетра- гекса- мер) фланкирован с двух сторон олигонуклеотидами или их производными, несущими стабилизирующий комплекс группами, что способствует образованию комплементарного комплекса олигонуклеотидного зонда с анализируемой последовательностью. Комплекс короткого олигонуклеотидного зонда (тетра- гекса- мера) стабилизируется кооперативными взаимодействиями между концевыми нуклеотидными остатками при образовании правильных тандемных комплексов. В случае наличия мутации в сайте связывания короткого олигонуклеотидного зонда стабильность его комплекса существенно снижается, что и является причиной высокой селективности данного подхода. Дополнительным фактором, способствующим повышению селективности легирования предложенных тандемов олигонуклеотидных зондов, является способность фермента узнавать неправильные комплементарные участки длиной в 2-3 нуклеотидных звена от точки легирования, как это было продемонстрировано в работе Kazuo Harada and Leslie E.Orgel "Unexpective substrate specificity of T4 DNA ligase revaled by in vitro selection. Nucleic Acids Research, 1993, 21, 2287-2291 при легировании модельных олигонуклеотидов, способных формировать шпилечные структуры. Способ экономичен, методически прост, работает в широком диапазоне температур и концентраций олигонуклеотидов. Фактор дискриминации последовательностей, содержащих мутации, превышает 100. Исследование проводили на нуклеиновых кислотах, являющихся продуктами симметричной амплификации ДНК (P0 - правильная мишень, P1-P4 - мишени, содержащие все двенадцать возможных точечных замен в центральной четырехнуклеотидной области) (см. схему в конце описания). pNn-олигонуклеотид или его производное, несущее полициклическую ароматическую группировку, (n
6). Варианты осуществления изобретенияПример 1. P0, концентрация от 10-8 до 10-5 M, последовательность тетрануклеотидного зонда и пары олигонуклеотидов (или их производных, несущих полициклические ароматические группировки) полностью комплементарна участку ДНК, концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 30- 40%. Пример 1а. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с парой производных олигонуклеотидов, несущих группировки на основе феназина. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 35-40%. Пример 2. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве короткого олигонуклеотидного зонда использовали гексануклеотид. Выход легированного продукта составлял 50-60%. Пример 3. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали додекануклеотид, который легировали с октануклеотидом (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе). Выход легированного продукта составлял 60-70%. Пример 4. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с одним октануклеотидом. Выход легированного продукта составлял 0%. Пример 5. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 M, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 6. P1 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 7. P1 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 8. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + гексануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5. Выход легированного продукта составлял 5-7%. Пример 9. P1 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P1 + додекануклеотид + октануклеотид (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе). Эксперименты проводили, как описано в примере 5 (X = A). Выход легированного продукта составлял 30-40%. Пример 10. P2 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 M. Зонд содержит 32P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 11. P2 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид III (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 12. P2 (X = G), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 13. P3 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 14. P3 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13. Выход легированного продукта, по данным электрофореза составлял 0%. Пример 15. P3 (X = G), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 16. P4 (X = A), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II. Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10-8 до 10-5 М. Зонд содержит 32P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 17. P4 (X = T), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Пример 18. P4 (X = C), концентрация от 10-8 до 10-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16. Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%. Эффективность метода выявления точечных мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот определяют по фактору дискриминации, который рассчитывают как отношение выхода легированного продукта в случае полной комплементации с последовательностью, не содержащей точечную мутацию, к выходу легированного продукта в случае последовательности, содержащей точечную мутацию. Чем выше фактор дискриминации, тем эффективнее метод выявления мутации, тем точнее определение последовательности НК. Как видно из приведенных в таблице данных, использование короткого тетрануклеотидного зонда дает наиболее высокий фактор дискриминации, во много раз превышающий фактор дискриминации, полученный в прототипе или в условиях, описанных в прототипе. Это обеспечивает надежность выявления заранее заданных последовательностей в нуклеиновых кислотах, в том числе содержащих точечные мутации.
Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Класс C07H21/04 с дезоксирибозилом в качестве сахаридного радикала
