способ подготовки биологического материала для пцр генамплификационной диагностики

Формула изобретения

Способ подготовки биологического материала для ПЦР - генамплификационной диагностики, включающий лизис образца, осаждение вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК изопропанолом и центрифугированием и их очистку, отличающийся тем, что лизис проводят раствором 6М NaI, содержащим РНК-носитель, а осаждают из лизата одновременно ДНК и РНК любого происхождения, при этом раствор полученных ДНК и РНК пригоден как для ДНК-ПЦР, так и РТ-ПЦР.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и вирусологии, и может применяться для выявления истинных вирусоносителей среди сероположительных лиц на основе прямого генотестирования этих вирусов.

В силу наличия серонегативного периода системы иммуноферментного анализа (ИФА) даже третьего поколения не может полностью гарантироваться отсутствие вирусов иммунодефицита человека, гепатитов B и C и других вирусов в донорской крови, поэтому существует настоятельная необходимость внедрения в практику здравоохранения генодиагностических методов исследования. Генодиагностические методы исследования отличают высокая специфичность и чувствительность, а также возможность их автоматизации. Наиболее широкое распространение во всем мире в последние годы получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Как известно, метод ПЦР включает в себя три основных этапа: выделение ДНК и РНК, собственно реакцию амплификации и визуализацию результатов реакции. В основе метода лежит многократное увеличение количества копий специфического участка ДНК или РНК инфекционного агента путем полимеразной достройки с помощью термофильного фермента Taq-полимеразы двух олигонуклеотидов-праймеров, ориентированных навстречу друг другу. В случае детекции РНК последняя предварительно переводится в ДНК путем обратной транскрипции (РТ). В свою очередь этап выделения ДНК и РНК состоит из следующих стадий: лизис биологического материала, экстракция или осаждение ДНК или РНК и получение очищенной ДНК или РНК.

Одна из основных проблем на пути внедрения метода генотестирования и связана с необходимостью ускорения и упрощения первой стадии анализа - выделением ДНК и РНК (НК) любого происхождения в пригодной для ПЦР форме. Эта проблема особенно актуальна для РНК-содержащих вирусов в связи с нестойкостью РНК из-за рибонуклеазного гидролиза.

Известен способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационной диагностики путем лизиса образца, многократной экстракции водонасыщенным фенолом или смесью фенол-хлороформ и осаждение ДНК этанолом в присутствии ацетата натрия (Мазин А.В. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990, c. 13-14).

Известен также способ выделения ДНК из биологического материала путем лизиса образца раствором гуанидинтиоционата, содержащим ЭДТА и Triton X-100, после чего проводят сорбцию ДНК из раствора на сорбенте. Сорбент отмывают последовательно раствором гуанидинтиоционата, 70%-ным этанолом и ацетоном и затем проводят элюцию ДНК с сорбента ТЕ-буфером (Boom R., Sol C. J. A et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J. Clin. Microbiol., 1990, v.28, N 3, p.495-503).

Однако данные методы в одном случае не позволяют добиться необходимой степени очистки целевой ДНК от многих присутствующих в образцах примесей - ингибиторов ПЦР, a в другом случае провести эффективный лизис биологических образцов, содержащих плотныe ткани.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационного анализа путем лизиса биологического материала 6M NaI и N-лауроилсаркозинатом и осаждения изопропанолом (Masaki Ishizawa et al. Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucleic Acids Research, 1991, vol. 19, N 20, p.5792).

Метод был предложен только для выделения ДНК, конкретно для ДНК вируса гепатита.

Целью изобретения является ускорение и упрощение генамплификационной диагностики за счет одновременного выделения ДНК и РНК в процессе подготовки биологического материала и проведения ПЦР-анализа одной и той же пробы.

Поставленная цель достигается тем, что для наиболее полного и одновременного выделения вирусных бактериальных и клеточных ДНК и РНК лизис биологического материала осуществляют раствором 6M NaI, содержащeм РНК-носитель, при этом раствор полученных ДНК и РНК пригоден как для ДНК-ПЦР, так РТ-ПЦР.

Подобная подготовка биологического материала для ПЦР-анализа обеспечивает сохранность нестабильной РНК, концентрирование ДНК и РНК в малом объеме и удаление ингибиторов ПЦР, а также позволяет выявлять истинных вирусоносителей с высокой точностью.

Способ осуществляется следующим образом.

Лизирующий раствор, содержащий 6M NaI и 20-50 мкг/мл РНК-носителя вносят по 550 мкл в пробирки на 1,5 мл и добавляют в каждую пробирку по 200 мкл исследуемого биологического материала и перемешивают пипетированием. Инкубируют смесь в течение 15 мин при 60^oC. К полученному лизату добавляют 750 мкл (равный объем) изопропанола, перемешивают и ставят на 15 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин, тщательно удаляют супернатант. Рекомендуется остатки супернатанта собрать на дне кратким (3-5 с) центрифугированием и еще раз отсасать. Обмывают осадок и стенки пробирки 0,5 мл промывочного раствора ацетона. Центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин, тщательно отсасывают супернатант. Осадок высушивают на воздухе, открыв пробирки и положив их горизонтально на стол. Отбирают в новую пробирку ТE- или РТ-буфер для растворения из расчета 31 мкл на пробу и добавляют к нему ингибитор рибонуклеаз (RNA sin, 40 units/ul) из расчета 0,2 мкл на пробу и перемешивают. Добавляют полученную смесь по 30 мкл к сухим осадкам и перемешивают на вортексе. Как правило, осадок полностью не растворяется (он содержит на только ДНК и РНК), при перемешивании он должен отделиться от дна пробирки. Оставляют пробирки на 15 мин при комнатной температуре. Для анализа следует использовать только жидкую фазу, поэтому перед каждым отбором центрифугируют 1 мин при 12000 об/мин для отделения осадка.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Сыворотку крови здорового донора и носителя HCV обрабатывали в пробирках Эппендорфа, пронумерованных по количеству проб. 200 мкл смешивали с 300 мкл лизирующего раствора и инкубировали в течение 15 мин при 60^oC. Полученный лизат смешивали с равным объемом изопропанола и оставляли на 15 мин, центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин для осаждения ДНК и РНК. Осадок промывали 0,5 мл ацетона, суспендируя его на вортексе. Центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин и высушивали в вакууме. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 1, где показана электрофореграмма продукта РТ-ПЦР РНК HCV, изолированной из сывороток крови однопробирочным методом (дорожки 1 и 2 - сывортки HCV-носителей, дорожка 3 - сыворотка здорового) и фенол-хлороформгуанидинтиоционатным методом (дорожки 5 и 6 - сыворотки тех же HCV-носителей, дорожка 4 - сыворотка того же здорового).

Пример 2.

Сыворотку крови здорового донора и сыворотку крови, содержащую аликвоту РНК ВИЧ, обрабатывали как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 2, где показана электрофореграмма продукта РТ-ПЦР РНК ВИЧ, выделенной из сыворотки, содержащей аликвоту РНК ВИЧ (дорожка 2) и из сыворотки, не содержащей РНК ВИЧ (дорожки 1 и 3). В пробу 4 РНК ВИЧ внесена не в сыворотку а непосредственно. Верхний сигнал соответствует 10 молекулам внутреннего стандарта, сигнал ВИЧ расположен ниже.

Пример 3.

Серонегативную плазму крови и плазму крови носителя вируса гепатита B обрабатывали как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 3, где показана детекция вируса гепатита В путем двукратной гнездовой ПЦР в присутствии 10 молекул внутреннего стандарта (его сигнал на электрофореграмме указан стрелкой, сигнал вирусной ДНК расположен ниже) после выделения однопробирочным методом из 200 мкл плазмы крови. Дорожки 1-3 - анализы минипулов серонегативной плазмы, 4 - отрицательный контроль (вода), 5 - положительный контроль - плазма крови носителя вируса гепатита В, разбавленная в 1000 раз неинфицированной плазмой.

Пример 4.

Проводили анализ различных вакцинных препаратов в том числе содержащих ДНК из культуры Brucella bovis. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 4, где показана детекция ДНК Brucella bovis путем однократной ПЦР после выделения однопробирочным методом. 5 и 6 - соответственно положительный (раствор ДНК из культуры Brucella bovis) и отрицательный (вода) контроли. Сигнал ДНК возбудителя на электрофореграмме указан стрелкой. 1-4 анализы различных вакцинных препаратов.

Пример 5.

Проводили исследование антигенных участков тромбоцитов путем аллельспецифичной ПЦР на суммарной лейкоцитарной ДНК, выделенной как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 5, где показано генотипирование антигенных участков 2, 3 и 4 тромбоцитов путем аллель-специфичной ПЦР на суммарной лейкоцитарной ДНК, выделенной однопробирочным методом. Сигналы на уровне двух стрелок указыввают на наличие аллели a, b или обеих (ab), так что для данного донора генотип по этим участкам определен как 2 ab, 3a, 4a. Расположенный выше сигнал соответствует маркерному гену (в данном случае - гормона роста) и указывает на нормальное протекание ПЦР по всех пробах.

Как видно из конкретных примеров, предложенная обработка биологических материалов и их ПЦР-анализ позволяют быстро и надежно выявлять вирусо- и бактерионосительство даже у клинически здоровых серонегативных лиц.

Таким образом, применение подготовки биологических материалов предложенным способом позволяет ускорить время исследования без снижения чувствительности ПЦР теста. Чувствительность и специфичность ПЦР близки к предельно возможной, а результаты получают в течение одного дня. Данная обработка позволяет использовать для ПЦР практически любой материал: гистологические препараты, сухие пятна крови и тканей, количество исследуемого материала во многих случаях составляет несколько микролитров. Стоимость анализа ниже по сравнению с бактериологическими и иммунологическими методами при использовании отечественных реагентов и внедрении технологии ПЦР-минипулов.