терапевтическая комбинация, содержащая человеческий интерферон, фармацевтический препарат на основе интерферона (варианты)

Формула изобретения

1. Потенцированная комбинация, включающая человеческий - интерферон и глутатион, или его предшественник, или индуктор.

2. Комбинация по п.1, отличающаяся тем, что человеческий - интерферон является рекомбинантным.

3. Комбинация по п.1, отличающаяся тем, что человеческий - интерферон является природным.

4. Комбинация по п.3, отличающаяся тем, что природным человеческим - интерфероном является человеческий лимфобластоидный интерферон.

5. Комбинация по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что предшественником или индуктором глутатиона является N - ацетилцистеин.

6. Комбинация по любому из пп.1 - 5 для лечения заражения гепатитом.

7. Комбинация по п.6, отличающаяся тем, что гепатитом является гепатит A или гепатит C.

8. Фармацевтический препарат на основе интерферона, отличающийся тем, что содержит - интерферон и глутатион или его предшественник в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Фармацевтический препарат по п.8, отличающийся тем, что его применяют для лечения пациента, страдающего от гепатита.

10. Фармацевтический препарат включающий глутатион, или его предшественник, или его индуктор, отличающийся тем, что указанный препарат содержит эффективное количество интерферона и глутатион или его предшественник и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Фармацевтический препарат по любому из пп.8 - 10, отличающийся тем, что человеческий -интерферон является рекомбинантным.

12. Фармацевтический препарат по любому из пп.8 - 10, отличающийся тем, что человеческий -интерферон является природным.

13. Фармацевтический препарат по п.12, отличающийся тем, что природный человеческий -интерферон является человеческим лимфобластоидным интерфероном.

14. Фармацевтический препарат по любому из пп.8 - 13, отличающийся тем, что предшественником или индуктором глутатиона является N-ацетилцистеин.

15. Фармацевтический препарат по любому из пп.9 - 14, отличающийся тем, что гепатитом является гепатит B или гепатит C.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к терапевтической комбинации или, точнее, к комбинационной терапии, включающей использование человеческого интерферона.

Первая и локализованная реакция животного на заражение вирусом - продуцирование лимфокин-интерферона. Ранее полагали, что интерфероны - это одна молекула, сейчас же известно, что это большое семейство белков, прошедших значительный эволюционный путь и широко распространенных в животном мире. Хотя может иметь место некоторая ограниченная перекрестная реактивность, интерфероны обычно специфичны по видам. Первоначально были определены три типа интерферона, известные как лейкоцитарный, фибробластный и иммунный интерферон, которые теперь обозначены как интерфероны , и соответственно.

Человеческий интерферон - может продуцироваться многими разными типами клеток и хроматография HPL C (ЖХВР) разделяет этот тип интерферона на более чем 30 подтипов, каждый из которых кодируется своим геном. Что касается человеческого интерферона -, считают, что это одно вещество и продуцируется фибробластами. Человеческий интерферон - также представляет собой одно вещество, вырабатываемое субпопуляциями Т-лимфоцитов, стимулируемыми хелпером, под воздействием антигена или при воздействии митогенов на белые кровяные клетки, Т-лимфоциты или Т-лифобластоидные клетки.

Человеческий интерферон - в промышленных масштабах производится стимулированием человеческой лимфобластоидной клеточной линии Namalwa вирусом Сендай с получением природной смеси, по меньшей мере, 21 подтипа интерферона -, которые затем очищаются хроматографией до чистоты 95% и специфической активности около 10010⁶ IU/мг белка (IU - иммунизирующая единица). Такой продукт, определенный как человеческий интерферон - N₁, поступает в продажу под наименованием WELLFERON (Зарегистрированный товарный знак Wellcome Foundation Limited). Природный человеческий интерферон - получают из человеческих диплоидных фибробластов, обычно из ткани новорожденного, причем выработку индуцируют, например, добавлением синтетической РНК с двойной цепью. Человеческий интерферон - можно получить из светлого слоя кровяных сгустков с помощью митогена, такого, как энтеротоксин A стафилококка в качестве индуктора.

Человеческие интерфероны -, - и - можно также получить с использованием технологии рекомбинантной ДНК, хотя, если рекомбинантные интерфероны продуцируются экспрессией соответствующего гена в бактериальных клетках, они не могут иметь ту же самую третичную структуру, что и природные молекулы. Аналогично, интерфероны, продуцированные в бактериальных клетках, не будут гликозилироваться, и хотя это не влияет на биологическую активность молекулы при тестировании ин-витро, это может изменить конформацию и антигенность и повлиять на распределение в теле. Такой рекомбинантный человеческий интерферон обладает более чем 90% аминокислотной гомологией с природным человеческим интерфероном: предпочтительно, 95% гомологией, еще предпочтительнее 97, 98, 99% гомологией, и наиболее предпочтительно - 100% гомологией. Рекомбинантные человеческие интерфероны имеются в продаже, и примерами являются интерферон --2a (ROFERON - Roche) и интерферон --2a (INTRON - Schering). Эти молекулы различаются одним аминокислотным остатком в позиции 23 (лизин в ROFERONe и аргинин в INTRONe).

Человеческие интерфероны использовались в течение ряда лет при лечении гепатита. Первые опыты в середине 70-х годов использовали человеческий лейкоцитарный интерферон, полученный из клеток светлого слоя кровяных сгустков, оставшихся после получения плазмы из донорской крови, и это значительно ограничило полученное количество. В начале 1980-х годов прогресс в технологии производства привел к использованию как природного, так и рекомбинантного человеческого интерферона - при лечении хронического гепатита B. Хотя это лечение можно считать успешным во многих случаях, показатели ответной реакции на лечение одними только человеческими - интерферонами, если судить по устойчивой потере вирусных маркеров, - составляют, как правило, ниже 50%. Человеческие интерфероны - и - также исследовались на использование при хроническом гепатите B, но так и не утвердились в качестве терапевтического средства.

Все три типа человеческого интерферона также исследовались в лечении хронического гепатита C, хотя ограниченное наличие интерферона - сдерживало работу с этим типом интерферона. Очень обширные исследования проводились с применением - интерферонов, упомянутых выше (Интерферон--2a, интерферон--2b и лимфобластоидный интерферон) и результаты были обнадеживающими, так как полная ответная реакция имела место у около 40% пациентов. Однако спустя 6 месяцев после лечения показатель рецидивов составил около 50%, так что в конечном итоге положительным можно считать лечение только 20-25% больных.

Для полной информации по использованию интерферонов в лечении гепатита можно обратиться к книге "Интерфероны в лечении хронической вирусной инфекции печени "Eddleston и Dixon Pennine Press", 1990 г.

Кроме того, интерфероны предлагали использовать для лечения других состояний, включающих другие вирусные заболевания, помимо гепатита, а также нарушений иммунной системы, включая аутоиммунные состояния, и различных раковых заболеваний, включая рак почки, рак молочной железы, рак толстого кишечника, саркому Капоши, глиому и злокачественные заболевания крови.

Есть некоторые основания предположить, что, в частности, при ВИЧ, хронические вирусные инфекции могут вызывать окислительную нагрузку в зараженном организме. Усиление окислительной нагрузки вирусами обязано ряду механизмов, включающих активацию фагоцитных клеток иммуннокомплексами, ускорение образования свободных радикалов провоспалительными цитокинами (TNFa, ILG) и образование видов с реактивным кислородом прямым взаимодействием между вирусно-поверхностными гликопротеидами и клеточными мембранами.

Известен ряд веществ, которые действуют как ловушка свободного радикала на уровне клетки или всего организма. Например, восстановленный глутатион представляет собой широко распространенный небелковый тиол, присутствующий в большинстве клеток млекопитающих, который вовлечен во множество метаболических функций, включающих функции детоксификации против свободных радикалов. Глутатион является основным внутриклеточным защитным механизмом против окислительной нагрузки, и факторы, которые усиливают образование свободных радикалов, способствуют расходу запасов внутриклеточного глутатиона. Глутатион также играет важную иммунорегуляторную роль в модулировании активации лимфоцитов, T-клеточной цитотоксичности и взаимодействиях макрофаг-лимфоцит.

N-Ацетил-цистеин известен в течение многих лет как муколитик, агент заживления роговицы и как антидот при отравлении ацетаминофеном. Соединение обладает относительно мягким восстановительным действием и действует как муколитик, расщепляя дисульфидные связи в мукопротеидах. В ряде публикаций имеются утверждения, что уровни восстановленного глутатиона могут быть снижены в некоторых хронических вирусных состояниях, в частности, при заражении ВИЧ. N-Ацетилцистеин является предшественником, и следовательно, индуктором глутатиона, и N-ацетилцистеин был предложен в качестве терапевтического агента для использования в случае заражения ВИЧ.

EP-A-0269017 (Cetus) относится к комбинации лимфокина или цитотоксина и ловушки свободного радикала или метаболического ингибитора для лечения биологических нарушений у носителей-млекопитающих, вызванных продуцированием свободных радикалов. Хотя описание относится к интерферонам как лимфокину и упоминает инфекции как возможную причину биологического нарушения, оно в основном касается свободных радикалов, которые могут образовываться при лечении рака. Биологические данные, приведенные в описании, полностью относятся к раку и касаются в основном назначения TNFa в фибросаркому у мышей.

Настоящее изобретение относится к использованию ловушки свободного радикала или ее предшественника или индуктора в качестве вспомогательного средства в лечении человеческим интерфероном.

Итак, в одном аспекте изобретение предусматривает метод лечения больного, страдающего состоянием, подлежащим лечению интерфероном, который включает назначение больному эффективного количества человеческого интерферона и в котором ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор также назначается на весь срок или часть срока приема человеческого интерферона.

В другом аспекте изобретение предусматривает использование человеческого интерферона в приготовлении лекарственного средства для использования в лечении состояния, восприимчивого к терапии интерфероном, методом, в котором ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор также назначается на весь или часть курса назначения человеческого интерферона.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение предусматривает использование ловушки свободного радикала или ее предшественника или индуктора для приготовления лекарственного средства для лечения состояния, восприимчивого к терапии интерфероном, методом, включающим назначение человеческого интерферона, и в котором ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор также назначается на весь курс или часть курса назначения человеческого интерферона.

Состоянием, восприимчивым к терапии интерфероном, может быть любое из состояний, в котором принимают человеческие интерфероны или назначают их в качестве эффективных препаратов. Такие состояния включают вирусные инфекции, такие как вирусный гепатит, инфекции, вызванные вирусом человеческой папилломы, цитомегаловирусом и ВИЧ, невирусные инфекции, такие как туберкулез и состояния, такие как астма.

Настоящее изобретение особенно применимо к использованию человеческих интерферонов в лечении гепатита. Как уже говорилось, хотя такое лечение дает значительный успех во многих случаях, показатели ответной реакции относительно низкие, и в случае гепатита C имеется значительный процент рецидивов. Поэтому существует необходимость усовершенствовать лечение гепатита человеческим интерфероном, чтобы решить эти проблемы.

Пример человеческого интерферона, используемого в настоящем изобретении, включает интерфероны, упомянутые выше.

В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение предлагает метод лечения заражения вирусным гепатитом назначением человеческого интерферона, в котором ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор также назначается на протяжении всего курса или части курса назначения человеческого интерферона.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение предлагает использование человеческого интерферона в приготовлении лекарственного средства для лечения заражения вирусным гепатитом методом, в котором ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор также назначается на протяжении всего курса или части курса назначения человеческого интерферона.

Еще в одном аспекте изобретение предлагает усиливающие действие комбинации, известные также как синергические комбинации, человеческого интерферона и ловушка свободного радикала или ее предшественника или индуктора для использования в лечении состояния, восприимчивого к терапии интерфероном. Активные ингредиенты усиливающих действие комбинаций изобретения могут назначаться одновременно или последовательно как отдельные препараты или как единый комбинированный препарат. Если назначение последовательное, задержка в назначении второго из активных ингредиентов не должна быть большой, чтобы не потерять преимущество потенциированного терапевтического действия комбинации активных ингредиентов.

Настоящее изобретение применимо к лечению вирусного гепатита во всех его формах, в настоящее время таковых имеется пять и они соответственно обозначены гепатит A, B, C, D и E.

Гепатит A представляет собой острое вирусное заражение с инкубационным периодом до 40 дней, передающееся фекально-оральным путем. Вирус является представителем семейства пикорнавируса и состоит из сферической необолочковой частицы в 27 нм. Определена последовательность вирусного генома, и она включает одиночную цепь РНК, содержащую около 7480 оснований.

Гепатит B - всемирно распространенное и серьезное вирусное заболевание с предполагаемым числом носителей свыше 200 миллионов человек. Когда оно было известно как сывороточный гепатит, заболевание диагностировалось на основании симптомов 2-3 месяца спустя после переливания крови, введения фракций человеческой плазмы или использования нестерелизованных игл со шприцами. Опознавание сывороточных маркеров на гепатит B подтвердило важность проникновения через кожу и, в частности, кровь в передаче вируса. После острой фазы заболевания большинство взрослых пациентов быстро выздоравливали за несколько недель, но часть из них не избавлялась от вируса после многих месяцев и становилась хроническими носителями. Вирус гепатита B принадлежит к семейству гепаднавируса, геном которого состоит из небольшого с неполной двойной цепью кольцевого фрагмента ДНК, который размножается копированием его ДНК в РНК и затем повторным копированием РНК в ДНК с использованием ревертазы.

Не-A, не-B гепатит признается все более серьезной проблемой здоровья в международном масштабе. По меньшей мере, 80% случаев хронического посттрансфузионного не-A, не-B гепатита можно отнести к вирусу, определенному теперь как гепатит C, и, возможно, этот вирус несет ответственность за все случаи посттрансфузионного гепатита в клинических условиях, где продукты крови тестировались на гепатит B. Если приблизительно половина случаев заражения острым гепатитом C разрешалась в течение месяцев, остальная часть оставалась хронической, и во многих, если не во всех случаях сопровождается угрозой цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Структура генома вируса гепатита C была недавно выявлена, и вирус был охарактеризован как вирус с одиночной цепью РНК, схожий с флавивирусами.

Вирус гепатита D был впервые опознан в 1977 г. после определения нового антигена у некоторых носителей гепатита B. Репликация вируса требует вирус гепатита B в качестве вируса хелпера (или близко связанный с ним гепадна-вирус), хотя репликация достаточно эффективна, настолько, что может достичь в сыворотке более высокого титра, чем вирус-хелпер). Геном гепатита D состоит из ковалентно закрытой кольцевой РНК и имеет некоторую структурную схожесть с некоторыми кольцевыми вироидами или вирусоподобными агентами, найденными в растениях. Заражение гепатитом D связано с обострением заболевания печени и чаще встречается у больных с серьезным острым заболеванием (обострение хронического гепатита или цирроз), нежели у больных с постоянным хроническим гепатитом.

Вирус гепатита E относится к вирусу, который вызывает гепатит A (Reyes и др. Science 247, 1335-39 (1990)), и он дает острую форму гепатита без хронической фазы. Вирус является кишечным, переносится водой и передается фекально-оральным путем. Он особенно широко распространен на Индийском субконтиненте и дает высокий процент смертности у беременных женщин.

Настоящее изобретение также применимо к лечению вируса человеческой папилломы, который является агентом, ответственным за неостроконечные бородавки, юношескую папиллому гортани, Condyloma accuminata, и который участвует в цервикальном раке. Изобретение также применимо к лечению других вирусных инфекций, таких как три, вызванные человеческим цитомегаловирусом и ВИЧ. Изобретение также применимо к лечению невирусных инфекций, таких как туберкулез, и состояний, таких как астма.

Человеческий интерферон для использования по изобретению может быть любым из трех типов, упомянутых выше, т.е. интерфероном -, интерфероном - или интерфероном -. Обычно человеческим интерфероном будет интерферон - или интерферон -. Предпочтительнее, если это будет человеческий интерферон -, еще лучше, если человеческий интерферон - получен из человеческой клеточной линии в культуре или рекомбинантного человеческого интерферона -. В соответствии с предпочтительным вариантом человеческий интерферон представляет собой рекомбинантный интерферон --2a или интерферон --2в, например, один из продуктов под товарным наименованием ROFERON и INTRON. В соответствии с другим наиболее предпочтительным вариантом человеческий интерферон представляет собой человеческий лимфобластоидный интерферон (интерферон --N₁), например, продукт Wellcome Foundation Ltd под товарным наименованием WELLFERON.

Термин "человеческий интерферон" включает любой интерферон дикого типа, последовательность которого была определена от человека, и любой его аллель, вариант или мутант, который значительно сохраняет активность соответствующей последовательности дикого типа и который обладает более чем 80% гомологией последовательности с последовательностью соответствующего дикого типа.

Человеческие интерфероны готовятся в препараты для назначения по изобретению так же, как для использования в чистом виде в лечении конкретного состояния, например, гепатита. Таким образом, интерферон обычно назначается парентерально, например, инъекцией, предпочтительно подкожной инъекцией. Лучше готовить интерферон в виде водного препарата или как лиофилизированный продукт, предназначенный для восстановления подходящим носителям, например, водой для инъекции. Препарат может также содержать подходящий носитель, разбавитель или стабилизатор, например, другой человеческий белок, такой, как человеческий сывороточный альбумин.

Человеческий интерферон обычно назначается в соответствии со схемой лечения, уже установившейся в практике для данного продукта. Например, человеческий интерферон -, лимфобластоидный или рекомбинантный может назначаться с дозировкой от 1 до 10 мегаединиц интерферона в день. Доза может назначаться на 3 дня в неделю или больше, предпочтительно 3 раза в неделю. Наиболее приемлемая дозировка составляет от 2 до 6 мегаединиц интерферона в день в течение трех или нескольких дней в неделю, предпочтительно 3 раза в неделю, а конкретно, наиболее приемлемой дозировкой является 5 мегаединиц, еще лучше 3 мегаединицы в день трижды в неделю. В лечении гепатита длительность назначения интерферона обычно составляет срок от нескольких недель, например, 12 - 30 недель, в частности, 24 недели, хотя в некоторых случаях лечение может продолжаться до года или больше.

Здесь термин "ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор" означает любой материал, который способен по назначении носителю снижать уровень свободных радикалов (известный также как окислительная нагрузка) у носителя. Материал может достигать этого снижения в уровне свободных радикалов прямой утилизацией свободных радикалов или индуцированием в качестве биологического предшественника или другой роли продукции, материала в носителе, который оказывает утилитарное действие на свободные радикалы. В другом случае материал может снизить уровень свободных радикалов осуществлением тормозящего действия в процессах, которые ведут к образованию свободных радикалов.

Предпочтительные ловушки свободных радикалов или ее предшественники или индукторы включают глутатион и его предшественников, таких как производные имеющихся в природе аминокислотного цистеина. Одним наиболее предпочтительным предшественником глутатиона является N-ацетилцистеин. Как указывалось выше, N-ацетилцистеин находит фармацевтическое использование в качестве муколитика, и фармацевтические препараты соединения имеются в продаже. Другие ловушки свободных радикалов или ее предшественники или индукторы включают витамин A, витамин C (аскорбиновую кислоту), витамин E, мочевую кислоту, бутионин сульфоксим, диэтилмалеатметронидазол, супероксиддисмутазу и метионин. Материалы, которые тормозят образование свободных радикалов, включают ингибиторы ксантиноксидазы, такой, как алллопуринол.

Ловушка свободного радикала или ее предшественник или индуктор должны назначаться в такой форме и дозировке, которая могла бы снизить образование свободного радикала и/или снять действия образования свободных радикалов (окислительную нагрузку) у носителя. Назначение может быть любым удобным способом, например, оральным или парентеральным, в зависимости от характера материала. По возможности предпочитается оральное назначение.

N-Ацетилцистеин готовится для орального назначения в форме таблеток или гранул или как жидкий препарат, например сироп. Соответствующая дозировка N-ацетилцистеина составляет в пределах 200 мг - 4 г на дозу, назначаемую до 4 раз в день, например, 400 - 800 мг 4 раза ежедневно, лучше 600 мг 4 раза в день.

Хотя лечение по изобретению, например, вирусного гепатита состоит в комбинированном назначении человеческого интерферона и ловушки свободного радикала или ее предшественника или индуктора, два медикамента назначаются обычно как отдельные препараты. Однако в некоторых случаях лучше назначить два компонента в виде комбинированного препарата, и изобретение охватывает такие комбинированные препараты.

Таким образом, еще один аспект изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую человеческий интерферон вместе с ловушкой свободных радикалов или ее предшественником или индуктором.

Как правило, такой комбинированный препарат будет в форме, предназначенной для парентерального назначения, например инъекции. Такой комбинированный препарат может быть в жидкой форме или твердой, в которой человеческий интерферон лиофилизирован и восстанавливается в жидкую форму.

Два лекарства в подходящей форме могут выпускаться для раздельного назначения. Поэтому другой аспект изобретения предлагает двойную упаковку для раздельного назначения человеческого интерферона и ловушки свободного радикала или ее предшественника или индуктора.

Настоящее изобретение особенно применимо к лечению гепатита B или гепатита C. Как говорилось выше, назначение человеческого интерферона, в частности, рекомбинантного или лимфобластоидного интерферона -- уже установившаяся терапия гепатита B. Кроме того, ряд исследований показали, что та же самая терапия приносит значительную пользу при лечении гепатита C. В соответствии с изобретением терапия больных, страдающих гепатитом, в частности, гепатитом B или гепатитом C, будет проводиться в соответствии с установленными схемами лечения с дополнением лечением ловушкой свободного радикала или ее предшественником или индуктором на протяжении части или всего курса терапии человеческим интерфероном.

Уровни сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) являются высокочувствительным маркером дисфункции печени. Заражения гепатитом B и гепатитом C оба характеризуются повышенным содержанием ALT, и прогресс заболевания обычно контролируется определением сывороточной ALT. Как говорилось выше, только около 50% больных или меньше с гепатитом B или гепатитом C реагируют на лечение человеческим интерфероном -, как показывает значительное выведение вирусных маркеров или снижение уровней ALT.

Согласно одному варианту изобретения, которое особенно применимо к лечению гепатита B или гепатита C, особенно гепатита C, лечение человеческим интерфероном, в частности интерфероном -, проводится обычным образом в течение нескольких недель, например 12 - 30 недель, конкретно 24 недель. Для больных, которые не реагируют на этот первоначальный курс лечения человеческим интерфероном, как показывают значительно пониженные уровни сывороточной ALT, лечение продолжается человеческим интерфероном с дополнительным лечением ловушкой свободного радикала или ее предшественником или индуктором, предпочтительно глутатионом или его предшественником или индуктором, лучше всего - N-ацетилцистеином. Лечение человеческим интерфероном и ловушкой свободного радикала или ее предшественником или индуктором может продолжаться еще несколько недель, например, 12 - 30 недель, конкретно около 24 недель. В соответствии с предпочтительным вариантом изобретения эта схема лечения применяется к лечению гепатита C человеческим лимфобластоидным интерфероном (человеческим интерфероном --N₁).

Как удалось выше, некоторые больные с гепатитом B или C могут вначале реагировать на лечение человеческим интерфероном, особенно интерфероном -, но возможны рецидивы. Таким больным может стать лучше при комбинированном курсе лечения человеческим интерфероном и ловушкой свободного радикала или ее предшественником или индуктором, как указывалось выше.

Доза человеческого интерферона и ловушки свободного радикала может меняться в зависимости от больного и его состояния. В конечном итоге лечение проводится под контролем и ответственностью лечащего врача.

Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Пример

1. Введение

Вирус гепатита C в большинстве случаев несет ответственность за посттрансфузионный и спорадический не-A, не-B гепатит. Переход инфекции в хроническое состояние является обычным, что приводит к хроническому гепатиту, циррозу и в конечном итоге - к злокачественному превращению. Несколько исследований показали, что - интерферон (INF) полезен в лечении хронического гепатита C (CHC), но процент ответной реакции в среднем составляет 50% и частота рецидивов после прекращения лечения INF может достигать 30 - 40%. Соответственно, пропорция больных CHC с поддержанием нормальных уровней трансферазы после снятия INF составляет только около 20 - 40% всех леченых случаев. Восстановленный глутатион (GSH) является важным антиокислителем в клетках млекопитающих, вовлечен в множество клеточных функций и истощение GSH может играть патогенную роль в некоторых хронических вирусных заболеваниях, таких как СПИД. В этом исследовании уровни GSH измерялись в плазме и периферических кровяных одноядерных клетках (PBMC) от больных CHC, которые не реагировали на лечение INF после по меньшей мере 4 месяцев лечения. Действие N-ацетилцистеина, предшественника тиола, также определялось по CH уровням и по клинической и вирологической реакции на лечение.

2. Пациенты и методы

2.1. Пациенты

В исследовании принимали участие 14 пациентов (13 мужчин и 1 женщина, средний возраст 51 год, от 27 до 71 года, с диагнозом CHC, подтвержденным гистологически и серологически, двое больных имели цирроз. Все пациенты проходили лечение - лимфобластоидным интерфероном (Wellferon) минимально 4 месяца (151,6 МЕ в неделю, 9 - 21 МЕ в неделю); у всех пациентов были ненормальные величины ALT (свыше 30 IU/L) до исследования. Большинство больных CHC, реагирующих на INF, нормализовали уровни трансаминазы в первые 3 месяца лечения, и те, у кого оставались высокие уровни ALT после 4 месяцев лечения, считались не реагирующими на лечение. Соответственно, в данном исследовании все пациенты считались не реагирующими на INF. Больным продолжали назначение INF по той же схеме, но добавили орально N-ацетилцистеин (NAC), 600 мг каждые 8 часов ежедневно. Ни одному пациенту не повысили дозировку интерферона после добавления орального NAC, хотя в 3 случаях количество интерферона несколько снизили (151,8 МЕ) в неделю до NAC в сравнении с 11,5 1,3 МЕ/неделю после NAC/.

Кроме того, 10 больных (8 мужчин и 2 женщины, средний возраст 32 года, от 24 до 63 лет), которым недавно был поставлен диагноз хронического гепатита C и которые не получали антивирусное лечение, принимали то же количество орального NAC, но без интерферона в течение одного месяца.

26 здоровых субъектов (14 мужчин и 12 женщин, средний возраст 43 года, от 25 до 79 лет) служили контрольной группой. Все пациенты дали письменное согласие на исследование, и оно было одобрено местным комитетом по этике.

2.2. Определение GSH в РВМС и плазме

У каждого больного брались анализы крови на одновременное определение GSH в РВМС (L - GSH) и в обедненной тромбоцитами плазме (P - GSH). РВМС изолировались центрифугированием на Lymphoprep (Nycomed Pharma, AS, Осло, Норвегия) и промывались 5 раз. Изолированные клетки убивались 20%-ной хлорной кислотой (2%-ная окончательная концентрация), и после центрифугирования (1200 г х 10 мин при 4^oC), и надосадочные жидкости хранились при -40^oC до использования. 20%-ная хлорная кислота добавлялась к обедненной тромбоцитами плазме (2%-ная окончательная концентрация), и после центрифугирования надосадочная жидкость хранилась при -40^oC до определения GSH.

Образцы оттаивали, и GSH определялся по ферментному методу, описанному Brigellus и др. Biochem Pharmacol 32, 2529-34 (1983) с модификацией Ferrer и др. Biochem 264, 532-34 (1990). CH в присутствии CH-трансферазы конъюгировался с 1-хлор-2,4-бензолом (CDNB) (Sigma), и оптическая плотность комплекса измерялась на 340 нм с использованием спектрофотометра Перкина-Элмера Lambda 2. Абсолютные величины CH были получены с использованием коэффициента молярной экстинкции в 9,610³.

2.3. Экстракция РНК и RT-PCR

Цепная реакция полимеразы обратной транскрипции (RT-PCR) для HCV-РНК в сыворотке и для положительных или отрицательных цепей HCV - РНК в РВМС проводилась фактически, как описано у Ruig и др. Hepatology 16, 637-643 (1992) и Cheng и др. J. Hepat. в печати (1992). Строго применялись процедуры, рекомендованные Kwoks и Higuchi, Nature, 339, 237-238 (1989), чтобы снизить риск загрязнения (заражения). Все экстракции и реакции одновременно проводились в положительных и отрицательных контролях. Также была включена аликвота из последней промывки, и в этих образцах PCR была всегда отрицательной.

2.4 Статистический анализ

Все данные представлены как средние величины стандартная ошибка средней величины (SEM). Сравнения для парных и непарных данных проводились с использованием тестов Wann Whitney u Wilcoxon.

3. Диаграммы

Результаты описаны со ссылкой на сопровождающие диаграммы, на которых:

фиг. 1 - действие INF (от 4 до 0 месяцев) и INF плюс NAC (0 до 6 месяцев) на уровни ALT у 14 пациентов, участвующих в исследовании;

фиг. 2 - обнаружение в РВМС положительных и отрицательных цепей HCV - РНК при лечении INF и INF плюс NAC;

фиг. 3 - обнаружение HCV - РНК в сыворотке при разбавлении сыворотки 1: 10 как до, так и после добавления NAC к лечению INF; и

фиг. 4 - средние уровни ALT в одной и той же популяции пациента, изображенной на фиг. 1, в течение срока до 11 месяцев после введения NAC в лечение INF.

4. Результаты

Средние сывороточные уровни ALT для 14 пациентов, прошедших исследования, показаны в таблице, которая также показывает L-GSH и P-GSH.

Величины для L - GSH и P-GSH в контрольной группе были следующими:

L-GSH 3,43 0,89 нМол/10⁶ клеток

P-GSH 18,1 4,08 нМ.

У пациентов с хроническим гепатитом C, которые никогда не получали антивирусное лечение (n = 10), уровни GSH в плазме (0,63 0,07 lm и в РВМС 1,02 0,09 нМол/10⁶ клеток) резко снижены по сравнению со здоровыми контрольными группами (18,14,08 lm и 3,43 + 0,89 нМол/10⁶ клеток соответственно, P < 0,01). Назначение NAC в течение 1 месяца значительно повысило уровни GSH в РВМС (2,22 0,38 нМол/10⁶ клеток, P < 0,05), но уровни GSH в плазме не были значительно изменены (0,99 0,22 lm, n.s). Кроме того, уровни сывороточной ALT (128 32 IU/L в сравнении с 110 29 IU/L после одного месяца лечения NAC) также изменились незначительно.

У пациентов, не реагирующих на интерферон, уровни GSH в РВМС (1,45 0,27 нМол/10⁶ клеток) и в плазме (0,7 0,21 lm) также были значительно снижены в сравнении с контрольными величинами (p < 0,01). У этих больных назначение NAC вместе с интерфероном в течение 3-4 месяцев дало значительное повышение GSH в моноядерных клетках (3,32 0,18 нМол/10⁶ клеток, p < 0,05) и в плазме (2,40 0,20 lm p < 0,05/.

Фиг. 1 и вышеуказанная таблица показывают, что у больных, участвующих в эксперименте (не реагирующих на интерферон) уровня ALT не изменились значительно в течение 4 месяцев лечения INF (13924 в сравнении с 124 17 IU/L, n, s). Однако добавление орального NAC дало резкое и значительное снижение ALT; даже после месяца комбинированного лечения величины ALT значительно уменьшились (87 9 IU/L p < 0,05). Более того, продолжительное назначение INF и NAC в течение 5 - 6 месяцев обеспечили дальнейшее снижение величин ALT во всех случаях (37 4 IU/L), с достижением нормальных величин в 41% случаев и близких к нормальным величин (максимум в 56 IU/L в одном случае) у остальных. Добавление NAC к схеме лечения INF явно улучшает реакцию на INF в случае пациентов, ранее классифицированных как не реагирующих на INF терапию.

Снижение уровней ALT комбинаций INF и NAC сопровождалось сопутствующим действием на репликацию вируса. В случае пациентов, классифицированных как не реагирующие на INF, РВМС анализировались на наличие как геномной цепи HCV (положительная РНК цепь), так и репликативного посредника вируса (отрицательная РНК цепь), до и после добавления NAC к схеме лечения. Как показано на фиг. 2, когда больных лечили только INF, геномную цепь можно было обнаружить в 7 случаях (77%), а репликативный посредник был обнаружен у 3 больных (33%). Однако после 4-6 месяцев комбинированной терапии INF и NAC положительная цепь была обнаружена только в 2 случаях (22%) и отрицательная цепь HCV - РНК не была обнаружена ни в одном из случаев.

Добавление NAC к схеме лечения INF также сопровождалось снижением уровней HCV - РНК в сыворотке. Как показано на фиг. 3, после добавления VAC к лечению потребовалась повышенная концентрация сыворотки для обнаружения HCV: так, до добавления NAC HCV - РНК можно было обнаружить в 100% случаев, используя разбавление сыворотки 1:10, в то время как после добавления NAC к терапии при том же самом разбавлении сыворотки вирус был обнаружен только у 70% больных.