способ обнаружения антитела в пробе с использованием хемилюминесцентного соединения и способ измерения концентрации и/или относительного содержания специфического антитела в пробе

Формула изобретения

1. Способ обнаружения иммуноглобулинового антитела в пробе с использованием хемилюминесцентного соединения, включающий проведение иммуноанализа, отличающийся тем, что смешивают лигандный антиген, антитело или гаптен, связанные с биотином или его функциональным производным, антитело, направленное против детектируемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, и хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, с пробой для образования твердофазного связанного комплекса, проводят магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса, причем присутствие хемилюминесценции является указанием на присутствие упомянутого антитела в пробе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смешивают лигандный антиген, антитело или гаптен, связанные с биотином или его функциональным производным, с пробой и антителом, направленным против детектируемого антитела, связанным с парамагнитными частицами, для образования первого твердофазного комплекса, добавляют хемилюминесцентное акридиновое соединение, ковалентно связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, для образования второго твердофазного комплекса, проводят магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что антитело в пробе представляет собой специфической иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из специфического IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и их изотипов, а лигандный антиген, антитело или гаптен представляет собой специфический аллерген.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что специфический иммуноглобулин представляет собой IgE.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что антитело в пробе относится к классу иммуноглобулинов, выбранных из группы, состоящей из общего IgA, общего IgD, общего IgE, общего IgG, общего IgM и их изотипов, а лигандный антиген, антитело или гаптен представляет собой антитело, нацеленное против этого класса иммуноглобулинов.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что класс иммуноглобулинов представляет собой общий IgE.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что антитело, направленное против детектируемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, выбрано из группы, состоящей из антител поликлональных, моноклональных, в том числе рекомбинантных, фрагментированных, предпочтительно является моноклональным мышиным антииммуноглобулином.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что хемилюминесцентное акридиновое соединение представляет собой N-гидроксисукцинимиддиметилакридиновый эфир, ковалентно связанный с авидином, стрептавидином или его функциональным производным.

9. Способ измерения концентрации и/или относительного содержания специфического антитела в пробе, включающий проведение иммуноанализа, отличающийся тем, что измеренную эмиссию света отделенной твердой фазы, содержащей захваченное специфическое антитело, связанное с хемилюминесцентной меткой, сравнивают с измеренной эмиссией света, полученной в параллельном стандартном иммуноанализе, в котором измеряют общее содержание того класса антител в пробе, к которому принадлежит специфическое антитело, при этом смешивают лигандный антиген или гаптен, против которого направлено измеряемое антитело, связанный с биотином или его функциональным производным, антитело, направленное против константной части измеряемого антитела, связанного с парамагнитными частицами и хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его производным, а также с пробой для образования первого твердофазного комплекса, проводят магнитное отделение первой твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции и измерение эмиссии света отделенной первой твердой фазы, затем смешивают лигандное антитело, направленное против класса измеряемых антител, связанное с биотином или его функциональным производным, антитело, направленное против константной части класса измеряемых антител, связанное с парамагнитными частицами и хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, а также с пробой для образования второго твердофазного комплекса, проводят магнитное отделение второй твердой фазы от жидкой фазы, инициирование хемилюминесцентной реакции, измерение эмиссии света отделенной второй твердой фазы и сравнивают эмиссии света первой твердой фазы с эмиссией света второй твердой фазы.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что смешивают лигандный антиген или гаптен, связанный с биотином или его функциональным производным, с пробой и антителом, связанным с парамагнитными частицами, для образования твердофазного комплекса, добавляют хемилюминесцентное акридиновое соединение, связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, для образования первого твердофазного комплекса, затем смешивают лигандное антитело, связанное с биотином или его функциональным производным, с пробой и антителом, связанным с парамагнитными частицами, с образованием твердофазного комплекса и добавляют хемилюминесцентное акридиновое соединение, ковалентно связанное с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, для образования второго твердофазного комплекса.

11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что специфическое антитело, которое должно быть измерено в пробе, является специфическим иммуноглобулином, выбранным из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и их изотипов, а лигандный антиген, антитело или гаптен, направленные против вариабельной области данного антитела, представляет собой аллерген, класс антител представляет собой класс иммуноглобулинов, выбранных из группы, состоящей из общего IgA, общего IgD, общего IgE, общего IgG, общего IgM и их изотипов, и лигандный антиген, антитело или гаптен представляет собой антитело, направленное против этого класса иммуноглобулинов.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что специфический иммуноглобулин представляет собой специфический IgE, а класс антител - общий IgE.

13. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что антитело, направленное против измеряемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, выбрано из группы, состоящей из поликлональных антител, в том числе антител рекомбинантных, фрагментированных, предпочтительно представляет собой моноклональный мышиный антииммуноглобулин.

14. Способ по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что хемилюминесцентное акридиновое соединение представляет собой N-гидроксисукцинимиддиметилакридиновый эфир, ковалентно связанный с авидином, стрептавидином или его функциональным производным.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа обнаружения антитела в пробе при помощи хемилюминесцентной метки, а также способа измерения концентрации и/или относительного содержания антитела в пробе.

Более конкретно, изобретение касается применения хемилюминесцентного сложноэфирного соединения, содержащего акридин, связанного с авидином или стрептавидином, и лиганда, связанного с биотином, в двухсайтовом иммуноанализе, в котором афинный комплекс улавливается на парамагнитных частицах, что позволяет осуществить быстрое обнаружение и/или количественное измерение иммунологически активных веществ, таких как антитела, в таких пробах, как биологические пробы жидкости и ткани, пробы молока и пищевых продуктов, напитки, вода или промышленные сточные воды.

Способ обнаружения и количественного определения иммуноглобулиновых E-антител в сыворотке описан в брошюре "Specific IgE, Magic Lite SQ^TM", опубликованной Ciba Corning Diagnostics Corp. and ALK Laboratories в сентябре 1990 г. В этом способе специфический аллерген, ковалентно связанный с парамагнитными частицами, реагирует с аллерген-специфическим IgE-антителом в пробе сыворотки или плазмы. После первого периода инкубирования и отмывания несвязавшегося неспецифического IgE, добавляют антитело против IgE, меченое хемилюминесцентным, содержащим акридин, сложным эфиром. После второго периода инкубирования связанное с твердой фазой и меченое антитело измеряют в анализаторе Magic Lite Analyses (Cat. N 472733 или Cat. N 472270), который автоматически вводит реагенты, инициирующие хемилюминесцентную реакцию. При использовании этого способа только конечная стадия инициации и измерения хемилюминесценции может быть автоматизирована. Хемилюминесцентное, содержащее акридин сложноэфирное соединение описано в патенте США N 4745181.

Патент США N 4946958 описывает хемилюминесцентный, содержащий акридин, сложный эфир, связанный с N-сукцинимидильной группой, которая может быть дополнительно связана с белком или полипептидом для обеспечения иммунологически реакционноспособного люминесцентного реагента. Этот реагент можно использовать в иммуноанализе, который может предусматривать одновременное связывание твердофазного антитела, молекулы антигена и меченого антитела, отделение и промывание твердой фазы и количественное измерение люминесценции твердой фазы. Strasburer et al. описывает в Methods in Enzymology, 184 (1990), pp. 481-496 применение двухсайтового хемилюминесцентного иммуноанализа, в котором гормоны LGH и LCG улавливаются антителами, иммобилизованными на микротитровальных чашках и меченными хемилюминесцентным агентом, связанным с авидином через меченное биотином второе антитело. Антигенные аналиты, такие как белковые гормоны, могут анализироваться непосредственно из проб сыворотки и сравниваться со стандартными кривыми. Однако концентрация иммуноглобулинов, таких как IgE, чрезвычайно зависит от конкретного больного, и анализ специфического IgE следует сравнивать с индивидуальным уровнем общего IgE этого больного, и, следовательно, требуется анализ, имеющий больший динамический диапазон, чем получаемый в анализе по Страсбургеру.

EP A 0425217 описывает гибридизационный анализ, в котором образуется хемилюминесцентный комплекс, содержащий нуклеиновую кислоту, гибридизированную с первым меченым нуклеотидным зондом, связанным с парамагнитными частицами, и второй нуклеотидный зонд, меченный биотином и связанный с авидин-акридиновым эфиром. Однако специалист в данной области, знакомый с проблемой обеспечения полностью автоматизированного способа детектирования антител, будет искать способ, который можно проводить в контейнере для одной реакции и предпочтительно в условиях окружающей среды. Анализ, представленный здесь, существенно отличается, т.к. он применяет детектирование специфических нуклеотидных последовательностей, которые не являются антигенами, против которых могут быть выработаны антитела. Более конкретно, в этом анализе необходимо использовать повышенные температуры для гибридизации и гаптен-олигонуклеотидный зонд, который не является ни обязательным, ни желательным в иммуноанализах.

До настоящего времени иммуноанализы для количественного определения иммунологически активных молекул, таких как иммуноглобулины (например, специфический иммуноглобулин-E), в биологических жидкостях, таких как сыворотка, осуществляли вручную, например твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или полуавтоматически. Обычная продолжительность полуавтоматического иммуноанализа, такого как Magic Lite SQ^TM специфического анализа для IgE, указанного выше, равна приблизительно 2 часам.

Кроме того, коммерческие специфические тесты на IgE (CAP, RAST, поставляемые Pharmacia Uppsala) и специфический тест на IgE Magic Lite 5Q используют стандартный анализ общего (тотального) IgE, имеющий неидентичный протокол, что приводит к неточным данным. Можно сравнивать только анализы, использующие одинаковые процедуры связывания и детектирования. Например, все кривые ответной реакции специфического IgE должны идти параллельно кривым ответа общего IgE. Причиной является то, что требуемый динамический диапазон для анализа специфического (или общего?) IgE составляет 2 декады, а требуемый динамический диапазон для анализа общего IgE составляет 2 - 7 декад, а существующие иммуноанализы не позволяют измерять концентрации во всем диапазоне. Поэтому до настоящего времени было необходимо использовать разные протоколы анализов на специфический и общий иммуноглобулин, с применением различных реагентов.

Вследствие растущего интереса к безопасности лабораторных процедур возникла потребность в полностью автоматизированном способе обнаружения веществ, таких как антитела, в биологических жидкостях, таких как сыворотка человека, плазма, кровь, молоко, моча или слюна, который бы снизил до минимума риск контакта с вредными жидкостями. Кроме того, распространение лабораторных тестов в диагностике требует способов короткой продолжительности, предпочтительно всего лишь несколько минут.

Таким образом, задачей изобретения является обеспечение такого способа обнаружения антитела в пробе, который является безопасным, быстрым и может быть полностью автоматизирован.

Эта задача решается способом по изобретению, предусматривающим: a) смешивание лиганда-антигена, антитела или гаптена, связанного с биотином или его функциональным производным, с антителом, направленным против упомянутого детектируемого антитела, связанным с парамагнитными частицами; с хемилюминесцентным соединением акридина, связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, и с пробой с образованием связанного с твердой фазой комплекса; b) магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы; c) инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса, причем наличие хемилюминесценции является указанием на присутствие антитела в данной пробе.

Хотя способ по изобретению можно проводить по описанным выше стадиям (a), (b) и (c), предпочтительно добавлять меченое соединение в отдельной стадии, и поэтому способ предпочтительно осуществлять со следующими стадиями: i) смешивание лиганда-антигена, антитела или гаптена, связанного с биотином или его функциональным производным, с пробой и антигеном против детектируемого антитела, связанным с парамагнитными частицами, для образования первого твердофазного комплекса; ii) добавление хемилюминесцентного соединения акридина, ковалентно связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным для образования второго твердофазного комплекса; iii) магнитное отделение твердой фазы от жидкой фазы; iv) инициирование хемилюминесцентной реакции и анализ отделенной твердой фазы на присутствие хемилюминесцентного комплекса.

Особой задачей изобретения является обеспечение полностью автоматизированного иммуноанализа для количественного определения специфических антител, таких как иммуноглобулины, в котором в качестве стандарта используют истинно параллельный стандартный иммуноанализ, применяющий идентичный протокол.

Задача количественного определения специфических антител с применением истинно параллельного стандартного иммуноанализа решается посредством способа измерения концентрации и/или относительного содержания специфического антитела в жидкой пробе, в котором измеренную эмиссию света отделенной твердой фазы, содержащей захваченное специфическое антитело, связанное с хемилюминесцентной меткой, сравнивают с измеренной эмиссией света, полученной в параллельном стандартном иммуноанализе, в котором измеряют общее содержание того же класса антител в пробе, к которому принадлежит детектируемое специфическое антитело, причем этот способ предусматривает следующие стадии:

a) смешивание лиганда-антигена или гептена, к которому направляется измеряемое антитело, связанное с биотином или его функциональным производным; антитела, направленного против константной части измеряемого антитела, связанного с парамагнитными частицами; и хемилюминесцентного соединения акридина, связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, с пробой для образования первого трведофазного комплекса; b) магнитное отделение указанной первой твердой фазы от жидкой фазы; c) инициирование хемилюминесцентной реакции и измерение эмиссии света отделенной первой твердой фазы; g) смешивание лигандного антитела, направленного против класса измеряемых антител, связанного с биотином или его функциональным производным; антитела, направленного на константную область измеряемых антител, связанного с парамагнитными частицами; и хемилюминесцентного соединения акридина, связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, с пробой для образования второго твердофазного комплекса; e) магнитное отделение второй твердой фазы от жидкой фазы, f) инициирование хемилюминесцентной реакции и измерение эмиссии света отделенной второй твердой фазой и g) сравнение эмиссии света отделенной первой твердой фазы с эмиссией света отделенной второй твердой фазы.

В предпочтительном варианте, стадию a) описанного выше способа выполняют путем (i) смешивания лиганда-антигена или гаптена, связанного с биотином или его функциональным производным, с пробой и антителом, связанным с парамагнитными частицами для образования твердофазного комплекса, и (ii) добавления хемилюминесцентного соединения акридина, связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, для образования первого твердофазного комплекса, а стадию (d) выполняют путем (i) смешивания лигандного антитела, связанного с биотином или его функциональным производным, с пробой и антителом, связанным с парамагнитными частицами, для образования твердофазного комплекса, и (ii) добавления хемилюминесцентного соединения акридина, ковалентно связанного с авидином, стрептавидином или его функциональным производным, для образования второго твердофазного комплекса.

Измеряемое специфическое антитело в пробе представляет собой предпочтительно специфический иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и их изотипов, а лиганд-антиген, антитело или гаптен, направленный против изменяющейся части этого антитела, представляет собой аллерген, а класс антител предпочтительно является классом иммуноглобулинов, выбранных из группы, состоящей из общего (тотального) IgA, общего IgD, общего IgE, общего IgG, общего IgM и их изотипов, и лигандные антиген, антитело или гаптен представляют собой антитело, направленное против этого класса иммуноглобулина.

Более предпочтительно, специфический иммуноглобулин является специфическим IgE, а класс антител представляет собой общий IgE.

Антитело, направленное против измеряемого антитела, связанное с парамагнитными частицами, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, в том числе рекомбинантных антител, фрагментированных антител, предпочтительно моноклонального мышиного антииммуноглобулина.

Настоящее изобретение имеет следующие преимущества: все реагенты можно смешивать одновременно в одной реакционной емкости, что уменьшает опасность загрязнения, ошибки и количество операций, значительно уменьшает продолжительность иммуноанализа, существенно облегчает автоматизацию процесса и улучшает его точность, сравни пример 6; количественное определение специфических антител, например, в пробе сыворотки можно выполнять в сравнении с истинно параллельным анализом общих атнтител с использованием идентичного протокола, сравни пример 3; полученные большая эффективность и чувствительность позволяют детектировать даже очень низкие концентрации иммуноглобулинов и низкие концентрации специфических иммуноглобулинов, сравни примеры 1, 2 и 7.

В предпочтительном варианте изобретение предлагает способ иммуноанализа для обнаружения антител, таких как специфические иммуноглобулины (IgA, IgE, IgG, IgM и их изотипы), в пробе, такой как сыворотка или слюна.

В частности, изобретение можно использовать в анализе для обнаружения и количественного определения специфического IgE в пробе. Если проба является жидкой, например, такой как сыворотка или плазма, она может быть добавлена непосредственно в реакционный контейнер, содержащий предпочтительно моноклональное мышиное анти-IgE антитело, связанное с суспендированными парамагнитными частицами, и специфический аллерген (лиганд), связанный с биотином, в водной среде. Биотин предпочтительно представляет собой биотин-амидокапроат-N-гидроксисукцинимида (сложный эфир) (Sigma Catalog N B2643). Если проба не жидкая, например, такая как проба ткани, ее предпочтительно гомогенизируют и суспендируют в водной жидкости. Одновременная реакция между специфическим IgE в пробе, аллергеном и моноклональным антителом против IgE в водной среде приводит к образованию конъюгата. Хемилюминесцентное меченое соединение, предпочтительно сложный эфир акридина, соединенный со стрептавидином (Sigma Catalog N 4762 (авидин-DMAE), добавляют к реакционному контейнеру, где происходит реакция связывания между авидин-DMAE и биотином, связанным с конъюгатом, и неконъюгированным аллерген-связанным биотионом. Связавшуюся с конъюгатом метку отделяют от несвязавшегося DMAE-меченого антитела магнитным разделением реакционной смеси и декантированием супернатанта. Хемилюминесценцию отделенного конъюгата измеряют, как описано в Pazzagli, M. et. al. (eds). Studies and applocations in "Biology and Medicine", J. of Bioluminescence and Chemiluminescence 4(1), 1-646, 1989.

Одновременно выполняют, как эталон (стандарт), истинно параллельный иммуноанализ общего IgE, отличающийся только тем, что в качестве лиганда применяют предпочтительно поликлональное анти-IgE антитело, связанное с биотином.

На фиг. 1 дана схема анализа специфического IgE в соответствии с изобретением, предусматривающего параллельный анализ общего IgE в качестве стандарта. Здесь (1) обозначает детектируемое специфическое IgE - антитело, (2) обозначает специфический аллерген, связанный с биотином, (3) обозначает моноклональный мышиный анти-IgE, связанный с парамагнитными частицами, (4) обозначает авидин-акридиниевый эфир и (5) обозначает стадию образования твердофазного меченого комплекса, образуемого между (1), (2), (3) и (4), которая включает в себя необязательное инкубирование, отделение и необязательное промывание, а (6) представляет собой конечную стадию инициирования хемилюминесцентной реакции и измерения эмиссии света.

В анализе стандартов общего IgE на фиг. 1 (7) обозначает IgE (WHO 75/502 ME/мл), (8) обозначает поликлональный анти-IgE связанный с биотином, (9) обозначает моноклональный анти-IgE мышей, связанный с суспендированными парамагнитными частицами, (10) обозначает авидинакридиниевый эфир и (11) обозначает стадию образования твердофазного меченого комплекса, образуемого из (7), (8), (9) и (10), которая включает в себя необязательную стадию инкубирования, стадию отделения и необязательную стадию промывания, а (12) представляет собой конечную стадию инициирования хемилюминесцентной реакции и измерения эмиссии света.

Более конкретно, иммуноанализ по изобретению может быть выполнен в полностью автоматизированном анализаторе (ACS:180), производимом Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, Mass, USA.

В предпочтительном варианте иммунологически активное детектируемое вещество является антителом, например, против пенициллина или его производных, таких как бензилпенициллин, пенициллоил и т.д., а лиганд, связанный с биотином, является гаптеном, таким как пенициллин или его производные.

Определение.

В способах по изобретению детектируемое антитело представляет собой специфический иммуноглобулин, предпочтительно специфический IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и их изотипы, более предпочтительно специфический IgE. или класс антител, таких как иммуноглобулины, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из общего IgA, общего IgD, общего IgE, общего IgG, общего IgM и их изотипов, наиболее предпочтительно общего IgE.

Под пробой подразумевают жидкую или ожиженную пробу, в том числе растворы, эмульсии, дисперсии и суспензии.

Лигандным антигеном, антителом или гаптеном, связанным с биотином, может быть любое иммунологически активное вещество, такое как аллерген, антитела, такие как поликлональные антитела, моноклональные антитела, в том числе рекомбинантные антитела или фрагментированные антитела, предпочтительно аллерген и/или поликлональный антииммуноглобулин, такой как козлиная античеловеческая поликлональная сыворотка, поставляемая Ventrex Laboratories, Inc. , Portland, Maine, Catalog N 77660. В эталонном иммуноанализе антитело предпочтительно направлено против константной части класса измеряемых антител, т.е. антитело, направленно против IgE-антител.

Под биологической жидкостью подразумевают любую клиническую пробу, такую как кровь, плазма, сыворотка, моча или слюна, а также любую биологическую жидкость, которая выделяется, секретируется или транспортируется внутри организма. Под парамагнитными частицами (РМР) подразумевают частицы, которые могут быть диспергированы или суспендированы в жидкой среде. Во всех примерах используют частицы BioMag (частицы оксида железа, покрытые группами, имеющими на конце амин), продаваемые Magnetics Inc., Cambridge, Massachusets. Антитела, связанные с РМР, предпочтительно направлены против константной части детектируемых антител или измеряемых антител и могут быть поликлональными или моноклональными атнителами, в том числе рекомбинантными или фрагментированными антителами, предпочтительно моноклональным антителом, MAb A 5697-IA3(920325), поставляемым Biolnvent International AB, Lund, Sweden.

Хемилюминесцентным акридиновым соединением является предпочтительно N-гидроксисукцинимид-диметилакридиновый сложный эфир, ковалентно связанный с авидином или стрептавидином (авидин-DMAE). Авидин и DMAE соединяют по методам Weeks et al., Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983). В способе по изобретению могут быть применены другие несущие люминесцентную метку соединения, которые могут быть связаны с авидином или стрептавидином, например люминол, люцигенин или лофин.

Получение биотинилированных антител.

Биотинилированные анти-IgE и Phleum pratense

Козлиную античеловеческую поликлональную сыворотку (Ventrex Laboratories, Inc. MA, USA) очищают аффинной хроматографией на CNBr-активированной сеферозе 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden) с миеломными IgE (CEM Concepts, USA) в качестве лиганда. Анти-IgE биотинилируют с молярным отношением биотин: -анти-IgE = 41:1.

9 мкл Биотина (Биотин-амидокапроат-N-гидроксисукцинимид (эфир) (Sigma) 25 мг/мл в диметилформамиде (Merck) добавляют к 0,4 мл анти-IgE 4,5 мг/мл в 0,01 M NaHCO₃ (Merck). Реагенты инкубируют в "end over end" ("конец над концом") миксере в течение 2 часов при 25^oC. 0,9 мл Раствора лизина (Sigma) 20 мг/мл в NaHCO₃ добавляют. Раствор фильтруют и биотинилированное антитело очищают гель-фильтрацией на супердексе 75 Hiload 16/60 (Phasmacia, Uppsala, Sweden). Объединенные фракции разводят в содержащем буфер солевом растворе PBS, pH 7,2, содержащем 0,1% человеческий сывороточный альбумин (Sigma), 0,1% NaN₃ (Sigma).

Экстракт Phleum pratense (ALK Laboratories A/S, Hyrsholm, Demnark) биотинилируют в молярном отношении 10:1. 0,65 мл биотина 10 мг/мл добавляют к 0,43 мл 10 мг/мл Phleum pratense в 0,1 М NaHCO₃. Реагенты инкубируют в течение 2 часов при 25^oC в "end over end" миксере, после инкубирования добавляют раствор лизина (Sigma), 40 мкл, 50 мг/мл. Раствор фильтруют и биотинилированное антитело очищают от избытка биотина гельфильтрацией на супердексе 75 Hiload 16/60 (Pharmacia). Фракции, содержащие аллергены, объединяют. Биотинилированный Phleum pratense разводят PBS pH 7,2, содержащим 0,1% человеческий сывороточный альбумин (Sigma) и 0,1% NaN₃ (Sigma).

Получение метки, содержащей стрептавидин-акридиновый эфир

Стрептавидин конъюгировали в DMAE-NHS [2",6"-диметил-4-(N- сукцинимидилоксикарбонил)фенил-10-10-метилакридин-9-карбоксилат- метосульфат] при помощи способов Weeks, et. al., Clin. Chem. 29/8, 1474-1479 (1983).

Получение метки, содержащей стрептавидинакридиновый эфир.

0,96 мг N-Гидроксисукцинимид-диметилакридинового эфира DMAE (Ciba Corning Diagnostics Corp. Medfield. MA, USA) разводили в 1,92 мл диметилформамида, 250 мкл этого раствора пипеткой к 2,5 мл 1 мг/мл стрептавидина (Sigma) в 0,1 М первичном кислом фосфате натрия, 0,15 М NaCl pH 8,15.

Воздух над раствором во флаконе (пробирке) заменяли азотом (AGA). Реагенты инкубировали в течение 30 минут при 25^oC при перемешивании, после инкубирования добавляли 2250 мкл 10 мг/мл лизина, 0,1 М первичного кислого фосфата натрия (Merck), 0,15 М NaCl (Merck) pH 8,15. Для удаления несвязавшегося DMAE раствор наносили на колонку PD-10 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Элюат собирали и очищали ультрафильтрацией с применением целлюлозных Minitan-5 фильтров 10.000 NМWL (Millipore). Фильтрацию проводили с 1,5 л содержащего фосфатный буфер солевого раствора, PBS pH 7,2. Ретентат (удерживаемую часть) концентрировали до 25 мл и добавляли 25 мл PBS pH 7,2, содержащего 0,5% HSA (человеческий сывороточный альбумин, Sigma) и 0,1% NaN₃ (Sigma).

Изобретение будет детально описано в следующих примерах.

Иммобилизация антитела с парамагнитными частицами.

6,5 г Парамагнитных частиц (Ciba Corning Diagnostics Corp., MA, USA) промывают в 650 мл метанола (Merck) 3 раза с применением магнитного разделения. Промывание 650 мл 0,01 М ацетатного буфера pH 5,5 выполняют дважды. Частицы активируют в 6,25% глутаральдегиде (Merck), 0,01 М ацетатном буфере pH 5,5 в течение 3 часов при 25^oC. Частицы промывают 3 раза в 650 мл 0,01 М ацетатного буфера pH 5,5. Эти частицы соединяют с 1083 мг моноклонального анти-IgE антитела (ALK Laboratories, Horsholm, Denmark), специфического в отношении Fc домена IgE, в течение 24 часов при 25^oC. Частицы промывают дважды в 0,01 М ацетатном буфере pH 5,5. Блокирование избыточных активных групп выполняют при помощи 200 мл 10% освобожденной от IgE сыворотки (ALK Laboratories, Horsholm, Denmark) в течение 24 часов при 25^oC. Эти частицы промывают в 650 мл 0,01 М фосфатном буфере (Merck) с последующими 3 промывками в 650 мл IgM NaCl (Merck). Частицы промывают 3 раза в 0,01 М фосфатном буфере, ресуспендируют в 650 мл PBS pH 7,2, 0,1% (вес./об.) бычьем сывороточном альбумине (Sigma), 0,001% бычьем -глобулине (Sigma) и нагревают в течение 18 часов при 50^oC. Эти частицы промывают 3 раза в 650 мл PBS pH 7,2, 0,1% (вес/об. ) бычьем сывороточном альбумине (Sigma), 0,001% бычьем -альбумине (Sigma). Затем частицы нагревают в течение 7 дней при 37^oC. Частицы промывают в 0,01 М фосфатном буфере, разводят до 0,5 г/л в PBS pH 7,2, 0,5% человеческом сывороточном альбумине (Sigma).

Пример 1. Детектирование и количественное определение антигена (общего IgE).

Определение общих IgE антител согласно данному изобретению проводили на анализаторе Ciba Corning ACS:180 Benchtop Immunoassay analyzer, описанном в Clinical Chemistry, 36/9, 1598-1602 (1990), с применением следующего протокола.

50 мкл Пробы и 50 мкл биотинилированного анти-IgE заливают при помощи зонда (пробника) в кювету. Кювета доходит до первого реагентного зонда R1, где 100 мкл парамагнитных частиц с иммобилизованным моноклональным анти-IgE антителом (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark), специфическим против Fc домена IgE, сливают вместе с 200 мкл метки стрептавидин-акридиновый эфир (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark). Кювета движется далее по пути к магниту и промывной зоне. Дважды выполняют промывку 750 мкл деионизованной воды. После завершения промывного цикла частицы ресуспендируют в 300 мкл 0,5 г/л H₂O₂ в 0,1 М HNO₃. Далее кювета входит в камеру люменметра (прибора для измерения светового потока) и перед фотоумножителем в нее добавляют 300 мкл 25 мМ раствора NaOH и фотоны испускаемого света измеряют, определяют количество и выражают в виде относительных световых единиц (RLU). Количество RLU прямо пропорционально количеству IgE в пробе. Время от введения пробы до первого результата равно 15 минутам и следующий результат следует каждые 20 секунд. Результаты выражали в виде отношения эксперимента/RLU фона, где RLU фона представляет собой хемилюминесцентную реакцию, наблюдаемую в отсутствие общего IgE.

Девять стандартов общего IgE, калиброванных в Magic Lite Тotal IgE Kit (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark) против WHO 2nd IRP N 75/502 для IgE человеческой сыворотки, анализировали при помощи описанного выше протокола. Было показано, что можно было детектировать 0,1 ME/мл общего сывороточного IgE (как определено по фон х 10 стандартных отклонений), см. фиг. 2.

Пример 2. Детектирование и количественное определение специфического антитела (специфического IgE).

Определение специфических для Phleum pratense IgE антител (специфических для тимофеевки луговой IgE) в соответствии с изобретением проводили на анализаторе Ciba Corning ACS: 180 Benchtop Immunoassay analyzer, описанном в Clinical Chemistry, 36/9, 1598-1602 (1990), при помощи следующего протокола:

50 мкл Пробы и 50 мкл биотинилированного Phleum Pratense вводили в кювету при помощи зонда (пробника). Кювета доходит до первого реагентного зонда R1, где 100 мкл парамагнитных частиц с иммобилизованным моноклональным анти-IgE антителом (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark), специфическим против Fc домена IgE, вводят вместе с 200 мкл метки стрептавидин-акридиниевый эфир (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark). Кювета движется далее по пути к магниту и промывной зоне (станции). Дважды поводят промывку 750 мкл деионизованной воды. После завершения цикла промывки частицы ресуспендируют в 300 мкл 0,5 г/л H₂O₂ в 0,1 М HNO₃. Кювета входит в камеру люминметра и перед фотоумножителем в нее добавляют 300 мкл раствора 25 мМ NaOH и измеряют фотоны испускаемого света, определяют количественно и выражают в виде относительных световых единиц (RLU). Количество RLU прямо пропорционально количеству IgE в пробе. Время от введения пробы до первого результата равно 15 минутам и новый результат следует каждые 20 секунд. Результаты выражали в виде отношения RLU эксперимента/RLU фона, где RLU фона представлял собой хемилюминесцентную реакцию, наблюдаемую в отсутствии общего IgE.

Десять специфических для Phleum pratence стандартов IgE, калиброванных в Magic hite SQ specific IgE Kit (ALK Laboratories A/K, Horsholm, Denmark) против проб клинически охарактеризованных аллергических к Phleum pratense больных и выраженных в виде CE/мл (стандартизированных единиц), анализировали при помощи описанного выше протокола. Показано, что между 1,43 и 800 CE/мл специфического для Phleum pratense IgE можно измерить согласно Magic Lite SQ specific IgE анализу, см. фиг. 3.

Пример 3. Количественное определение специфического IgE по сравнению с WHO стандартном общего IgE.

Количественное определение специфических IgE антител в пробах сыворотки выполняли по отношению к общим IgE антителам или специфическому IgE антителу при помощи идентичных протоколов анализа, описанных в примерах 1 и 2 соответственно.

Пробы тридцати пяти больных анализировали на специфический для Phleum pratense IgE параллельно с 10 специфическими для Phleum pratense стандартами IgE, калиброванными в Magic Lite SQ specific IgE Kit (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark), против проб клинически охарактерированных аллергических к Pleum pratense больных и выраженных в виде CE/мл (протокол описан в примере 2).

Девять стандартов IgE WHO 2nd IRP N 75/502 (Национальная биологическая коллегия по стандартам) анализировали параллельно против общего IgE (протокол, описанный в примере 1).

Фиг. 4 дает сравнение двух кривых зависимости ответа от дозы анализа общего IgE и специфического для Phleum pratense IgE соответственно. Параллельный анализ не обнаружил значительного различия в наклонах между этими двумя кривыми зависимости ответной реакции от концентрации, указывая, что специфический IgE в пробах больных можно калибровать против WHO стандарта общего IgE и выражать в ME/мл.

Фиг. 5 дает сравнение результатов для проб из 35 больных, калиброванных против WHO стандартов общего IgE (выраженных в ME/мл) или специфических для Phleum pratense стандартов IgE (выраженных в CE/мл), и это сравнение показывает очень хорошую корреляцию между этими двумя единицами.

Концентрацию (дозу) неизвестной пробы рассчитывали при помощи некубической сплайн-интерполяции после преобразования log vs. log. сигнал/фон и концентрации (дозы) соответственно.

Из кривой линейной регрессии рассчитали, что одна стандартизованная единица (СЕ) соответствует 0,14 международным единицам (МЕ).

В заключении можно отметить, что аллерген-специфический IgE может быть измерен по изобретению и калиброван, исходя непосредственно из анализа общего IgE кривой калиброванных WHO стандартов IgE.

Пример 4. Сравнение способов для общего IgE.

Пробы тридцати трех больных анализировали на общий сывороточный IgE в Magic Lite Тotal IgE Kit (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark).

Анализ выполняли в соответствии с инструкцией изготовителя. Те же самые пробы измеряли на общий сывороточный IgE на ACS:180 в соответствии с протоколом, описанным в примере 1.

Фиг. 6 дает диаграмму разброса для сравнения способов измерения общего сывороточного IgE. Была обнаружена корреляция r = 0,90.

Пример 5. Сравнение способов для специфического IgE.

Пробы тридцати пяти больных измеряли на специфический для Phleum pratence IgE в Magic Lite SQ specific IgE Kit (ALK Laboratories A/S, Horsholm, Denmark).

Анализ проводили в соответствии с инструкцией изготовителя, те же самые пробы анализировали на специфический для Phleum pratense IgE на ACS:180 в соответствии с протоколом, описанным в примере 2.

Фиг. 7 дает диаграмму разброса для сравнения способов измерения специфического для Phleum pratense IgE. Была обнаружена корреляция с r = 0,80.

Пример 6. Сравнение точности анализов.

Неточность внутри одной серии измерений для ACS общего IgE с применением протокола, описанного в примере 1, сравнивали с таковой для Magic Lite Total IgE. Пробы больных измеряли в трех повторностях в тестах, описанных в примере 4. Объединенный коэффициент вариации внутри серии измерений (cvpwr) рассчитывали согласно Krouwer and Rabinowitz, Clinical Chemistry, 30, 290 (1984). Были получены следующие результаты (см. табл. 1 в конце описания).

Как видно из этих результатов, автоматизация и уменьшение числа стадий улучшает точность анализа (согласно F - тесту: F = 1,71, p = 0,049).

Пример 7. Сравнение содержания общего и специфического IgE в пробах больных.

Пробы, измеренные на специфический для Phleum pratense IgE на ACS:180 согласно протоколу, описанному в примере 2, и калиброванные по стандарту общего IgE (WHO 75/502), как описано в примере 3, анализировали также на общий IgE, как описано в примере 1. Отношение между измеренными специфическим IgE и общим IgE рассчитывали для каждой пробы и выражали в виде %-ного отношения (специф. МЕ/общий МЕ^* 100).

Были получены следующие результаты (см. табл. 2 в конце описания).

Как видно из этих результатов, анализ специфического для Phleum pratense IgE способен измерять даже такие малые количества, как 0,05%, специфического для Phleum pratense IgE в общем IgE. Относительно малые количества специфического для Phleum pratense IgE показывают, что в этих пробах присутствуют IgE, специфические для других аллергенов. Обнаружено, что в пробе одного больного до 44% общего IgE является специфическим против Phleum pratense. Не было обнаружено корреляции между концентрацией общего IgE и концентрацией IgE, специфического для Phleum pratense, как видно на фиг. 8.

Пример 8. Определение сывороточных общих IgA антител при помощи парамагнитных частиц и метки, состоящей из авидин-акридинового эфира. Определение общих IgA антител проводили с применением следующего протокола.

25 мкл Пробы больного или калибровочного стандарта пипетировали в 12 х 75 мм тест-пробирку. К каждой пробирке добавляли 50 мкл биотинилированного поликлонального анти-IgA антитела DAKO E484 (поставляемого DAKO, Glostrup Denmark) в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азид натрия, 0,01% Tween 20 и 0,1% человеческий сывороточный альбумин, и реакцию проводили 15 минут при температуре окружающей среды, 400 мкл суспензии парамагнитных частиц с иммобилизованным поликлональным анти-IgA антителом DAKO A 262 (поставляемой DAKO, Glostrup Denmark) добавляли к каждой пробирке и инкубировали в течение 5 минут. После этого второго инкубирования 50 мкл стрептавидин-акридиновый эфир содержащей метки, разведенной в том же буфере, который описан выше, добавляли к каждой пробирке и пробирки инкубировали еще 5 минут при температуре окружающей среды. Парамагнитные части промывали дважды 0,2 М фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,1% Tween 20, после отделения магнитных частиц от жидкости при помощи магнитного сепаратора и перемешивания отдельных частиц при помощи вортекса с промывным буфером, описанным выше. Содержимое пробирок измеряли в люменметре, где свет испускался при 426 нм, определяли количество и выражали в виде относительных световых единиц (RLU).

Стандарты общего IgA, калиброванные против WHO N 67/86 для человеческого сывороточного IgA DAKO X908 (поставляемого DAKO, Glostrup, Denmark), анализировали с применением описанного выше протокола.

Стандарты:

Концентрация (мкг/мл) - RLU

0 - 370937

0,02 - 417000

0,23 - 557563

2,32 - 1252260

23,2 - 1872357

Специалистам в данной области должно быть ясно, что возможны многочисленные вариация без отхода от сущности и объема данного изобретения, определенного исключительно прилагаемой формулой.