способ обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита

Формула изобретения

Способ обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С класса IgM (анти-BГCcore IgM) в сыворотке крови путем контакта исследуемой сыворотки с антигеном и конъюгатом, отличающийся тем, что в качестве антигена используют синтетический пептид структуры

NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-

Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-

GIy-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-

Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-

Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂,

в качестве конъюгата - моноклональные антитела против Ig M человека, меченные пероксидазой хрена, причем время контакта сыворотки с антигеном составляет 0,5-18 ч, а с конъюгатом - 0,5-1,0 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может найти применение при диагностике гепатита C.

Известен иммунотест для обнаружения HCV IgM антител в тест-пробе (см. заявка PCT 93/20445, 14.10.93, кл. G 01 N 33/563). Тест-пробу приводят в контакт по меньшей мере с одним антигеном HCV, инкубируют для образования комплексов антиген (АГ) с антителом (АТ) и затем приводят в контакт с индикаторным реагентом для продуцирования детектируемого сигнала. Количество HCV IgM, присутствующих в тест-пробе, пропорционально генерируемому сигналу.

Однако в указанном иммунотесте в качестве основы (антигена) используется ядерный белок вируса гепатита C, полученный с помощью рекомбинантной технологии. Получение такого белка в очищенном виде достаточно сложно и трудоемко, так как сопряжено с разработкой штаммов-продуцентов и специальной технологии очистки. Химический синтез пептида, структура которого соответствует антигенным детерминантам ядерного белка вируса, значительно упрощает и существенно ускоряет получение результата. Кроме этого, вышеуказанный способ не позволяет использовать в качестве основы иммуносорбента микропланшеты, которые широко применяются в настоящее время для диагностики различных патологических состояний.

Изобретение направлено на разработку способа обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита C класса IgM в сыворотке крови, который позволяет квалифицировать активно текущую вирусную инфекцию. Обеспечена ранняя диагностика гепатита C, а также достаточно высокая чувствительность за счет выявления большого числа позитивных сывороток. Упрощено и существенно ускорено получение результата. Имеется возможность использовать микропланшеты в качестве основы иммуносорбента.

Способ основан на применении метода иммуноферментного анализа. Для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита С (анти-ВГСcore IgM) в сыворотке крови необходимо обеспечить контакт исследуемой сыворотки с антигеном и конъюгатом.

Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляется за счет их взаимодействия со специфическим синтетическим пептидом, сорбированным на поверхности лунок полистироловых стрипов. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляется с помощью пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител к тяжелой цепи IgM человека после добавления субстратного раствора.

В качестве антигена используют синтетический пептид структуры

NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-

Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-

Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-

Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-

Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂.

Выбор пептида осуществлялся из 18 коротких пептидов (16-20 аминокислотных остатков) и 3 длинных (35-80 аминокислотных остатков), соответствующих предлагаемым антигенным детерминантам структурных белков (ядерного-core и поверхностного env) и неструктурных белков NS3, NS4, NS5 вируса ГС.

Специфичность реагирования указанных антигенных участков вирусного протеина с сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к вирусу ГС (анти-ВГС), оценивалась в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием аттестованных в зарубежных скрининговых (Abbbott HCV 2.0 EAI, UBI HCV EAI) и подтверждающих тестах (LiaTek HCV, Wellcozyme HCV immunoblot) панелей сывороток.

Авторами установлено, что значительная часть синтезированных пептидных фрагментов полипротеина вируса ГС специфично реагирует с анти-ВГС-позитивными сыворотками, однако с различной частотой и интенсивностью. Наиболее часто сыворотки реагировали с пептидами-антигенными детерминантами ядерного белка (HCV1, HCV2, HCV23) и неструктурного белка NS4. Специфично, но с меньшей частотой и интенсивностью, с сыворотками реагировали пептиды HCV4 и HCV6 (NS4), HCV3 (поверхностный белок) HCV13, HCV14, HCV25 (NS5).

Выявление комплекса антиген-антитело осуществляется с помощью конъюгата антител к ядерному белку вируса ГС с пероксидазой хрена. Наиболее эффективно применять для данных целей - моноклональные антитела против IgM человека, меченные пероксидазой хрена.

Проведенные исследования показали, что время контакта сыворотки с антигеном составляет 0,5-18 часов, а с конъюгатом - 0,5-1,0, что соответствует длинной и короткой схеме постановки ферментативной реакции.

Специфичность тест-системы оценивалась по следующим параметрам:

- отсутствие перекрестных реакций с антителами класса IgM к ядерному антигену вируса гепатита B (ГВ), к вирусу гепатита A (ГА),

- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных инфекционных больных, этиологически не связанных с вирусами гепатитов (ВИЧ-инфицированных),

- отсутствие реакции у анти-ВГС-негативных доноров крови,

- отсутствие реакции у больных вирусными гепатитами в динамике,

- корреляционная связь между обнаружением анти-ВГСcore IgM и РНК вируса ГС при обследовании больных вирусными гепатитами.

Оценка диагностической ценности проводилась по частоте выявления анти-ВГСcore IgM у больных острым гепатитом C (ГС), хроническим ГС с манифестацией патологического процесса, анти-ВГС-позитивных доноров крови.

Изобретение может быть реализовано следующим образом.

В тест-системе использовали иммуносорбент, представляющий собой полистироловые планшеты (стрипы), лунки которых покрыты синтетическим пептидом

NH₂-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-

Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-

Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Cln-Ile-

Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-

Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-CONH₂

Источник: core белок вируса гепатита C, фрагмент 11-45.

Заявленный пептид получают твердофазным методом с последовательным наращиванием пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензола, -аминогруппы аминокислот блокируют трет-бутилоксикарбонильными группами. Для защиты боковых радикалов трифункциональных аминокислот используют следующие группы: для лизина - 2-хлорбензилоксикарбонильную; для гистидина - тозиильную; для треонина, глютаминовой кислоты - соответствующие бензиловые эфиры; для аспарагиновой кислоты - циклогексиловый эфир; для аргинина - мезитиленсульфонильную; для тирозина - 2,6-дихлорбензильную. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-оксибензотриалоза. Деблокирование ведут с помощью 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в среде CH₂Cl₂, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропиламина в CH₂Cl₂. Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью HF, а очищают гель- и обращеннофазовой хроматографией.

Метод получения пептидов твердофазным методом описан в работе Barany G., Merrifield R. B. Solid-phase peptide synthesis. In: Peptides. Analysis, Synthesis, Biology. Eds. : Gross E., Meienhofer J., N.Y.-Academic Press. - 1980. - Vol. 2. - p. 3-285.

Пример 1. Для синтеза пептида указанной формулы загружают в реакционный сосуд 0,5 г бензгидриламинополимера. Содержание аминогрупп 1 мМ/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (на присоединение одной аминокислоты, см. табл. 1).

Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5. В случае отрицательного теста производят присоединение следующего аминокислотного остатка, проходя программу с п. 1.

По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. Выход 2.4 г (60% от теории). 1 г пептидил-полимера переносит в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 0,5 мл тиоанизола и 0,5 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78^oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0^oC и перемешивают в течение 90 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизуют. Выход с 1 г пептидил-полимера 135 мг (59%). После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 (элюент 50%-ная уксусная кислота) продукт очищают на колонке Altech Rsil C18 в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте в градиенте 20-50% ацетонитрила. Фракции, содержащие пептид, собирают и лиофилизуют. Очищенный пептид индивидуален по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка Delta PAKC 18,5 0,4 15,0 см, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1%-ная трифторуксусная кислота, градиент 20-50% ацетонитрила). Время удерживания 8,44 мин.

Данные аминокислотного анализа гидролизата пептида 4 N MSA, 115, 2 часа

Asp - 3,17 (3)

Thr - 1,96 (2)

Gly - 2,3 (2)

Ile - 0,7 (1)

Val - 2,7 (3)

Tyr - 1,01 (1)

Phe - 1,03 (1)

Leu - 3,22 (3)

Пример 2. Оценка специфичности

Для оценки специфичности испытуемой тест-системы были исследованы сыворотки 46 больных ГА (наличие только IgM анти-ВГА), 25 больных ГВ (наличие только HBsAg и анти-HBc IgM), 86 ВИЧ-инфицированных (наличие только антител к ВИЧ), 48 анти-ВГС и HBsAg-негативных доноров, 271 больного вирусными гепатитами при параллельном определении РНК ВГС и анти-ВГСcore IgM. В целом объем проведенных лабораторных исследований отражен в табл. 2. Исследования сывороток на маркеры вирусных гепатитов проводились с использованием коммерческих препаратов фирм Organon Teknika (Голландия), Murex (Великобритания), Orgenix (Израиль), Аквапаст (Россия). Определение РНК ВГС проводили по методу H. Okamoto (1992). Исследованиями установлено, что реагирования сывороток здоровых доноров с иммуносорбентом практически не наблюдалось. Распределение сывороток доноров по оптической плотности при постановке теста на анти-ВГСcore IgM в ИФА происходило в основном в области до 0,15 оптических единиц (о. е. ). Суммарно в этой области находилось 81,2% (табл. 3), а средняя оптическая плотность образцов составляла 0,099 о.е. Это свидетельствует о том, что приготовленный иммуносорбент достаточно специфичен. Лишь единичные образцы показали оптическую плотность выше 0,21 о.е.; при этом максимальное значение показателя, равное 0,234 о.е., наблюдалось в 1 из 48 образцов (2,1%). Идентичными оказались и результаты тестирования сывороток больных вирусными ГА и ГВ, а также ВИЧ-инфицированных. Средние показатели оптической плотности образцов этих категорий пациентов колебались в пределах 0,083-0,135 о.е., а максимальные значения показателей не превысили 0,3 о. е. (0,232-0,280 о.е.). Указанные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии перекрестного реагирования иммуносорбента с другими инфекционными агентами, связанными и не связанными с поражением печени. С другой стороны, полученные результаты позволили внести коррективы в формулу для расчета уровня cut off, которая в конечном виде представила собой: Средний показатель оптической плотности негативного контрольного образца +0,2 (Ср ОП НК +0,2). Этой формулой пользовались при оценке результатов тестирования сывороток на анти-ВГСcore IgM во всех последующих экспериментах.

Одним из самых достоверных критериев специфичности диагностических препаратов является соответствие результатов, полученных с помощью разработанного препарата и "золотого" стандарта (тест-системы, получившей самые высокие оценки специалистов). В случае с тест-системами на анти-ВГCcore IgM такой стандарт отсутствует. В связи с этим были проведены сопоставления результатов тестирования на анти-ВГСcore IgM в ИФА и на РНК ВГС методом ПЦР сывороток больных вирусными гепатитами. Результаты этого сопоставления представлены в табл. 4. Полное совпадение результатов отмечено в 192 образцах из 271 (70,8%), что следует признать достаточно высоким показателем при сопоставлении методов, основанных на разных принципах (определение серологических сдвигов - ИФА; определение генома вируса-ПЦР). Следует отметить, что более часто анти-ВГСcore IgM выявлялись в сыворотках позитивных по РНК ВГС (66%), чем в РНК-негативных, -26,3% (p<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности разработанной тест-системы. И, наконец, еще одним критерием специфичности тест-системы является воспроизводимость результатов при исследовании сывороток одного и того же пациента, полученных в динамике. В связи с этим было проведено исследование сывороток 23 больных (РНК ВГС и анти-ВГСcore IgM-негативных при первичном обследовании) в динамике наблюдения от 14 до 213 дней (72,1+10,7). Кратность исследования образцов, полученных на различных сроках заболевания, составила 2-6 раз (2,9+0,2), а общее число исследований - 68. При этом, во всех случаях исследуемые образцы оказались негативными по анти-ВГСcore IgM.

Пример 3. Оценка диагностической ценности

Оценка диагностической ценности разработанной тест-системы осуществлялась по частоте выявления анти-ВГСcore IgM у больных острым ГС, хроническим ГС с манифестацией патологического процесса (у 21 обследованного имелись результаты морфологического изучения биоптатов печени), анти-ВГС-позитивных доноров крови (объем исследований представлен в таблице 1). Указанные группы пациентов были параллельно обследованы на наличие маркеров вирусного ГС с помощью других тестов (скрининговые тесты на наличие анти-ВГС, иммуноблотинг - для установления спектра антител к различным белкам вируса ГС, ПЦР для выявления РНК ВГС). Особую группу составили 42 больных различными формами ГС, которые получали антивирусную терапию (интерферон, ретровир, TMZ). Эти больные были обследованы на анти-ВГСcore IgM в динамике от 2 до 6 раз, а сроки наблюдения колебались в пределах 10-200 дней.

Установлено, что при остром ГС анти-ВГСcore IgM выявлялись у 86,7% больных в первые две декады болезни. Следовательно, определение антител класса IgM является полезным для объективизации диагноза острого ГС, наряду с другими клинико-лабораторными данными. Предполагая, что анти-ВГСсore IgM появляются раньше соответствующих антител класса IgG, было проведено тщательно изучение сывороток, полученных от 13 больных острым ГС, оказавшихся РНК ВГС и анти-ВГСcorе IgM-позитивными. Дополнительно были использованы скрининговые тесты на наличие анти-ВГС (выявляют антитела класса IgG) и иммуноблотинг. Результаты сопоставления всех четырех тестов представлены в табл. 5. 2 из 13 образцов оказались отрицательными как в скрининговом тесте, так и в иммуноблотинге. Кроме этого, в двух случаях при наличии позитивного результата в скрининговой тест-системе иммуноблотинг оказался неопределенным. Это подтверждает ценность теста на анти-ВГСcore IgM для диагностики острой ГС-инфекции. Сопоставление спектра антител к различным белкам вируса ГС и анти-ВГСcore IgM позволяет сделать заключение, что при острой ГС-инфекции имеется корреляционная связь только по антителам к ядерному белку вируса, что также подтверждает и специфичность разработанного препарата.

У больных хроническим ГС с манифестацией процесса анти-ВГСcore IgM выявлялись в 61,2%. Сопоставление 4 тестов на различные маркеры вирусного ГС, проведенное на материале 12 больных хроническим ГС с наличием анти-ВГСcore IgM, показало, что РНК ВГС присутствовала в 9 образцах (табл. 6). Поскольку антитела класса IgM циркулируют более длительно, чем РНК, можно предположить, что в подобных случаях они являются единственным доказательством имевшей место репродукции вируса. Указанное подчеркивает диагностическую ценность теста на анти-ВГСcore IgM у больных с хроническими формами инфекции. Можно отметить, что во всех образцах сывороток больных хроническим ГС наблюдались значительные количества антител к ядерному белку вируса класса IgG (3-4 балла по иммуноблотингу). Кроме этого, имела место корреляционная связь между РНК ВГС, антителами к белку NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза) и анти-ВГСcore IgM. Указанное свидетельствует, что анти-ВГСcore IgM отражают наличие активной вирусной репродукции у больных хроническим ГС. При наличии последней у больных хроническим ГС можно ожидать и более интенсивных изменений в ткани печени, объективным критерием которых являются результаты прижизненного морфологического изучения биоптатов печени. Результаты изучения биоптатов были доступными у 21 больного. При этом у 7 из них в сыворотке крови обнаруживались анти-ВГСcore IgM, а у 14 - нет. У большинства больных при наличии анти-ВГСcore IgM в сыворотке имело место значительное изменение архитектоники печени, укладывающееся в картину ХАГ (71,4) или цирроза печени (14,3%). В противоположность этому вторая группа (анти-ВГСcore IgM-негативная) была в основном представлена больными хроническим персистирующим гепатитом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости использования антивирусных препаратов для подавления репродукции вируса у больных анти-ВГСcore IgM-позитивных хроническим ГС. Можно предполагать, что при эффективности такого лечения вслед за исчезновением РНК ВГС должны исчезать и антитела класса IgM к ядерному белку вируса. В связи с этим было осуществлено динамическое наблюдение за 42 больными ГС, получавшими антивирусную терапию. В зависимости от динамики анти-ВГСcore IgM все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 18 человек, у которых зафиксирована положительная (исчезновение анти-ВГСcore IgM) динамика. Длительность наблюдения составила в среднем 84,6 дня, а кратность обследования - 3,3 раза. У большинства больных этой группы наблюдалась стойкая ремиссия и нормализация биохимических показателей. Вторую группу составили 20 больных, у которых в динамике наблюдения постоянно обнаруживались анти-ВГСcore IgM. Длительность наблюдения составила в среднем 54,9 дней, а кратность обследования 3,1. У больных этой группы, как правило, нормализации клинико-биохимических показателей не наступало, что свидетельствует о неэффективности использованного для лечения препарата. И, наконец, в 3 группу вошли 4 больных, у которых имела место флюктуация анти-ВГСcore IgM. За такими больными необходимо более длительное наблюдение.

Таким образом, результаты динамического наблюдения за больными ГС с использованием теста на анти-ВГСcore IgM позволяют с одной стороны оценить эффективность лечения, а с другой - свидетельствуют о воспроизводимости разработанного метода, что свидетельствует о его специфичности.

Последнюю группу для оценки диагностической значимости определения анти-ВГСcore IgM составили 66 доноров крови-позитивных по анти-ВГС при скрининговом тестировании. С использованием иммуноблотинга наличие анти-ВГС было подтверждено у 45 доноров (68%), в 3 случаях установлен неопределенный результат, а 18 позитивных в скрининге результатов не подтвердились иммуноблотингом. Анти-ВГСcore IgM были выявлены в 20 образцах от подтвержденных в иммуноблотинге доноров (44%), в одном из 3 сомнительных образцов и в 1 отрицательном образце (5,4%). Позитивные результаты по анти-ВГСcore IgM в двух последних группах свидетельствуют о необходимости более тщательного обследования и наблюдения за донорами, позитивными по анти-ВГС в скрининговых тестах. Выборочное исследование сывороток 13 анти-ВГС-позитивных доноров (табл. 7) на РНК ВГС позволило установить ее наличие в 9 образцах (69,2%). В этой группе сывороток оказалось 6 образцов положительных по анти-ВГСcore IgM. Во всех случаях они содержали и РНК ВГС в ПЦР, т.е. наблюдалась 100% корреляция результатов. Полученные результаты свидетельствуют о высоком проценте хронической персистирующей инфекции среди доноров-"носителей" анти-ВГС и их потенциальной опасности для окружающих. Наличие анти-ВГСcore IgM у этих лиц можно квалифицировать как признак активной репродукции вируса.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа (ИФА).

Выявление IgM-антител к ядерному белку вируса гепатита C в сыворотке крови осуществляют методом иммуноферментного анализа.

1. Подготовка реагентов.

2. Гидратация сорбированного антигена. Отобранные стрипы с сорбированным пептидом помещают в рамку держателя и промывают 1 раз раствором ФСРТ (концентрат фосфатно-солевого раствора). Лунки заполняют до краев, а затем раствор вытряхивают или удаляют насосом.

3. Связывание антител. Одну из лунок (А1) оставляют незаполненной (контроль субстрата). В две лунки вносят по 0,1 мл раствора НК (сыворотка, не содержащая IgM-антител к вирусу гепатита C, инактивированная прогреванием), в последующие две лунки - по 0,01 мл раствора ПК (сыворотка, содержащая IgM-антитела, инактивированная прогреванием). Во все остальные лунки вносят при короткой схеме по 90 мкл раствора РИП (раствор для разведения исследуемых проб), а затем - 10 мкл исследуемых сывороток, тщательно пипетируя раствор (не менее 3 раз). При этом цвет раствора меняется. Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре 371^oС в течение 202 мин во влажной камере. При длинной схеме постановки исходную сыворотку разводят 1:100, инкубируют при 4^oC в течение 16-18 часов. После инкубации лунки промывают 3-кратно раствором ФСРТ.

4. Присоединение конъюгата. Во все лунки кроме A1 вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (моноклональные антитела к тяжелым цепям IgM человека, меченные пероксидазой). Планшет закрывают крышкой или помещают во влажный полиэтиленовый пакет и инкубируют при температуре 371^oC в течение 302 мин.

После инкубации лунки 5-кратно промывают раствором ФСРТ.

5. Проведение ферментативной реакции. Во все лунки вносят по 0,1 мл субстратного раствора. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темноте при температуре 15-25^oC в течение 151 мин во влажной камере.

6. Остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 0,05 мл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов ИФА

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и НК должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с ПК должно приобрести желто-коричневую окраску.

Визуальный учет

Исследуемый образец оценивается как положительный, если имеются отчетливые различия в интенсивности его окрашивания по сравнению с растворами в лунках с контролем субстрата и НК.

Инструментальный учет

Измерение оптический плотности (ОП) проводят при длине волны 490 нм непосредственно в лунках стрипов с помощью вертикальных фотометров. В качестве кюветы сравнения служит лунка A1 с контролем субстрата. При правильном проведении анализа среднее значение ОП в лунках с НК не должно превышать 0,15 оптических единиц (о.е.), а в лунках с ПК должно быть не менее 0,5 о.е.

Количественная оценка результатов ИФА проводится по формуле:

K = 0.2 + Среднее значение ОП для НК

Если ОП исследуемой пробы больше K, то считают, что она содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C.

Если ОП исследуемой пробы меньше или равно K, то считают, что она не содержит IgM-антитела к ядерному белку гепатита C.

Схема постановки ИФА с учетом изменения временных параметров и полученных результатов приведена в табл. 8.