способ получения полимерной фракции столбнячного анатоксина

Формула изобретения

1. Способ получения полимерной фракции столбнячного анатоксина, включающий проведение двухступенчатой ультрафильтрационной очистки концентрата столбнячного анатоксина, полученного из фильтрата культуры Clostridium tetani штамма Копенгаген, осуществляемой через полупроницаемые полимерные мембраны с эксклюзионными пределами до 100 кД и до 300 кД на первой и второй ступенях соответственно, с последующим мембранным диализом 0,05 М фосфатным буферным раствором, отличающийся тем, что мембранный диализ концентрата столбнячного анатоксина на первой ступени ультрафильтрационной очистки проводят фосфатным буферным раствором, содержащим дополнительно 0,13 - 0,17% формалина и 0,3 М хлорида натрия.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фильтрат с второй ступени ультрафильтрационного процесса направляют на вход первой ступени, при этом ионную силу фосфатного буфера снижают до значений, соответствующих концентрации хлорида натрия в интервале 0,04 - 0,06 М.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к вакцинно-сывороточному делу, и касается совершенствования процесса производства прививочных препаратов.

Столбнячный анатоксин является препаратом для профилактики столбняка. Процесс его получения включает несколько стадий: культивирование токсигенного штамма Clostridium tetani, частичное обезвреживание анатоксина, собранного из культуральной среды, переосаждение частично обезвреженного токсина гексаметафосфатом натрия в изоэлектрической точке и дообезвреживание формалином до состояния анатоксина (см. "Руководство по вакцинному и сывороточному делу", п/р ак. П.Н. Бургасова, М., Медицина, 1978, с. 103-133). Хотя процесс получения препарата известен давно и в достаточной степени отработан, однако воспроизводимость его низка: конечный продукт не всегда имеет требуемые показатели удельной специфической активности (отношение антигенности к содержанию белкового азота), соответствующие рекомендациям ВОЗ (не ниже 1000 ЕС/мг белкового азота), что предопределено наличием в исходном полупродукте различных молекулярных форм анатоксина (полимерной, олигомерной и т.д.), а также примесных продуктов микробного происхождения.

Известен способ получения полимерной и олигомерной фракций столбнячного анатоксина, полученного при культивировании штамма Clostridium tetani, путем выделения фракций методом двухступенчатой ультрафильтрации с использованием особым образом выполненных мембран (RU 2065765 C1, B 01 D 71/56, 27.08.96). На первой стадии фракции очищают на половолоконной мембране типа УАВ-0,2 100М, на второй стадии - на плоских мембранах с эксклюзионным пределом 300 кД. Указанное изобретение может быть принято в качестве ближайшего аналога патентуемого способа.

Однако в процессе упомянутой двухступенчатой ультрафильтрации и многократного мембранного диализа (отмывок) фракций анатоксина стандартным 0,05 М фосфатным буферным раствором во многих случаях ухудшается стабильность препарата и в итоге удельная специфическая активность остается ниже установленных требований. Это происходит потому, что в процессе многократного мембранного диализа могут нарушаться параметры молекулярной конформации, задаваемые по технологии, отработанной применительно к условиям равновесного диализа. Не исключена также вероятность взаимодействия в этих условиях имеющихся в концентрате балластных белков с молекулами анатоксина. Именно поэтому и в конечном препарате не достигаются граничные показатели удельной специфической активности.

Задачей изобретения является получение полимерной фракции столбнячного анатоксина, характеризующейся более высокой степенью очистки, и вследствие этого, более высокими удельной специфической и протективной активностями, соответствующими требованиям ВОЗ.

Технический результат изобретения обеспечивается тем, что способ предусматривает проведение двухступенчатой ультрафильтрационной очистки концентрата дообезвреженного фильтрата культуры Clostridium tetani штамма Копенгаген через полупроницаемые полимерные мембраны с эксклюзионными пределами до 100 кД (на первой ступени) и до 300 кД (на второй ступени) с последующим мембранным диализом 0,05 М фосфатным буферным раствором. Особенность способа состоит в том, что мембранный диализ концентрата на первой ступени проводят фосфатным буферным раствором, который дополнительно содержит 0,13-0,17% формалина и 0,3 М хлорида натрия.

Дополнительный технический результат - уменьшение потерь полимерной фракции анатоксина обеспечивается за счет проведения рециклинга и подбора оптимальных условий для его реализации. Это достигается тем, что фильтрат со второй ступени ультрафильтрационного процесса направляют на вход первой ступени, при этом ионную силу фосфатного буфера снижают до значений, соответствующих концентрации хлорида натрия в интервале 0,04-0,06 М.

Применение модифицированного буферного раствора, состав которого подобран экспериментально, позволяет, с одной стороны, стабилизировать полимерную фракцию и обеспечить максимальный ее выход на второй ступени ультрафильтрации (с мембраной с эксклюзионным пределом 300 кД). С другой стороны, использование буферного раствора с повышенной ионной силой (за счет добавления 0,3 М хлорида натрия) позволяет наиболее полно освободиться от белковых балластных примесей уже на первой ступени ультрафильтрации на мембране с эксклюзионным пределом 100 кД.

Пример реализации.

Процесс получения полимерной фракции столбнячного анатоксина проводят в две стадии.

На первой ступени процесс проводят на установках типа АУФ-01 с половолоконной мембраной марки УАВ-0,2 100 М на основе полиметафенилентереизофталамида, модифицированного водорастворимым реагентом и эпоксидной смолой. Исходный анатоксин берут в объеме 10 - 12 литров, его удельная специфическая активность составляет от 400 до 750 ЕС/мг белкового азота. Фильтрацию проводят при рабочем давлении 0,6 - 0,7 МПа. Сконцентрированный в 5 раз анатоксин промывают 8 - 10 раз двукратными объемами раствора модифицированного 0,05 М фосфатного буфера, дополнительно содержащего 0,15% формалина и 0,3 М хлорида натрия, контролируя степень отмывки по изменению величины оптической плотности промывочного фильтрата. Затем концентрат собирают, а фильтрат отбрасывают.

Далее, полученный концентрат подвергают очистке на второй ступени ультрафильтрации через мембрану с эксклюзионным пределом 300 кД.

В ячейку аппарата типа "Amicon 2000" с мембраной марки "Diaflo ХМ-300" заливают 2 литра концентрата, ранее очищенного на первой ступени. Включают магнитную мешалку со скоростью вращения 30-40 об/мин и газообразным азотом создают в ячейке избыточное давление в диапазоне 0,06-0,07 МПа. В ячейке аппарата оставляют 300-500 мл концентрата, который промывают 3 - 5 раз стандартным 0,05 М фосфатным буферным раствором и отбирают. Фильтрат, продавленный через мембрану, собирают в мерный цилиндр для дальнейшего использования в рециклинге: в последующем его вновь направляют на вход первой ступени, снижая ионную силу фосфатного буфера приблизительно в два раза. Для этого готовят фосфатный буферный раствор на растворе хлорида натрия заданной концентрации

Таким образом, методом последовательной двухступенчатой ультрафильтрации удается во всех случаях повысить удельную активность анатоксина до 1000 ЕС/мг белкового азота, получив в изолированном виде полимерную фракцию столбнячного анатоксина (см. таблицу). Препараты столбнячного анатоксина, дополнительно очищенные по вышеописанному способу, прошли комиссионную проверку в ГИСК им. Тарасевича. Подтверждены их высокие удельная специфическая и протективная активности.