способ выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью

Формула изобретения

Способ выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью, состоящий из внесения источника микроорганизмов в среду, содержащую в качестве единственного источника углерода соответствующий субстрат, культивирования и последующего выделения, отличающийся тем, что для выделения штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве источника углерода одновременно несколько токсикантов, аликвоту сточных вод, смывы с водотоков или иной источник микроорганизмов, смешивают с расплавленной полужидкой агаризованной синтетической минимальной средой М9 (45 - 47^oС), которую наслаивают на поверхность агаризованной синтетической минимальной среды М9 (1,5 - 2%), а токсикантами пропитывают бумажные диски, 5 - 6 мм в диаметре (каждый токсикант на отдельном диске), которые накладывают на поверхность застывшей полужидкой агаризованной синтетической минимальной среды, инкубируют чашки при температуре 28 - 30^oС в течение недели с ежедневным просмотром, а выросшие изолированные колонии микроорганизмов, способные в качестве источника углерода и энергии использовать несколько токсикантов, отбирают в зоне наибольшей концентрации утилизируемых токсикантов, чем осуществляется селекция наиболее активных клонов данных микроорганизмов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экологической микробиологии и может быть использовано при создании штаммов-деструкторов токсических отходов производственных и бытовых стоков.

Для эффективной микробиологической детоксикации производственных и бытовых стоков необходимы микроорганизмы-деструкторы с широким спектром субстратной активности. В настоящее время для выделения таких штаммов используют несколько методов:

1 - метод градиентных чашек (Готовят двухслойные чашки следующим образом: агаризованная синтетическая минимальная среда M9 (Миллер Д., 1976), содержащая токсикант, наливается в чашку Петри, расположенную наклонно по отношению к поверхности стола. После отверждения среды чашку располагают горизонтально и наслаивают равный объем этой же среды без токсиканта). После суточного выдерживания чашки для формирования градиента концентрации токсиканта на ее поверхность помещают смывы, сточные воды или микроорганизмы с предполагаемыми искомыми свойствами равномерно распределяют их по всей поверхности. Чашки инкубируют и после появления бактериального роста клоны, выросшие в зоне большей концентрации токсиканта, пересевают на аналогичные чашки с большей концентрацией токсиканта с целью получить высокоактивные штаммы-деструкторы.

2 - метод накопительных культур (навеску почвы или иного субстрата помещают в колбу с минимальной синтетической средой M9, в которую в качестве источника углерода и энергии добавляют токсикант и культивируют при определенных условиях температуры и аэрирования. Периодически производят перенесение аликвоты суспензии в свежую порцию минимальной среды с добавками токсиканта заданной концентрации. После многократного повторения этой процедуры высевают по 0,1 - 0,2 мл культуральной среды на чашки с твердой минимальной средой, содержащей в качестве единственного источника углерода используемый токсикант. Выросшие микроорганизмы смывают в минимальном объеме и вносят в минимальную среду, содержащую токсиканты в более высокой концентрации. Весь цикл манипуляций повторяют неоднократно, пока не достигают максимально высокой концентрации токсиканта в минимальной среде (Кочетков В.В., В.В. Балакшина, А.В. Наумов, В.Г. Грищенков, А.М. Боронин. Выделение и характеристики бактерий деструкторов пестицидов //Прикладная биохимия и микробиология, 1997, том 33, N 3, с. 310-313). Далее получают изолированные клоны штаммов-деструкторов и при необходимости их идентифицируют).

Метод градиентных чашек так же как и методы накопительных культур позволяют путем многократного пассирования проводить селекцию микроорганизмов, утилизирующих токсиканты в достаточно высоких концентрациях. Однако эти методы не позволяют получать микроорганизмы-деструкторы, способные утилизировать несколько токсикантов, так как хотя в минимальной среде и могут находиться несколько токсикантов, нельзя установить, к какому (-им) токсикантам имеется субстратная специфичность у выросшей культуры. Эти методы не позволяют определить уровень устойчивости выделяемых штаммов-деструкторов к токсическому воздействию используемых токсикантов, а также проводить селекцию более активных их клонов с полисубстратной специфичностью.

Целью настоящего изобретения является создание ускоренного и менее трудоемкого способа выделения микроорганизмов, способных к утилизации одновременно нескольких токсикантов, а также отбор наиболее устойчивых вариантов этих микроорганизмов, которые могут найти широкое применение при деструкции производственных и бытовых стоков, имеющих широкий спектр токсических веществ.

Поставленная цель достигается следующим образом: на пластинку агаризованной (1,5 - 2%) минимальной среды (синтетическая минимальная среда M9 наслаивается полужидкая (0,4 - 0,6%) агаризованная минимальная среда M9, содержащая аликвоту субстрата из возможных источников с микроорганизмами, обладающих способностью использовать в качестве единственного источника углерода токсиканты. После отвердения полужидкого агара на его поверхность накладываются бумажные диски 5-6 мм в диаметре, пропитанные растворами различных токсикантов. Чашки инкубируют при заданной температуре в течение 1-2 недель с ежедневным просмотром. При появлении колоний выросших вокруг бумажных дисков с различными токсикантами производят их отсев и далее вносят в полужидкий агар, повторяя выше описанную процедуру. Полученные микроорганизмы, обладающие одномоментной способностью использовать в качестве единственного источника углерода несколько токсикантов, при необходимости идентифицируют.

Пример 1: проводилось выделение микроорганизма, обладающего способностью использовать в качестве источников углерода фенол и формальдегид. Сточные воды, вытекающие из реактора очистных сооружений АО "Каустик" г. Волгоград, в объеме 0,2 мл были смешаны с 3 мл расплавленной агаризованной (0,5% агара) минимальной среды M9 и наслоены на поверхность агаризованной (1,5% агара) минимальной среды M9 в чашке Петри. После отвердения полужидкого агара на его поверхность поместили бумажные диски: 1 - пропитанный раствором фенола (100 мкг/мл), 2 - раствором формальдегида с аналогичной концентрацией. Чашки инкубировали при 28 ^oC. Через 5 дней инкубирования вокруг бумажных дисков, пропитанных фенолом и формальдегидом, появился кольцевой рост микроорганизмов в виде сплошного газона в дистальной части кольца и в виде отдельных колоний вблизи к краям бумажного диска. Полученный микроорганизм был идентифицирован. По родовым признакам он отнесен к Pseudomonas sp. и получил название Pseudomonas sp. ВДК. Pseudomonas sp. ВДК после проведенной селекции был способен утилизировать смесь фенола и формальдегида с исходной концентрацией 450-500 мкг/мл соответственно.

Пример 2: проводилось выявление штаммов микроорганизмов, относящихся к непатогенным видам псевдомонад, которые могли бы использовать фенол и формальдегид как питательный субстрат. Суспензия суточной агаровой культуры в объеме 0,2 мл была смешана с 3 мл расплавленной агаризованной (0,5% агара) минимальной среды M9 и наслоена на поверхность агаризованной (1,5% агара) минимальной среды M9 в чашке Петри. После отведения полужидкого агара на его поверхность поместили бумажные диски: 1 - пропитанный раствором фенола (100 мкг/мл), 2 - раствором формальдегида с аналогичной концентрацией. Чашки инкубировали при 32^oC. Проверка 70 штаммов бактерий, относящихся к непатогенным видам рода Pseudomonas из коллекции микроорганизмов ВолгНИПЧИ, выявила штамм, который через 5 дней инкубирования сформировал кольцевой рост вокруг бумажных дисков, пропитанных фенолом и формальдегидом. Штамм, получивший название P. cepacia ВДК, мог утилизировать смесь фенола и формальдегида до нетоксических продуктов.