способ получения внутривенного иммуноглобулина

Формула изобретения

Способ получения внутривенного иммуноглобулина, включающий ультрафильтрацию или диализ полуфабриката иммуноглобулина при pH 3,9 - 4,4, введение стабилизаторов и заключительную стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что после стадии ультрафильтрации или диализа проводят температурную обработку при 30 - 58^oС не менее 2 ч и не более 45 дней, на всех этапах технологического процесса поддерживают электрическое сопротивление раствора иммуноглобулина не менее 0,1 МОм см.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов, и может быть использовано при получении иммуноглобулинов (ИГ), предназначенных для внутривенного введения (ВВ).

Основными показателями качества ВВ ИГ является низкая антикомплементарная активность (АКА), отсутствие агрегатов, более высокое содержание мономеров и стабильность указанных показателей при хранении.

Известно множество методов получения внутривенных иммуноглобулинов.

Наиболее высокую клиническую переносимость и низкую антикомплементарную активность имеют ИГ, полученные ферментативной обработкой - пепсином (1), трипсином, плазмином (2). Но расщепленный протеазами ВВ ИГ характеризуется низким содержанием наиболее физиологически активной мономерной фракции.

Химическая модификация ИГ токсичным b-пропиолактоном (3), сульфонирующими агентами приводит к антигенному эффекту ИГ (4).

Использование поверхностно-активных веществ, остающихся в готовом препарате, нефизиологично (5).

ВВ ИГ, полученные ионообменной хроматографией (6), обработкой полиэтиленгликолем (7), характеризуются низким выходом и нарушенным спектром распределения субклассов антител в сравнении с исходной плазмой (8).

Удаление агрегатов и снижение антикомплементарности путем ультрафильтрации (9) через мембраны около 1 МДа не нашло пока промышленного применения из-за нетехнологичности и нестабильности при хранении.

Вышеуказанные ИГ имеют нейтральный pH конечного препарата, что способствует появлению агрегатов при хранении.

В настоящее время первыми в мире по объему продаж ВВ ИГ (10) являются фирма Cutter (США), выпускающая иммуноглобулин с pH 3,9-4,4, и фирма Зеленый Крест/Альфа (Япония), предлагающая к продаже ИГ с pH 5,5. Величина pH от 3,9 до 5,5 находится вдали от изоэлектрической точки ИГ, равной 5,8-7,3, поэтому молекулы имеют высокий заряд и препарат обладает стабильностью.

Способ получения препарата с pH 5,5 (11) предусматривает пастеризацию при pH 5,50,2 в течение 10 ч при 60^oC, удаление образовавшихся агрегатов полиэтиленгликолем и последующую ионообменную хроматографию. Метод довольно трудоемок, имеет низкий выход. Единственно предлагаемый стабилизатор - сорбит не является естественным метаболитом организма человека, что может приводить к нарушению кислотно- щелочного баланса.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу получения ВВ ИГ является метод (12), включающий следующие технологические этапы. ИГ растворяют или концентрируют до концентрации белка 0,5-20,0% при температуре 0- 20^oC. Доводят pH раствора до 3,5-5,0 соляной кислотой. Снижают ионную силу раствора менее 0,001 М путем диализа или диафильтрации против дистиллированной воды, что соответствует по справочным и расчетным данным электрическому сопротивлению раствора ВВ ИГ, равному 0,008-0,05 МОмсм (13). Вводят стабилизаторы, доводят pH до 3,5-5,0 и концентрацию конечного белка до 5-15%. В полученном препарате содержание мономеров составляет более 90%, а АКА более 4 мг/2CH5O (в примерах 6 мг/2CH5O).

Этот метод обеспечивает получение нативного ИГ с содержанием антител, соответствующим их первоначальному содержанию в плазме, характеризуется низкой себестоимостью, отсутствием использования в технологии вредных и токсичных веществ, высоким выходом. Положительным моментом является и то, что в конечном препарате нет необходимости восстановления pH до нейтральных значений, так как нейтрализация готового препарата сопровождается появлением аггрегатов даже в только что приготовленном препарате (14).

Однако антикомплементарная активность ВВ ИГ, полученная по известному методу, превышала требуемую по ФС 42-3159-95 (15) более чем в 2 раза, а в процессе хранения наблюдалось появление агрегатов. При проверке препарата в тесте на ускоренное старение путем прогревания ИГ при 57^oC в течение 24 часов появлялось более 5-10% агрегированных молекул (11), что недопустимо для ВВ ИГ. По данным авторов (12), препарат был стабилен в течение 6 месяцев, при обычном сроке хранения таких препаратов от 2 до 3 лет.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа получения препарата ВВ ИГ, характеризующегося низкой антикомплементарной активностью и стабильностью при хранении.

Технический результат заключается в получении препарата ВВ ИГ с АКА 10 и более мг/2CH5O, не содержащего агрегатов.

Сущность метода заключается в том, что способ включает ультрафильтрацию или диализ полуфабриката иммуноглобулина с последующей температурной обработкой при 30-58^oC не менее 2 ч и не более 45 дней и поддержание на всех этапах технологического процесса электрического сопротивления раствора ИГ не менее 0,1 МОмсм.

В отличие от прототипа, в заявляемом способе после стадии удаления этанола, солей и других низкомолекулярных веществ проводится температурная обработка. Кроме того, в данном способе на всех этапах технологического процесса обеспечивают поддержание электрического сопротивления раствора ИГ на уровне не менее 0,1 МОмсм.

Совокупность отличительных признаков заявляемого способа позволила получить следующие преимущества. Температурная обработка при кислом pH позволила значительно снизить АКА до пределов, разрешающих клиническое применение - 10 и более мг/2CH5O, так как при повышении температуры происходит более сильная гидратация молекулы ИГ (табл. 1). Кроме того, температурное воздействие при отсутствии ионов в растворе (высокое сопротивление раствора) приводит к инактивации или ингибиции протеаз ИГ, что препятствует фрагментации препарата во время хранения (табл. 2). В свою очередь поддержание высокого электрического сопротивления раствора ИГ обеспечивает его стабильность (табл. 2, 3).

Препараты внутривенного иммуноглобулина оценивались по следующим методикам.

Молекулярные параметры определялись на сефадексе G200 (16,17), антикомплементарная активность - пробирочным методом (18). Тест на термостабильность осуществлялся путем прогрева ИГ при 57^oC в течение 24 ч (19). Этот тест рассматривается как аналог условий хранения. Тест на "перемешивание" (20) изучался путем перемешивания флакона с ИГ в течение 2 ч при 20^oC при 80 горизонтальных осцилляциях в минуту. Для этого флакон из боросиликатного стекла типа 1 вместимостью 50 мл заполнялся асептически 20 мл стерильного раствора ИГ с концентрацией 5%. Данный тест можно рассматривать как аналог условий транспортировки до потребителя.

Полученные результаты приведены в табл. 1-3. Как видно из представленных данных (табл. 1), использование предлагаемого способа позволяет получить препарат с более низкой АКА, отсутствием агрегатов, минимальным содержанием димеров - менее 5%, большим содержанием мономеров. Стабильность указанных показателей представлена в тесте на термостабильность (табл. 2) и в тесте на перемешивание (табл. 3).

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используется иммуноглобулин с электрофоретической чистотой не менее 99%, полученный любым известным способом. Доводят pH раствора от 3,9 до 4,4 соляной кислотой. Проводят диализ или диафильтрацию против воды с сопротивлением 10,0-18,2 МОм/см и концентрируют раствор до содержания белка 0,5- 20,0%. Затем осуществляют температурную обработку раствора ИГ, выдерживая при температуре 30-58^oC не менее 2 ч и не более 45 дней. Полученный раствор иммуноглобулина доводится до лекарственной формы препарата по концентрации белка и осмомолярности, подводится pH до 3,9-4,4 и подвергается стерилизующей фильтрации. На всех этапах технологического процесса поддерживают электрическое сопротивление раствора ИГ не менее 0,1 МОмсм.

Примеры

Пример 1. Сырье - фильтрат III, полученный методом Кона 6. 100 л фильтрата III, с содержанием белка 0,3% доводят до pH 4,0 0,1 N раствором HCl (20 л). Полученный раствор разбавляют до 200 л водой для инъекций с сопротивлением 17 МОмсм и проводят концентрирование до 3% белка и диафильтрацию против 8 объемов вышеуказанной воды при температуре 4^oC на картридже с мембраной YM (100000 Да) из целлюлозы (фирма Амикон). Затем концентрирование до 7% белка. Вводят мальтозу до 30% и осуществляют температурную обработку на водяной бане при температуре 52^oC в течение 4 ч. Далее выполняют диализ против вышеуказанной воды. В полученный раствор вводят глюкозу до 5%, глицин до 0,75%, устанавливают pH 4,0,% белка - 5%, и подвергают стерилизующей фильтрации. Получают 5 л 5% раствора внутривенного иммуноглобулина с электрическим сопротивлением 1,2 МОмсм, АКА 13 мг/2CH5O и следующими молекулярными параметрами -агрегаты 0, димеры - 2,3, мономеры - 96,4, фрагменты - 1,3%.

Пример 2. Сырье - осадок II, полученный методом Кона 6. Осадок II в количестве 1 кг растворяют в 1,7 л 1% раствора глицина, содержащего 0,45% натрия хлорида с pH 4,0, при температуре 4^oC. Корригируют pH белкового раствора до 4,0 и проводят диализ через диализную трубку из ацетатцеллюлозы против 200 объемов воды с сопротивлением 18 МОмсм при температуре 8^oC. Через сутки отдиализованный раствор с pH 4,1 стерильно отфильтровывают и выдерживают в термостате при температуре 37^oC в течение 14 дней. В полученный раствор вводят мальтозу до 10%, устанавливают pH 4,0,% белка -5% и подвергают стерилизующей фильтрации. Получают раствор внутривенного иммуноглобулина в объеме 5,0 л с электрическим сопротивлением 2 МОм/см, АКА 12 мг/2CH5O и следующими молекулярными параметрами - агрегаты О, димеры - 2,1, мономеры - 95,9, фрагменты -2,0%.

Пример 3. Сырье - элюат, полученный ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А 50 из осадка II по Кону (21), с электрофоретической чистотой 100% и концентрацией белка 0,6%, в объеме 10 л. Раствор иммуноглобулина подводят до pH 4,0 1N раствором соляной кислоты, концентрируют ультрафильтрацией до 7% белка и подвергают диафильтрации против 7 объемов воды с сопротивлением 18 МОмсм. Температурную обработку и дальнейшие операции выполняют согласно примеру 1. Получают 5% раствор внутривенного иммуноглобулина в объеме 1,2л с электрическим сопротивлением 3 МОмсм, АКА 15 мг/2CH5O и следующими молекулярными параметрами - агрегаты 0, димеры - 2,5, мономеры - 97,0, фрагменты -0,5%.

Источники информации

1) Патент РФ N 2068695. Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения. A 61 K 35/16. Опубл. 10.11.1996.

2) Патент Германии N 2752694. Плазминобогащенные внутривенные иммуноглобулины. C 07 G 7/00. Опубл. 21.01.1981.

3) Патент США N 3916026. Метод получения внутривенного иммуноглобулина. A 61 K 37/00. Опубл. 28. 10. 1975.

4) Stephan W. Einfurhung immunspezifischer Determinanten in Serumalbumin durch Imidoacylierung. Zeitschrift fur Immunitatsforschung 1967, 133, 153-157.

5) Патент PCT (WO) N 84/00890. Метод выделения внутривенного иммуноглобулина. A 61 K 35/14. Опубл. 15.03.1984.

6) Патент PCT/US83/01016. Метод получения внутривенного иммуноглобулина. A 61 K 39/395. Опубл. 07.09.1982.

7) Патент Германии N 2751717. Внутривенный иммуноглобулин. A 61 K 39/395. Опубл. 20. 10. 1980.

8) Beck O.E., Kaiser P.E. Distribution of human lgG Subclasses in Commercial Intravenous Immunoglobulin Preparations. Vox Sang. 1981, 41, 79-84.

9) Патент США N 5219999. Иммуноглобулин G и процесс продукции его. C 07 K 3/12. Опубл. 15.06.1993.

10) Faure A. Human blood Fractionation. 8th International Biotechnology Symposium, Paris 1988, 669-678.

11) Патент EP N 0278422 A2. Инъекционные растворы иммуноглобулина с pH 5,5. A 61 K 39/395. Опубл. 17.08.1988.

12) Патент США N 4499073. Внутривенноинъецируемый сывороточный иммуноглобулин. A 23 J 1/06. Опубл. 12.02.1985. Или аналог Патент EPB N 0073371 B1. A 61 K 39/395. Опубл. 09.03.1983.

13) Рабинович В. А., Хавин 3. Я. Краткий химический справочник: Справ, изд. Под ред. А.А.Потехина, А.И.Ефимова, 3-е изд. Л.: Химия, 1991, с. 338.

14) Mateytschuk P., More J. Factors affecting the production of intravenous immunoglobulin. Biochemical Society Transactions 1990, V. 18. N2, 309-310.

15) ФС 42-3159-95. Иммуноглобулин нормальный человека для внутривенного введения.

16) Методические рекомендации определения агрегатов и фрагментов в препаратах иммуноглобулина методом гель-фильтрации. МЗ СССР, 1986, 1-11.

17) ФС 42-344ВС-90 Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов.

18) Методические рекомендации. Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов. МЗ РСФСР. Горький 1988,1-11.

19) Патент JP N 2-32261. Стабилизатор сывороточного иммуноглобулина. A 61 K 47/26. Опубл. 19.07.1990.

20) Патент EP-A N 448075. Внутривенный иммуноглобулин. A 61 K 39/395. Опубл. 06.03.1991.

21) Фракционирование осадка фракции II+III с использованием ионообменника. В кн. В.М.Русанова, Л.И.Скобелева. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. Москва. "Медицина", 1983, 100-101.