способ получения агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных

Формула изобретения

Способ получения агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных путем измельчения ткани, экстрагирования раствором концентрированной соли, диализа экстракта, обработки диализата кислотной формой ионообменной смолы, осаждение кислотной формы целевого продукта, отличающийся тем, что измельченную ткань дополнительно подвергают ферментативному гидролизу раствором 0,5% коллагеназы в течение 4 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и может быть использовано для получения агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных, применяемых в качестве лекарственных средств.

Ближайшим аналогом изобретения является получение агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных путем измельчения ткани, экстрагирования раствором концентрированной соли, диализа экстракта, обработки диализата кислой формой ионообменной смолы, осаждения кислой формы целевого продукта (Патент РФ N 2096038, 1997 г.).

Технической задачей изобретения является создание способа получения агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных с высокой степенью очистки, увеличение выхода и сокращение времени получения агрегатов протеогликанов.

Технический результат, согласно изобретению, достигается тем, что в способе получения агрегатов протеогликанов из хряща сельскохозяйственных животных путем измельчения ткани, экстрагирования раствором концентрированной соли, диализа экстракта, обработки диализата кислой формой ионообменной смолы, осаждения кислой формы целевого продукта.

Дополнительно измельченную ткань подвергают ферментативному гидролизу раствором 0,5% коллагеназы в течение 4 часов.

Дополнительная обработка измельченной ткани раствором 0,5% коллагеназы обусловлена тем, что плотная соединительная ткань хряща сельскохозяйственных животных содержит в основном структурный белок - коллаген, сохранность которого мешает последующему выходу (экстракции) агрегатов протеогликанов.

Мягкий ферментативный гидролиз специфически расщепляет коллаген, не влияет на качество и позволяет увеличить выход конечного продукта.

В качестве фермента выбрана коллагеназа, специфически расщепляющая коллагены 1-го и 3-го типов, так как они являются наиболее часто встречающимися в плотной соединительной ткани. Раствор 0,5% коллагеназы - это оптимальная реакционная концентрация для данного способа. Ферментативный гидролиз проводят при температуре 37^oC, так как это оптимальная температура для действия фермента на субстракт. Гидролиз должен идти не более 4 часов, так как избыточное влияние ферментов может привести к частичному расщеплению серцевинного белка агрегатов протеогликанов, что снижает их качество.

Способ, согласно изобретению, осуществляется следующим образом. Хрящевые кольца трахеи сельскохозяйственных животных очищают и измельчают, проводят ферментативный гидролиз раствором 0,5% коллагеназы при температуре 37^oC в течение 4 часов, охлаждают, заливают одним из трех концентрированных солевых растворов (4 М гуанидинхлорид, 2 М CaCl₂, 3 М MgCl₂) и ведут экстракцию при температуре 2-4^oC в течение 34 - 48 часов при соотношении 1:15, экстракт отделяют от осадка центрифугированнием (3000 об/мин). Надосадочный раствор диализируют против дистиллированной воды, затем раствор агрегатов протеогликанов центрифугируют (5000 об/мин), обрабатывают кислотной формой ионообменной смолы. Полученную кислую форму осаждают этанолом, насыщенным ацетатом металла. Образовавшийся осадок основной солевой формы агрегатов протеогликанов собирают центрифугированнием, промывают этанолом и эфиром, затем высушивают.

Пример конкретного выполнения способа.

Хрящевые кольца трахей быков очищают, измельчают до получения гомогенной массы на мясорубке. Измельченную массу (200 г) гидролизируют раствором 0,5% коллагеназы при pH 7,2 и температуре 37^oC в течение 4 часов. Далее охлаждают, заливают 4 М раствором гуанидинхлорида и ведут экстракцию агрегатов протеогликанов при температуре 2-4^oC в течение 48 часов, постоянно перемешивая. Экстракт центрифугируют (3000 об/мин), удаляют белки. К раствору надосадка добавляют хлороформ до насыщения и проводят диализ против дистиллированной воды. Диализат центрифугируют (5000 об/мин), обрабатывают ионообменной смолой - кислой формой (H+ - формой pH 2,0 - 2,5) для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму. Целевой продукт осаждают из предварительно замороженного раствора агрегатов протеогликанов 2 - 3 объемами 96,6% этилового спирта, насыщенного ацетата натрия и получают основную солевую форму агрегатов протеогликанов. Затем смесь оставляют на 24-48 часов для осаждения и концентрирования. Осадок собирают на центрифуге (3000 об/мин), промывают один раз 80% спиртом и три раза 96,6% этиловым спиртом, охлажденным до температуры 15^oC этанолом и три раза наркозным эфиром. Окончательно высушивают в эксикаторе в вакууме. Выход агрегатов протеогликанов при использовании способа, согласно изобретению, составляет 10-14% сырой массы исходной ткани.